第九章外源基因在真核细胞中的表达
真核细胞常见的表达载体及真核细胞表达外源基因的调控(精)
真核细胞常见表达载体1. pCMVp-NEO-BAN载体特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。
更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。
注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。
2. pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。
亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1。
Excitation maximum = 488 nm; Emission maximum = 507图示为启动子分泌信号肽和多克隆位点区域：Ase1.pCMV…ccg cta gcg cta ccg gtc gcc acc atg- .EGFP…BamH1…SV40 poly A+Nhe1 Age13. pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
外源基因在真核细胞中的转录与翻译机制
外源基因在真核细胞中的转录与翻译机制外源基因指的是不同于自身天然基因的DNA序列，也称为异基因。
它们通常来自其他生物体或者人工合成。
将外源基因导入真核细胞中，可以用于基因治疗等生物学应用。
但是，外源基因在真核细胞中的转录与翻译机制是如何实现的呢？本文将从转录与翻译两个方面进行探讨。
一、外源基因的转录在真核细胞中，外源基因的转录需要利用细胞核内的RNA聚合酶Ⅱ及其辅助因子。
具体而言，首先，在外源基因导入真核细胞后，其中的DEAE（二乙氨基乙烷磺酰氯）结构可以与细胞核膜上的负电性磷脂结合，从而增加外源基因进入细胞核的概率。
其次，外源基因所带有的启动子因子通常与细胞内自身基因的启动子因子不同，因此，需要利用转录激活因子（transcriptional activator）来激活RNA聚合酶Ⅱ。
这些转录激活因子可以通过识别外源基因启动子上的绑定位点，与RNA聚合酶Ⅱ的载体克服反式构象的阻碍，使其启动并开始转录。
最后，转录过程中所合成的外源mRNA需要经过RNA后处理过程。
比如，转录的外源mRNA首先要剪切成正确的3’端与5’端，接着经过去除内含子、加上头部甲基等修饰，最终整合成成熟的mRNA。
这一过程让外源mRNA得以正常运作，供翻译酶读取序列信息。
二、外源基因的翻译外源基因的翻译与自身基因类似，需要使用细胞质内的翻译体系。
通常来说，外源蛋白的合成与自身蛋白合成的过程没什么不同，遵循着标准的mRNA翻译规则。
具体而言，首先，mRNA上的翻译起始密码子（AUG）被识别后，tRNA带着对应的氨基酸A（甲硫氨酰胺）进入到翻译终点—核糖体R（ribosome）上。
其次，核糖体R从mRNA的5’端不断向3’端移动，逐渐合成蛋白。
这一过程中，外源基因上的密码子和tRNA发生配对，tRNA合成链不断变长，新合成的肽链不断生长。
最后，当核糖体R到达mRNA终止密码子时，翻译过程终止，蛋白质合成结束。
需要注意的是，由于外源蛋白和自身蛋白在A、T、G、C序列的组合上并无区别，因此在翻译过程中往往会和自身蛋白一同被翻译和进入细胞质中。
实验九 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和降解物阻遏作用
