引物设计实验课 ppt课件
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Infusion技术 ppt课件
组分
5X In-Fusion HD Enzyme Premix pUC19 Control Vector, linearized (50 ng / μl) 2 kb Control Insert (40 ng / μl)
26
7/27/2020
•
附带Cloning Enhancer的相关产品
In-Fusion® HD Cloning Kit w/ Cloning Enhancer (639633/34/35)
•必须进行限制性内切酶酶切和连接 •需要独一无二、兼容的酶切位点 •极少的合适酶切位点
•亚克隆繁琐 •多片段不能同时克隆
•对于大片段克隆效率较低 •对于插入片段有限制
•非定向克隆需要筛选目的片段插入方向 正确的克隆
•会附加多余碱基序列
•不适合中型和大规模克隆工程
In-Fusion解决方案
只要载体末端和插入片段末端具有15个同源碱基， In-Fusion就可以将任意PCR片段插入任意线性化载 体中。
8
July 27, 2020
•
In-Fusion®克隆技术的优点
1 简便、快速、高效的克隆技术 2 不附加任何多余序列 3 不受限制性内切酶酶切位点的限制 4 可同时克隆两个或多个DNA片段
9
7/27/2020
•
简便、快速、高效的克隆技术
10
7/27/2020
•
简便、快速、高效的克隆技术
In-Fusion HD无论是克隆长基因片段还是克 隆多个基因片段都能保持较高的克隆效率。
【方法】使用TaKaRa高品质PCR酶分别扩增1 kb、2 kb、3 kb的目的DNA片段 和2.7 kb的载体，并将扩增产物混合，使用In-Fusion® HD试剂盒完成 克隆。利用高效率的感受态细胞StellarTM Competent Cells（产品编 号：636763）转化并进行蓝/白斑筛选。
5X In-Fusion HD Enzyme Premix pUC19 Control Vector, linearized (50 ng / μl) 2 kb Control Insert (40 ng / μl)
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7/27/2020
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附带Cloning Enhancer的相关产品
In-Fusion® HD Cloning Kit w/ Cloning Enhancer (639633/34/35)
•必须进行限制性内切酶酶切和连接 •需要独一无二、兼容的酶切位点 •极少的合适酶切位点
•亚克隆繁琐 •多片段不能同时克隆
•对于大片段克隆效率较低 •对于插入片段有限制
•非定向克隆需要筛选目的片段插入方向 正确的克隆
•会附加多余碱基序列
•不适合中型和大规模克隆工程
In-Fusion解决方案
只要载体末端和插入片段末端具有15个同源碱基， In-Fusion就可以将任意PCR片段插入任意线性化载 体中。
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July 27, 2020
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In-Fusion®克隆技术的优点
1 简便、快速、高效的克隆技术 2 不附加任何多余序列 3 不受限制性内切酶酶切位点的限制 4 可同时克隆两个或多个DNA片段
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7/27/2020
•
简便、快速、高效的克隆技术
10
7/27/2020
•
简便、快速、高效的克隆技术
In-Fusion HD无论是克隆长基因片段还是克 隆多个基因片段都能保持较高的克隆效率。
【方法】使用TaKaRa高品质PCR酶分别扩增1 kb、2 kb、3 kb的目的DNA片段 和2.7 kb的载体，并将扩增产物混合，使用In-Fusion® HD试剂盒完成 克隆。利用高效率的感受态细胞StellarTM Competent Cells（产品编 号：636763）转化并进行蓝/白斑筛选。
引物设计ppt
PCR引物设计
辅助软件：DNASIS
•回顾PCR原理
PCR的六大要素
• • • • • • 引物 DNA聚合酶 dNTPs 模板 缓冲液 Mg2+
DNA的表示方法
DNA有方向性，5’-------3‘ 大肠杆菌基因组大小：460万碱基对(bp)
基因的表示方法
• CDS:complement(4189888..4190658)‘板书 • CDS: (4189888..4190658)
原则4