实验九外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和降解物阻遏作用【实验目的】1.了解外源基因在原核细胞中表达的基础理论。
2.掌握乳糖操纵子的调节机制和操作方法。
【实验原理】1.外源基因在原核细胞中的表达蛋白质通常是研究的最终目标，因此蛋白质的表达在基因工程中占有非常重要的地位。
常用的表达系统有原核细胞和真核细胞。
原核细胞表达系统主要使用大肠杆菌，真核细胞表达系统主要有酵母细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞。
这些表达系统各有优缺点，应根据实验目的和实验室条件加以选择。
本实验主要介绍以大肠杆菌为代表的原核细胞表达系统。
（1）大肠杆菌表达系统的特点：生物学特性和遗传背景清楚，易于操作；已开发较多的克隆载体可供选择；容易获得大量的外源蛋白（外源蛋白可占细菌总蛋白50％左右）。
（2）蛋白质在原核细胞中的表达特点：原核细胞有其固有的RNA聚合酶，识别原核基因的启动子。
因此，在用原核细胞表达目的基因（无论是真核基因还是原核基因）时，一般应使用原核启动子。
原核基因的mRNA含有SD序列，启动蛋白质的合成。
而在真核基因上则缺乏该序列。
因此，一些商品化原核表达载体上设计有SD序列，以方便真核基因的表达。
原核细胞没有mRNA转录后加工的能力。
因此，在原核细胞中表达真核基因时，应使用cDNA 为目的基因。
原核细胞缺乏真核细胞对蛋白质进行翻译后加工的能力。
如表达产物的功能和蛋白质的糖基化、高级结构的正确折叠有关，必须慎重使用原核表达系统。
外源基因在大肠杆菌中高效表达时，表达产物往往在胞浆聚集，形成均一密度的包涵体。
包涵体的形成有利于保护表达产物不被胞内的蛋白酶降解，而且可以通过包涵体和胞内其他蛋白质密度不同来纯化包涵体蛋白。
但包涵体蛋白不具有该蛋白的所有生物学活性，往往需要通过变性复性的方法恢复活性，有时只能回复部分活性。
（3）蛋白质在原核细胞表达的调控启动子是转录水平调控的主要因素。
根据启动子起始mRNA合成效率的不同，可分为强、弱启动子，但是启动子的强弱是相对于不同基因而言的。
真核细胞表达外源基因步骤
真核细胞表达外源基因步骤.txt丶︶￣喜欢的歌，静静的听，喜欢的人，远远的看我笑了当初你不挺傲的吗现在您这是又玩哪出呢？真核细胞表达外源基因步骤点击： 538 作者：来源：时间： 2007-11-10 本站论坛在真核细胞中表达蛋白的步骤比大肠杆菌复杂得多。
首先要考虑选用什么载体。
一般人们趋向于使用分泌表达载体，以便于蛋白的纯化。
但有的蛋白并不适合于分泌表达，如一些胞质蛋白，非糖基化蛋白等。
此外分泌表达的蛋白信号肽存在一个效率问题。
有的蛋白即使存在信号肽，也不能分泌。
并且有的分泌蛋白较易受到蛋白酶的降解。
所有这些因素都需综合考虑。
1 克隆选用合适的内切酶把外源基因克隆于表达载体的多克隆位点。
如果选用的是分泌型表达载体，则外源基因的阅读框架和信号肽的阅读框架应该保持一致。
2 重组栽体线性化重组载体只有被酶切线性化整合效率才能大大提高，环状质粒整合效率是很低的。
选用不同的内切酶线性化可得到不同的转化子。
如对载体pPC19选用BgiⅡ线性化，转化后可得到Muts表型转化子；选用SaI或StuI线性化，转化后可得到Mut表型转化子。
3 转化目前对真核细胞的转化方法有多种，例如对于P.Pastoris的转化目前有4种方法：①锂盐法；②PEG法；③原生质球法；④电穿孔法。
锂盐法和PEG法方法简便，但效率很低，每微克DNA只有几十个转化子或更低，一般不多用。
原生质球法和电穿孔法转化率都较高，而且一般可得到高拷贝重组，其转化率都可达到105/μg。
但原生质球法操作繁琐费时；电穿孔法简便、快速、高效，是理想的转化方法。
选用上述四种方法中的一种转化。
一般选用原生质球或电击法。
4 筛选转化子可先在不含组氨酸的培养基上初筛。
复筛可用PCR进行。
即提取转化子DNA，用外源基因两侧特异引物扩增筛选。
然而，这只限于少量转化子转化子太多，则工作量太大。
对于大量转化子的筛选．可用原位点杂交进行。
即把相同量的不同转化子点在NC膜上，在原位对酵母细胞壁进行裂解，使之释放DNA。
6.目的基因的表达
IPTG
mRNA
Tac 表达系统
tac 启动子是由 trp 的 –35 序列和 lacUV5 的 –10 序列 拼接而成的杂合启动子。 拼接而成的杂合启动子。
启动子 P lac P trp P tac -35 区序列 TTTACA TTGACA TTGACA -10 区序列 TATAAT T TAA C T TATAAT
成一个操纵子 – 操纵子—原核生物转录单位
– 启动序列决定转录活性大小 – 操纵序列是阻遏蛋白的结合位点 • 负性调节 为主 • 正性调节 • 真核生物： 真核生物： • 顺式作用元件（cis-acting element）-顺式作用元件（ ） 指可影响自身基因表达活性的DNA序列。 自身基因表达活性的 序列。 指可影响自身基因表达活性的 序列 – 非编码序列 – 启动子 – 调控元件 位于远端调控区的顺式作用元 调控元件: 增强子,沉默子 件(增强子 沉默子 增强子 沉默子)
发热量低、需氧低、 发热量低、需氧低、适当的发酵温 度和细胞形态； 度和细胞形态； 容易进行代谢调控； 容易进行代谢调控； 容易进行DNA重组技术操作； 容易进行DNA重组技术操作； DNA重组技术操作 产物的产量、产率高， 产物的产量、产率高， 产物容易提取纯化。 产物容易提取纯化。
宿主细胞分为两大类： 宿主细胞分为两大类： 第一类为原核细胞： 第一类为原核细胞：常用有大肠杆 菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等； 枯草芽胞杆菌、链霉菌等； 第二类为真核细胞：常用有酵母、 第二类为真核细胞：常用有酵母、 丝状真菌、哺乳动物细胞等。 丝状真菌、哺乳动物细胞等。
Lac 表达系统 负调节因子 lac I 表达系统:
在无诱导物情形下， lacI 基因产物形成四聚体阻遏蛋白， 与启动子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。
外源基因在真核细胞中的表达
（1）新霉素磷酸转移酶（氨基葡萄糖苷磷酸转移酶， neomycin phosphotransferase Ⅱ, NptⅡ）
Npt Ⅱ 基因表达产生的酶可催化许多氨基葡萄糖苷类抗生 素（如新霉素，庆大霉素，卡那霉素和G-418）的O-磷酸化， 使抗生素失去对细胞的毒性，这是由于磷酸化的抗生素不能 与植物细胞叶绿体和线粒体中的核糖体30S亚基结合，进一步 影响70S起始复合体合成，干扰线粒体和叶绿体的蛋白质生物 合成，使植物细胞最终死亡，因此，与外源基因结合的Npt基 因转化细胞后，就可在含有抗生素的培养基上存活下来。
gfp基因是从维多利亚水母中分离纯化的一种可以发出绿
色荧光的物质。GFP为238个氨基酸的小蛋白，发色团能吸 收可见光而发射荧光，用荧光显微镜可检测到GFP产生的绿 色荧光。GFP检测不需要添加任何底物或辅助因子，不使用 同位素，不需要测定酶的活性等优点，且在原核和真核生 物中都能表达，表达产物对细胞无毒性。
外源基因在真核生物细胞中的表达，对于分