预测引物自身的二级结构，3‘末端必须游离
在DNA聚合酶和dNTP存在的情况下，引物以自身为模 板，沿着3‘末端延伸
允许
允许
原则5
正反向引物之间不能互补配对
正向引物与正向引物也不能互补配对
反向引物与反向引物也不能互补配对
如何检查正反向互补配对
• 取正向引物的3’末端的四个碱基，反向互补 后，在正反向引物中查找 • 若查找得到说明有互补配对的情况存在， 引物要重新设计(删减或增加3’碱基数量）
基因是有方向性的，有时在这条链上，而有时在反向互补链上
起始密码子atg,编码甲硫氨酸
终止密码子：taa,tag,tga,不编码氨基酸
引物设计软件介绍
• DNASIS的功能：
• • • • 1.获得反向互补序列 2.搜索限制性内切酶位点 3.翻译情况 4.预测二级结构
• 引物：
• 要扩增模板DNA，首先要设计两条寡核 苷酸引物,实际上就是两段与待扩增靶DNA 序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离 决定扩增片段的长度，两引物的5’端决定扩 增产物的两个5’末端位置。由于引物是决定 PCR扩增片段长度、位置和结果的关键， 因此，引物设计也就更为重要。
Tm值的计算
辅助软件：DNASIS
•回顾PCR原理
PCR的六大要素
• • • • • • 引物 DNA聚合酶 dNTPs 模板 缓冲液 Mg2+
DNA的表示方法
DNA有方向性，5’-------3‘ 大肠杆菌基因组大小：460万碱基对(bp)
基因的表示方法
• CDS:complement(4189888..4190658)‘板书 • CDS: (4189888..4190658)
原则4
预测引物自身的二级结构，3‘末端必须游离
在DNA聚合酶和dNTP存在的情况下，引物以自身为模 板，沿着3‘末端延伸
允许
允许
原则5
正反向引物之间不能互补配对
正向引物与正向引物也不能互补配对
反向引物与反向引物也不能互补配对
如何检查正反向互补配对
• 取正向引物的3’末端的四个碱基，反向互补 后，在正反向引物中查找 • 若查找得到说明有互补配对的情况存在， 引物要重新设计(删减或增加3’碱基数量）
基因是有方向性的，有时在这条链上，而有时在反向互补链上
起始密码子atg,编码甲硫氨酸
终止密码子：taa,tag,tga,不编码氨基酸
引物设计软件介绍
• DNASIS的功能：
• • • • 1.获得反向互补序列 2.搜索限制性内切酶位点 3.翻译情况 4.预测二级结构
• 引物：
• 要扩增模板DNA，首先要设计两条寡核 苷酸引物,实际上就是两段与待扩增靶DNA 序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离 决定扩增片段的长度，两引物的5’端决定扩 增产物的两个5’末端位置。由于引物是决定 PCR扩增片段长度、位置和结果的关键， 因此，引物设计也就更为重要。
Tm值的计算
多重PCR技术 ppt课件
域 ❖ 转基因检测则选择转入的动植物基因座 ❖ 性别鉴定一般挑选X或Y性染色体上特有的基因座
课件
8
❖ 第二、引物的设计（关键步骤） ❖ 1、引物位置的确定：首先需要知道所选择的基因
引物位点的详细DNA序列信息。 ❖ 引物的DNA序列应该有很强的特异性，否则引物会
结合在其他位点上发生非特异性扩增。 ❖ 2、引物序列的测定：引物的设计是多重PCR成功
4
一、多重PCR技术原理
❖ PCR是什么：聚合酶链式反应。是一种体外快速扩增特定基 因或DNA片段的分子生物学技术。
❖ 其基本原理是：以一对寡核苷酸为引物，在模板DNA、
dNTP(脱氧核苷三磷酸) 、适当缓冲液Mg2+的混合体系中，
在DNA聚合酶的催化下，根据碱基互补配对原则，对引物所 界定的DNA片段进行扩增。这种扩增通过模板DNA与引物之 间的变性、退火和延伸三个步骤为一循环，每次循环产生的 DNA片段作为下次 循环的模板，所以PCR扩增产物呈指数 增加。多重PCR是在传统PCR原理的基础上进行改进，即在 同一体系中加入多对特异性引物，对多个DNA模板或同一模 板的不同区域扩增出多个目的DNA片段。
❖ 2、在使用相同的PCR程序和反应条件的单个 PCR中对每对引物的量进行优化，以达到最 大的扩增效率；
❖ 3、平衡多重PCR中每对引物的量，使之对每 个靶点都能获得足够的扩增量。
课件
14
2、引物设计（关键优化）
❖ 多重PCR中的每对引物必须满足单引物PCR体系的 引物设计原则。这些原则包括：引物与模板的序列 紧密互补，长度一般为15—30bp，GC含量一般为 40—60％；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体 或发夹结构；引物不能在模板的非目的位点引发 DNA聚合反应(即错配)。由于多重PCR体系中同时 存在多对引物，在引物设计时还应注意：各引物对 必须保持高度的特异性，避免非特异扩增；尽可能 避免所有引物间的相互作用，各引物对应保持相对 一致的扩增效率，且不同引物对扩增出来的产物能 通过电泳或其他方法区分开。