子生物学理论研究，对真核生物基因表达调控的
探讨提供了其他试验方法难以达到的有力手段。
外源基因如何才能转入真核细胞？又如何能
从数量庞大的细胞群体中筛选出遗传转化的细胞？
又是如何对转化的真核生物进行鉴定？
一、选择标记基因和报告基因：
1. 基因转化的选择标记
选择标记一般是一种基因，即选择标记基因，他在转化 前与待转化外源基因相连接，当把已转化和未转化的细胞 群体臵于加有选择剂的（抗生素）的培养基上进行培养时， 已转化的细胞群体或再生植株由于带有选择标记基因，该 基因的产物---酶能分解培养基中加入的选择剂，因此，转 化细胞对选择剂具有抵抗能力，不受选择剂毒害而正常地 生长，发育。相反未转化细胞或再生植株受培养基中选择 剂的毒害，而不能存活下来而被淘汰。
真核表达质粒的构建与表达
真核表达质粒的构建与表达1. 真核表达质粒的构建真核表达质粒是一种含有真核基因的质粒，它可以用于在真核细胞中表达外源基因。
真核表达质粒的构建主要包括以下步骤：（1）选择表达载体：首先，需要选择一种合适的表达载体，例如质粒、质杆菌、噬菌体等，以及一种合适的表达系统，例如T7系统、T3系统、SP6系统等。
（2）构建表达质粒：其次，通过合成或克隆技术将外源基因插入到表达载体中，构建表达质粒。
（3）筛选表达质粒：最后，通过PCR、Southern blotting等技术筛选出含有外源基因的表达质粒。
2. 真核表达质粒的表达真核表达质粒的表达是一种细胞内的转录和翻译过程，它可以将外源基因插入真核细胞中，从而实现基因的表达。
表达质粒的表达通常由以下几个步骤组成：首先，将外源基因与表达质粒的启动子序列结合，以形成表达质粒；其次，将表达质粒转染到真核细胞中，以便在细胞中表达外源基因；最后，真核细胞将表达质粒中的基因转录成mRNA，然后翻译成蛋白质，从而实现基因的表达。
此外，表达质粒的表达过程还可以通过调节启动子序列的表达水平来调控基因的表达。
真核表达质粒的稳定性是指质粒在不同的环境条件下，表达量不受外界环境变化的影响，能够保持恒定的表达量。
稳定性的提高可以改善表达质粒的性能，并且能够更好地满足实验要求。
为了提高真核表达质粒的稳定性，一般采用以下几种方法：一是优化质粒的结构特征。
质粒结构特征包括质粒的大小、碱基组成、表达载体的类型等。
优化质粒的结构特征可以有效提高质粒的稳定性，从而改善质粒的性能。
二是改变质粒的表达系统。
质粒的表达系统包括表达调控因子、载体、表达调控序列等。
改变表达系统可以改变质粒的表达量，从而提高质粒的稳定性。
三是改变质粒的表达条件。
质粒的表达条件包括培养基、温度、pH值、溶液浓度等。
改变质粒的表达条件可以改变表达量，从而提高质粒的稳定性。
四是改变质粒的表达调控序列。
表达调控序列是控制质粒表达的关键因素，改变表达调控序列可以改变质粒的表达量，从而提高质粒的稳定性。
植物生物技术：第九章 植物遗传转化载体
农杆菌可分为根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciems（含Ti质粒 ）和发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes （含Ri质粒） ，在植
物基因工程中以根瘤农杆菌的Ti质粒介导的遗传转化最多。
35
病毒载体感染植物细胞以后只是利用寄主细胞的功能在细胞质进 行复制和表达；同时又由于病毒具有高效自我复制能力，故在转 化植物中可得到高拷贝外源基因，从而十分有利于外源基因的表 达和功能的实现
10
Ti质粒结构
毒性区（vir区）：激活T－DNA的转移
T－DNA区： 侵染植物时，从Ti质粒上 被切割，转移到植物细胞中，带有与 肿瘤形成有关的基因