课件
8
❖ 第二、引物的设计（关键步骤） ❖ 1、引物位置的确定：首先需要知道所选择的基因
引物位点的详细DNA序列信息。 ❖ 引物的DNA序列应该有很强的特异性，否则引物会
结合在其他位点上发生非特异性扩增。 ❖ 2、引物序列的测定：引物的设计是多重PCR成功
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一、多重PCR技术原理
❖ PCR是什么：聚合酶链式反应。是一种体外快速扩增特定基 因或DNA片段的分子生物学技术。
❖ 其基本原理是：以一对寡核苷酸为引物，在模板DNA、
dNTP(脱氧核苷三磷酸) 、适当缓冲液Mg2+的混合体系中，
在DNA聚合酶的催化下，根据碱基互补配对原则，对引物所 界定的DNA片段进行扩增。这种扩增通过模板DNA与引物之 间的变性、退火和延伸三个步骤为一循环，每次循环产生的 DNA片段作为下次 循环的模板，所以PCR扩增产物呈指数 增加。多重PCR是在传统PCR原理的基础上进行改进，即在 同一体系中加入多对特异性引物，对多个DNA模板或同一模 板的不同区域扩增出多个目的DNA片段。
❖ 2、在使用相同的PCR程序和反应条件的单个 PCR中对每对引物的量进行优化，以达到最 大的扩增效率；
❖ 3、平衡多重PCR中每对引物的量，使之对每 个靶点都能获得足够的扩增量。
课件
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2、引物设计（关键优化）
❖ 多重PCR中的每对引物必须满足单引物PCR体系的 引物设计原则。这些原则包括：引物与模板的序列 紧密互补，长度一般为15—30bp，GC含量一般为 40—60％；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体 或发夹结构；引物不能在模板的非目的位点引发 DNA聚合反应(即错配)。由于多重PCR体系中同时 存在多对引物，在引物设计时还应注意：各引物对 必须保持高度的特异性，避免非特异扩增；尽可能 避免所有引物间的相互作用，各引物对应保持相对 一致的扩增效率，且不同引物对扩增出来的产物能 通过电泳或其他方法区分开。
PCR引物设计
32
引物设计要点
∆G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了引物与模 板结合的强弱程度，也是一个重要的引物评价指标，一般情况 下，在Oligo 5.0软件的ΔG值窗口中，引物的ΔG值最好呈正 弦曲线形状，即5’端和中间部分ΔG值较高，而3’端ΔG值相 对较低，且不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对值），如此 则有利于正确引发反应而可防止错误引发。分析其原理，引物 与模板应具有较高的结合能量，这样有利于引物与模板序列的 整合，因此5’端与中间段的ΔG值应较高，而3’端ΔG值影响 DNA聚合酶对模板DNA的解链，过高则不利于这一步骤。
2020/8/13 广西医学科学实验中心xy
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9
序列综合分析
Vector NTI Suite 8.0 Omiga 2.0 DS gene DNASIS for Windows 2.5 DNATools 5.1 Bioedit DNAMAN
10
蛋白分析软件
蛋白二级结构分析： ANTHEPROT 4.5 、 Peptool、 VHMPT （Viewer and editor for Helical Membrane Protein Topologies）、 MACAW (Multiple Alignment Construction & Analysis Workbench, MACAW) 三维结构显示：RasMol、Cn3D、CHIME 2.6 IE、 POV-Ray 3.5
引物设计要点
∆G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了引物与模 板结合的强弱程度，也是一个重要的引物评价指标，一般情况 下，在Oligo 5.0软件的ΔG值窗口中，引物的ΔG值最好呈正 弦曲线形状，即5’端和中间部分ΔG值较高，而3’端ΔG值相 对较低，且不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对值），如此 则有利于正确引发反应而可防止错误引发。分析其原理，引物 与模板应具有较高的结合能量，这样有利于引物与模板序列的 整合，因此5’端与中间段的ΔG值应较高，而3’端ΔG值影响 DNA聚合酶对模板DNA的解链，过高则不利于这一步骤。