接合转移区：存在与细菌间进行接合有 关的基因
复制起始区：保证Ti质粒进行自我复制
T-DNA 区
Cytokinin
Auxin
Opine
左边界
右边界
Ti 质粒
第九章 植物遗传转化载体
1
第9章 植物遗传转化载体
本章主要内容
• 第一节 植物遗传转化载体的种类及特点 • 第二节 农杆菌质粒系统的结构、功能和构建 • 第三节 植物病毒载体 • 第四节 叶绿体转化载体 • 第五节 遗传转化常用的选择标记基因及及无选择标记基因转化系统
2
第9章 植物遗传转化载体
本章教学目的与要求
含子、信号肽等）连接在一起构成基因。
22
启动子
Ti质粒
Nos（胭脂碱合成酶基因）、Ocs（章鱼碱合成酶基因）等
基因具有与真核生物启动子类似的TATA盒和CAAT盒，均能在植 物细胞中表达，并且无组织特异性。因此，它们成为早期构建 嵌合基因的启动子。
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一、选择标记和报告基因 二、DNA 直接导入的基因转化方法 三、农杆菌作载体的植物转基因方法 四、外源基因转化在基因表达调控研究中的应用 五、反义RNA及其在基因表达调控中的作用 六、 RNA干扰
一、选择标记和报告基因
真核生物细胞中的选择标记
在将外源目的基因转化真核细胞时，必须分辨 出哪些细胞被转化了，哪些细胞没有被转化。将一 个选择标记与外源目的基因连接，被转化的细胞就 带有选择标记。选择标记常用抗生素抗性基因，真 核生物细胞所用的抗生素与原核细胞有所不同。
聚乙二醇诱导基因转化
受体细胞处于M期最好，因此时无核膜， 能提高转化率。加入运载体DNA也能够促进转 化，运载体DNA常用小牛胸腺DNA或鲑鱼精子 DNA，要求剪切成5～13kb大小。剪切可用注射 器来回吸注DNA溶液几次，然后通过电泳检测 剪切效果。
高压电穿孔法
在电击时加入PEG和运载体DNA可提高 转化率。 高电压短时间举例：5 KV 180μS 低电压长时间举例：300V 10~20min
花粉管通道法
将外源DNA与花粉混合涂于已去雄的柱头上， 使之沿花粉管通道或传递组织通过珠心进入胚囊， 转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子及早期的胚 胎细胞。由于这一方法技术简单，一般育种工作 者易于掌握，故有一定的价值和应用前景。
利用载体导入外源DNA
1 植物病毒载体感染植物细胞法 2 农杆菌介导的 Ti 质粒载体转化植物细胞法 3 动物病毒载体感染动物细胞法
绿色荧光蛋白
The Nobel Prize in Chemistry 2008
“for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFP”
Osamu Shimomura
Martin Chalfie
Roger Y. Tsien 钱永健
二、DNA直接导入的
基因转化方法
1 聚乙二醇法 2 高压电穿孔法 3 显微注射法 4 基因枪法 5磷酸钙共沉淀法
6 脂质体介导法 7 激光微束穿孔法 8 超声波介导法 9 DEAE-葡聚糖法 10 原生质体融合法
聚乙二醇诱导基因转化
外源DNA加聚乙二醇（polyethylene glycol， PEG）和二价阳离子（如Mg2+、Ca2+、Mn2+）可 在原生质体表面形成沉淀颗粒，通过原生质体的 内吞作用导入细胞。用多聚赖氨酸或多聚鸟氨酸 代替PEG也行，二价阳离子常用CaCl2或MgCl2。 植物细胞必须除去细胞壁，可用纤维素酶降解细 胞壁，在等渗溶液中分离得到原生质体。
β-葡糖醛酸糖苷酶基因
β-葡糖醛酸糖苷酶（β-glucuronidase，GUS） 是目 前 应用 最 广泛 的 报告 基 因之 一 。它 以x-gluc （5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡糖醛酸）为底物，催化产 生蓝色的5,5’-二溴-4,4’-二氯靛蓝沉淀，可用来观察 转化基因的组织化学定位。还可以4-MUG（4-甲基 伞形酮葡糖苷酸）为底物，催化产生4-甲基伞形酮， 产物用荧光分光光度计测定，此法可测定基因表达 的强度。
冠瘿碱的检测方法
精氨酸、胭脂碱、章鱼碱三种物质的电泳迁移 率不同，精氨酸的最大，章鱼碱和胭脂碱的接近， 电泳1小时以上可将二者分开，章鱼碱的迁移率略 大于胭脂碱。
有时因细胞内缺乏冠瘿碱合成的底物，导致假 阴性结果。可在提取液中加入精氨酸，保温一段时 间后再检测冠瘿碱。
报告基因之五
绿色荧光蛋白基因
选择标记之一
二氢叶酸还原酶基因
二 氢 叶 酸 还 原 酶 （ dihydrofolate reductase, DHFR）对于真核细胞核苷酸（胸腺嘧啶）的合 成是必需的。对营养缺陷型dhfr－ 细胞来说，二 氢叶酸还原酶基因可用作选择标记，在缺少胸腺 嘧啶和次黄嘌呤的选择培养基中筛选出转化了的 细胞。
脂质体载体法
脂质体（liposome）是由人工构建的磷脂双分 子层组成的小球，DNA包裹在脂质体中，通过融合 或吞噬作用被细胞吸收。转化脂（lipofectin）主要 是由具有强正电荷的N-[1-(2,3-二油酰)丙酰] N,N,N三甲氨盐酸盐（ DOTMA ）和二油酰磷脂酰乙醇胺 （ DOPE ） 组 成 的 小 单 层 脂 质 体 SUV 。 借 助 于 DOTMA的强正电荷，可以与带负电荷的DNA分子 自发地结合，只要把转化脂与DNA简单地混合，即 可形成转化脂与DNA的复合物，把DNA包埋在脂质 体内，并可有效地转化动植物细胞。这种转化脂已 有商品出售。
选择标记之三
新霉素磷酸转移酶基因
新 霉 素 磷 酸 转 移 酶 基 因 （ neomycin phosphotransferase Ⅱgene, nptⅡ）是一个来源于转座子Tn5 编码的分子量为25KD的酶，它催化许多氨基糖苷类 抗生素（如新霉素、庆大霉素、卡那霉素、G-418） 的磷酸化反应，将ATP上的γ磷酸基团转移到抗生素 分子上，阻止了它们与靶位点——核糖体的相互作 用，从而使这些抗生素失去对细胞的毒性。这类抗 生素的毒理作用是与叶绿体及线粒体核糖体的30S亚 基结合，阻止70S核糖体形成。
报告基因之二
氯霉素乙酰基转移酶基因
CAT也能用作报告基因。用14C标记的氯 霉素、乙酰CoA与细胞、组织提取物反应，薄 层层析法分离反应产物，放射自显影可测得 CAT活性。
氯霉素的结构式
2,2-二氯-N-(1R,2R)-1,3二羟基-1-(4硝基苯基) 丙-2-基乙酰胺
氯霉素催化的反应及检测方法
选择标记之一
二氢叶酸还原酶基因
氨甲喋呤（methotrexate, MTX）和三甲氧 苄二氨嘧啶（trimethoprim）是二氢叶酸类似物， 是二氢叶酸还原酶的竞争性抑制剂，当培养基中 含有MTX时，二氢叶酸不能转变成四氢叶酸而生 长受到抑制。有一种突变的DHFR，它不受MTX 的抑制，以它作选择标记，转化的细胞可在含 MTX的培养基上生长。
绿 色 荧 光 蛋 白 （ green fluorescent protein ，
GFP）基因取自维多利亚水母Aequorea victoria，广