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序列综合分析
Vector NTI Suite 8.0 Omiga 2.0 DS gene DNASIS for Windows 2.5 DNATools 5.1 Bioedit DNAMAN
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蛋白分析软件
蛋白二级结构分析： ANTHEPROT 4.5 、 Peptool、 VHMPT （Viewer and editor for Helical Membrane Protein Topologies）、 MACAW (Multiple Alignment Construction & Analysis Workbench, MACAW) 三维结构显示：RasMol、Cn3D、CHIME 2.6 IE、 POV-Ray 3.5
《PCR引物设计》课件
04
pcr引物的应用与案例分 析
pcr引物在基因克隆中的应用
01
pcr引物用于基因克隆的目的是为了获得目的基因的序列信息， 进而进行后续的基因功能和表达研究。
02
设计特异性引物，通过pcr技术，从基因或基因组中筛选出目的基因。
引物设计需考虑基因序列的特异性、扩增效率和避免非特异性
03
扩增等因素。
引物特异性优化
避免引物间的互补
引物之间不应存在互补序列，以避免形成引物二聚体或发夹 结构。
避免引物与模板扩增 和产物。
引物扩增效率的优化
引物与模板的匹配度
引物的3'端应与模板完全匹配，以提 高引物的扩增效率。
引物之间的匹配度
两个引物之间应有良好的匹配度，以 保证PCR反应的顺利进行。
引导合成
引物作为合成子链的起点，通过与 DNA聚合酶的结合，引导合成与 模板互补的DNA链。
决定产物长度
引物的设计决定了PCR产物的长度 ，通过选择合适的引物，可以控制 产物的大小和特异性。
pcr引物设计的基本原则
特异性
长度和序列
引物应与模板DNA具有高度的特异性，避 免与其他非目标DNA序列发生非特异性结 合。
pcr引物的未来发展方向与挑战
引物设计的自动化
随着生物信息学的发展，未来引物设计 可能更加自动化，减少人工干预和误差
。
标准化和质量控制
建立引物设计的标准化流程，加强引 物设计的质量控制，确保实验结果的
可靠性和可重复性。
新型引物设计策略
针对特定需求，开发新型引物设计策 略，提高PCR反应的特异性和灵敏度 。
引物灵敏度测试
03
测试引物在不同模板浓度下的扩增效率，选择灵敏度较高的引
《引物设计教程》课件
退火温度调整
适当提高退火温度有助于减少引物二 聚体的形成，因为较高的温度下二聚 体形成的概率降低。
引物特异性不高的解决策略
引物特异性验证
在引物设计完成后，应通过实验验证其特异性，确保引物只对目标序列有反应。
避免引物间的交叉反应
在设计引物时，应确保引物之间不存在交叉反应，避免与非目标序列的结合。
引物3’端的选择
Primer Premier
一款功能强大的引物设计软件，支持 多种PCR方法，可进行多参数搜索和 灵活的筛选功能。
Oligo
提供多种类型的寡核苷酸合成和设计 功能，包括引物、探针、适配体等。
GeneFisher
适用于已知序列的基因片段设计通用 引物。
BatchPrimer3
在线引物设计软件，支持多参数搜索 和灵活筛选功能。
02
引物设计的步骤
确定目标基因序列
目标基因序列的来源
可以是基因组、转录组、cDNA等。
目标基因序列的选择标准
选择基因序列时应考虑其功能、表达水平、变异程度等因素。
目标基因序列的获取方法
可以通过基因数据库、文献报道、实验测序等方法获得。
选择合适的引物序列
引物序列的设计原则
引物序列应具有特异性，避免与基因组其他序列发生非特 异性结合；长度一般在18-30bp之间；GC含量应适中， 一般在40%-60%之间。
引物长度一般在15～30碱基之间，过短可 能降低引物特异性，过长则可能导致引物 结合温度升高，不利于引物的特异性。
碱基分布均匀原则
避免二级结构原则
引物序列中的G+C含量在40%～60%之间 ，避免出现连续的4个以上的G或C。
引物自身及引物之间不能形成互补性二聚 体或发夹结构等二级结构。
适当提高退火温度有助于减少引物二 聚体的形成，因为较高的温度下二聚 体形成的概率降低。
引物特异性不高的解决策略
引物特异性验证
在引物设计完成后，应通过实验验证其特异性，确保引物只对目标序列有反应。
避免引物间的交叉反应
在设计引物时，应确保引物之间不存在交叉反应，避免与非目标序列的结合。
引物3’端的选择
Primer Premier
一款功能强大的引物设计软件，支持 多种PCR方法，可进行多参数搜索和 灵活的筛选功能。
Oligo
提供多种类型的寡核苷酸合成和设计 功能，包括引物、探针、适配体等。
GeneFisher
适用于已知序列的基因片段设计通用 引物。
BatchPrimer3
在线引物设计软件，支持多参数搜索 和灵活筛选功能。
02
引物设计的步骤
确定目标基因序列
目标基因序列的来源
可以是基因组、转录组、cDNA等。
目标基因序列的选择标准
选择基因序列时应考虑其功能、表达水平、变异程度等因素。
目标基因序列的获取方法
可以通过基因数据库、文献报道、实验测序等方法获得。
选择合适的引物序列
引物序列的设计原则
引物序列应具有特异性，避免与基因组其他序列发生非特 异性结合；长度一般在18-30bp之间；GC含量应适中， 一般在40%-60%之间。
引物长度一般在15～30碱基之间，过短可 能降低引物特异性，过长则可能导致引物 结合温度升高，不利于引物的特异性。
碱基分布均匀原则
避免二级结构原则
引物序列中的G+C含量在40%～60%之间 ，避免出现连续的4个以上的G或C。
引物自身及引物之间不能形成互补性二聚 体或发夹结构等二级结构。
1)引物设计
引物设计的主要原则
（1）引物长度：15-30bp，常用为20bp左右，太短会降低退火温度影响引物 与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费，且难条件下可扩增长至10kb的片段。 （3）引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多 易出
大肠杆菌基因组DNA的提取
基因组DNA的提取通常用于PC物、微生物）的基因组DNA提取方 法有所不同；同种生物的不同各种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及 所含的成分不同，分离方法也有差异。无论何种生物基因组DNA，其提取方 法基本可分为两步：先是温和裂解细胞及溶解DNA，接着采用化学或酶学的 方法，去除蛋白、RNA及其它大分子，再用乙醇沉淀出DNA。常用的经典提 取方法有CTAB法和SDS法。提取基因组DNA总的原则包括： （1）保证核酸一级结构的完整性； （2）其它生物大分子，如蛋白质、多糖、酚类、脂类分子的污染应尽量降到最 低； （3）核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； （4）其它核酸分子，如RNA，也应尽量去除。
35个循环
• 最终得到引物序列如下：
• 上游引物5‘GTTGGATCCATGAAAGCATTACATTTTC GCG-3‘（BamHI）
• 下游引物5‘TGGGAGCTCATTATTGCATTGCTTTATAA GCG-3‘（SacI）
反应参数： 94℃ 5min 94℃ 1min 55℃ 1min 72℃ 2min 72℃ 10min
现非特异条带。 （4）避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，
否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 （5）引物3”端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避
PCR引物设计
第7章 PCR引物设计
上机操作7
【实验名称】 PCR引物设计 【实验目的】 掌握引物设计的基本要求，掌握使用软件 Oligo6.0进行引物设计，掌握使用软件 Bioxm2.6 进行酶切位点分析。 【实验器材】 Oligo 6.0软件，Bioxm2.6软件，NCBI 数据库
• 实验原理
PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸 片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。引物设计 总体上包含三个程序：序列下载，引物设计筛选， 特异性分析。
PCR引物的设计原则：
① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 ② 产物不能形成二级结构。 ③ 引物长度一般在15~30碱基之间。 ④ G+C含量在40%~60%之间。 ⑤ 碱基要随机分布。 ⑥ 引物自身和互相之间不能有连续4个碱基的互补。 ⑦ 引物5′端可以修饰，引物3′端不可修饰。 ⑧ 引物 3’端的碱基要求严格配对
DraI (1260) DraI (1274) Nco I (1322)
EGFP
XhoI (2054) Sac I (2061) Not I (2331) H indIII (2063) Eco RI (2070)
MCS
Pst I (2079) Sal I (2080) K pnI (2090) Bam H I (2101) Xba I (2113)
实验步骤