泛应用于细菌、酵母、动物和植物中。GFP在受到 395nm紫外光或490nm蓝光照射时，会发出509nm 的绿色荧光。因为GFP不是酶，检测时不需要加底 物，且没有毒性，所以可以用于活体检测。
选择标记之四
潮霉素磷酸转移酶基因
潮霉素磷酸转移酶（hygromycin phosphotransferase，HPT）可使潮霉素B磷酸化而失去 毒性。潮霉素B可抑制核糖体的功能，使细胞 不能合成蛋白质，因此对大多数植物和动物细 胞均有毒性。
选择标记之五
氯霉素乙酰转移酶基因
氯霉素能抑制真核细胞线粒体中的蛋白 质合成，而氯霉素乙酰转移酶 （chloramphenicol acetyltransferase，CAT） 能使氯霉素乙酰化，从而失去毒性。
报告基因之三
荧光素酶基因
荧光素酶（luciferase，LUX）基因取自荧 火虫或发光细菌，在ATP和Mg2+存在下，催化 荧光素氧化发光。可用发光光度计测定。
报告基因之四
冠瘿碱合成酶基因
冠瘿碱合成酶是农杆菌Ti质粒上T-DNA区编码的 一类与冠瘿碱（如章鱼碱、胭脂碱、农杆碱、农瘿碱、 琥珀碱、甘露碱）合成有关的酶。从转化的细胞中提 取冠瘿碱，纸上电泳后用菲醌染色，紫外光下检测黄 色荧光，根据冠瘿碱的有无和多少，可知冠瘿碱合成 酶的表达情况。
用硅胶G薄层层析可以分离和分析乙酰化的PPT，
从而测定PPT乙酰转移酶的活性，所以pat基因也可
以当作报告基因。
报告基因
报告基因（reporter gene）可用于研究基 因调控和转化基因的表达情况。报告基因一般 是一种酶的基因，对报告基因的要求是在受体 细胞中没有其产物，产物容易检测。
报告基因之一
GFP的性质
GFP是由238个氨基酸残基组成的单体蛋白，分 子量为26,888Da，其产生荧光的发色团是由Ser65， 脱氢Tyr66，Gly67自身环化及氧化形成，形成时需 要氧，不需要酶催化。野生型GFP发射的荧光强度 较弱，人们通过突变来提高GFP的荧光强度，有实 验表明，当GFP S65T 的Ser65突变为Thr时，在转化 的BOSC23细胞中荧光强度比野生型增强18倍。
高压放电
基因枪工作原理图
点火装置
火药子弹 电极 水滴
塑料子弹 载片
微粒
档板 靶组织
火药爆炸
磷酸钙沉淀法
将外源DNA与CaCl2混合制成CaCl2-DNA溶液， 逐滴加入到不断搅拌的HEPES-磷酸钙溶液中，形 成DNA－磷酸钙共沉淀复合物。然后用吸管将沉 淀复合物加到培养的哺乳动物单层细胞表面，细 胞可将复合物吸收到细胞内，保温几小时后，用 新鲜培养液洗净细胞，再用新鲜培养液继续培养， 直至外源基因高水平表达。转化率在10%左右。
下村修1962年在北美西海岸的水母中首次发现了一种在紫外线下发出 绿色荧光的蛋白质，即绿色荧光蛋白。随后，马丁•沙尔菲在利用绿色荧光 蛋白做生物示踪分子方面做出了贡献；钱永健让科学界更全面地理解绿色 荧光蛋白的发光机理，他还拓展了绿色以外的其他颜色荧光蛋白，为同时 追踪多种生物细胞变化的研究奠定了基础。
激光微束穿孔法
一定波长的激光束经聚焦后到达细胞表面时 其直径大约只有0.5～0.7μ m，这种直径很小但能 量很高的激光微束可引起膜的可逆性穿孔。具体 做法是：在荧光显微镜下找到适当的细胞，然后 用激光光源代替荧光光源，聚焦后发出激光微束 脉冲，细胞壁被击穿，DNA分子随之进入细胞。 由于激光孔径小，为线粒体、叶绿体的遗传工程 以及细胞质遗传的研究提供了方便的手段。
显微注射法
显微注射法（microinjection）采用显微操 作系统、毛细管注射。常用于动物受精卵细胞 的转化，也可用于植物原生质体的转化。此法 的关键是受体细胞的固定，受体细胞常被固定 在微吸管上，或固定在琼脂中。