1、从NCBI数据库中下载水稻CDPK1基因的序列（2238bp）， 2、向Oligo6.0程序导入模板序列:复制序列后在Oligo软件的序 列展示窗口粘贴，oligo会自动去除非碱基字符。当序列输入或 粘贴完成后，点击Accept/Discard菜单中的Accept浮动命令，即 可进入引物设计模式。 3、开始引物设计：在基因的之间设计一对扩增产物长度在 1500-1800bp左右的引物，两头加上合适的酶切位点便于连入表 达载体（见后一张PPT的图）。 具体步骤自己整理并在报告上写清楚。
上机操作7
【实验名称】 PCR引物设计 【实验目的】 掌握引物设计的基本要求，掌握使用软件 Oligo6.0进行引物设计，掌握使用软件 Bioxm2.6 进行酶切位点分析。 【实验器材】 Oligo 6.0软件，Bioxm2.6软件，NCBI 数据库
• 实验原理
PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸 片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。引物设计 总体上包含三个程序：序列下载，引物设计筛选， 特异性分析。
PCR引物的设计原则：
① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 ② 产物不能形成二级结构。 ③ 引物长度一般在15~30碱基之间。 ④ G+C含量在40%~60%之间。 ⑤ 碱基要随机分布。 ⑥ 引物自身和互相之间不能有连续4个碱基的互补。 ⑦ 引物5′端可以修饰，引物3′端不可修饰。 ⑧ 引物 3’端的碱基要求严格配对
DraI (1260) DraI (1274) Nco I (1322)
EGFP
XhoI (2054) Sac I (2061) Not I (2331) H indIII (2063) Eco RI (2070)
MCS
Pst I (2079) Sal I (2080) K pnI (2090) Bam H I (2101) Xba I (2113)
实验步骤
1、从NCBI数据库中下载水稻CDPK1基因的序列（2238bp）， 2、向Oligo6.0程序导入模板序列:复制序列后在Oligo软件的序 列展示窗口粘贴，oligo会自动去除非碱基字符。当序列输入或 粘贴完成后，点击Accept/Discard菜单中的Accept浮动命令，即 可进入引物设计模式。 3、开始引物设计：在基因的之间设计一对扩增产物长度在 1500-1800bp左右的引物，两头加上合适的酶切位点便于连入表 达载体（见后一张PPT的图）。 具体步骤自己整理并在报告上写清楚。
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含内含子，因此引物设计时直接用基因组DNA即可
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希望搜索的引物不会与pp其t课它件 存在于反应中序列发生错配
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简并引物设计
►获得序列未完全清楚的核酸的一种引物设计方案，特 点是所设计的引物序列某位置的核苷酸可以是两个或 者两个以上不同的碱基，结果所合成的引物是该位置 上不同序列的混合物。
►要想得到效果很好的引物，在自动搜索的基础上还要辅以人 工分析。引物设计软件的最佳搭配是“Oligo”和“Premier”软
件合并使用，以“Premier”进行自动搜索，“Oligo”进行分析
评价，如此可快速设计出成功率很高的引物。
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精品资料
• 你怎么称呼老师？
• 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你 是否会认为老师的教学方法需要改进？
8、酵母线粒体（Yeast Mppitt课o件chondrion）
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DNA/mRNA引物的区别
exon intron
5’ pmGpppG
DNA AAAAAA 3’ mRNA
• 检测的基因如果来自真核生物，需要用mRNA进行引物设计
• 检测的基因如果为原核生物，其表达一般是要基因序列中不
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UCSC Genome Browser是由University of California Santa Cruz (UCSC) 创立和维护的， 该站点包含有人类、小鼠和大鼠等多个物种的基因组草图，并提供一系列的网页分析工 具。站点用户可以通过它可靠和迅速地浏览基因组的任何一部分，并且同时可以得到与 该部分有关的基因组注释信息，如已知基p因pt，课件预测基因，表达序列标签，信使RNA2，8 CpG岛，克隆组装间隙和重叠，染色体带型，小鼠同源性等。
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互换、 语音提示键盘输p入pt课等件等。
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Primer Premier 5.0 使用介绍
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安装Primer premier5
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ห้องสมุดไป่ตู้
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以肿瘤坏死因子TNF基因为例
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目标基因序列的获取
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引物设计功能
限制性酶 切位点分析
同源性分析
蛋白酶体基元和活 性位点分析
DNA与蛋白序列的互换
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原始序列 选择一种功能
序列名称
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Premier Primer 5提供了8种生物遗 传密码使用的偏好选择
1、纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear）
► 引物分析软件（ Oligo 、Primer、Blast等）
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Primer Premier 5.0 简介
主要功能：
1. 引物设计 2. 限制性内切酶位点分析 3. DNA基元（motif）查找 4. 同源性分析
► 此外，该软件还有一些特殊功能，其中最重要的是设计
简并引物，另外还有序列“朗读”、DNA 与蛋白序列的
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我 笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
引物设计与分析软件
► 引物设计软件（ Primer 、Oligo 、codehop、FastPCR、Generunner 、 Vector NTISuit、Dnasis、Omiga、Dnastar等）
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搜索结果
搜索到的引物对数
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选中引物的信息
双击选中一对引物
引物的信息，包括pp是t课否件出现发夹结构、二聚体等。
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理想引物应当不存在任何一种上述结构
引物分值100分为满分
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►为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同 生物的碱基使用偏好，减少简并性。
►核苷酸链中除出现正常的A、T、G、C四种碱基符号 外还出现如R、Y、M、K等其他字母（其中 R=A/G,Y=C/T,M=A/C,S=C/G,W=A/T,H=A/C/T,B=C/ G/T,V=A/C/G,D=A/G/T,N=A/C/G/T）。
引物设计
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引物设计常用软件介绍
►软件的功能主要体现在两个方面：首先是引物分析评价功能；
其次是引物的自动搜索功能。
►“Primer Premier”为最强且方便使用，“Oligo 6”其次，其
他软件如“Vector NTI Suit”、“Dnasis”、“Omiga”和
“Dnastar”都带有引物自动搜索功能。
2、无脊椎动物线粒体（Invertebrate Mitochondrion）
3、支原体（Mycoplasma）
4、植物线粒体（Plant Mitochondrion）
5、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion）
6、一般标准（Standard）
7、脊椎动物线粒体（Vertebrate Mitochondrion）