核酸分离与纯化
核酸的分离与纯化
核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多 糖、脂肪等生物大分子分开。 在分离核酸时，应遵循两个原则：一是保 证核酸一级结构的完整性；二是尽量排除 其它分子的污染，保证核酸样品的纯度。
2018/7/20
2
核酸分离与纯化的过程一般都包括了材料 的选择、核酸的释放、核酸与其它生物大 分子的分离、核酸的纯化与鉴定、核酸的 浓缩、保存等几个主要步骤。 每一步骤又可由多种不同的方法单独或联 合实现。
34
2018/7/20
5. 质粒DNA的纯化
（1）聚乙二醇沉淀法 质粒DNA的粗制品首先用LiCl沉淀大分子 RNA，并用RNase消化小分子RNA；然 后在高盐条件下，用PEG选择性地沉淀大 的质粒DNA；沉淀的质粒DNA进一步用 酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。
2018/7/20
35
（2）柱层析法 柱层析法纯化质粒DNA的关键是其填充的树脂。 树脂可分为两类：一类是利用疏水的相互作用来 纯化质粒DNA样品；一类则通过离子交换与吸附 的相互作用进行纯化。 以硅基质作为填充材料的柱层析，其作用原理是 在多盐条件下，依靠DNA与硅基质的可逆性结合 来进行纯化。通过暴露的磷酸盐残基，DNA吸附 到硅基质上，以50%的乙醇溶液洗去RNA和糖 类等生物大分子，然后加入TE或水溶液使DNA 分子重新水合，并通过离心洗脱出来。
在酚或酚-氯仿中加入少许的异戊醇，是可以
减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，保
持分相的稳定性。
2018/7/20
21
为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNA的分离？ 苯酚在空气中经常被氧化生成醌，它能够产生 自由基，如果直接用于DNA分离，会使磷酸二 酯键断裂，造成DNA降解。氧化苯酚需要经过 高温重蒸以除去氧化物，并用Tris-Hcl饱和酚， 并调节至中性。使用饱和酚可以减少酚吸收更 多的DNA，降低DNA的损失率。
核酸提取经典方法
核酸提取经典方法
核酸提取是分离和纯化生物样本中的核酸分子的过程。
经典的核酸提取方法通常包括以下步骤：
1. 细胞破碎和裂解：将细胞或组织样本破碎和溶解，以释放核酸。
常用的方法包括机械破碎、化学裂解和酶裂解等。
2. 蛋白质去除：将裂解后的样品进行蛋白酶处理，以去除蛋白质等杂质。
可使用蛋白酶K处理、苯酚/氯仿法或硅胶膜法等。
3. 酒精沉淀：通过加入适量的醇类，如乙醇或异丙醇，使核酸沉淀下来。
通常会加入盐类，如氯化钠或乙酸钠，以调节溶液的离子浓度。
4. 洗涤：将核酸沉淀物进行洗涤，以去除沉淀物中的杂质。
常用的洗涤方法包括乙醇洗涤法、酚/氯仿洗涤法或硅胶膜洗涤法。
5. 溶解：将洗涤后的核酸沉淀溶解于适当的缓冲液中，以得到高纯度的核酸。
常用的溶解缓冲液包括Tris-HCl缓冲液或无酶水。
上述方法是常见的经典核酸提取方法，但随着科学技术的发展，现代的核酸提取方法也在不断改进和更新，以提高提取效率和纯度。
如今，还有各种基于磁珠、
膜片、筛膜、电泳和自动化设备等的高通量、高效、自动化的核酸提取方法被广泛应用于科学研究和临床诊断。
核酸分离与纯化的原理及其方法学进展
作者单位:518000深圳市人民医院检验医学部微生物室(唐曙明、何林);524023湛江,广东医学院生化教研室(周克元)・讲座・核酸分离与纯化的原理及其方法学进展唐曙明 何林 周克元 【关键词】 核酸; 分离与纯化; 核酸提取 核酸的分离与纯化技术是生物化学与分子生物学的一项基本技术。
随着分子生物学技术广泛应用于生物学、医学及其相关等领域,核酸的分离与纯化技术也得到进一步发展。
各种新方法、经完善后的传统经典方法以及商品试剂方法的不断出现,极大地推动了分子生物学的发展。
现就核酸分离与纯化的原理及其方法学进展作一综述。
核酸分离与纯化的原则核酸在细胞中总是与各种蛋白质结合在一起的。
核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开。
在分离核酸时应遵循以下原则:保证核酸分子一级结构的完整性;排除其他分子污染。
核酸分离与纯化的步骤大多数核酸分离与纯化的方法一般都包括了细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。
每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。
1.细胞裂解:核酸必须从细胞或其他生物物质中释放出来。
细胞裂解可通过机械作用、化学作用、酶作用等方法实现。
(1)机械作用:包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。
这些方法用机械力使细胞破碎,但机械力也可引起核酸链的断裂,因而不适用于高分子量长链核酸的分离。
有报道超声裂解法提取的核酸片段长度从<500bp ～>20kb之间,而颗粒匀浆法提取的核酸一般<10kb。
(2)化学作用:在一定的p H环境和变性条件下,细胞破裂,蛋白质变性沉淀,核酸被释放到水相。
上述变性条件可通过加热、加入表面活性剂(SDS、Triton X2100、Tween20、N P240、CTAB、sar2 cosyl、Chelex2100等)或强离子剂(异硫氰酸胍、盐酸胍、肌酸胍)而获得。
而p H环境则由加入的强碱(NaO H)或缓冲液(TE、STE等)提供。
核酸的分离与纯化.
使用酚时应注意
(1）使用注意 酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉 红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如 醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验， 因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。 (2）安全操作 酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时 应戴手套。
Home
2.3 核酸的沉淀
沉淀是浓缩核酸最常用的方法。 优点：
DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。 缺点：
易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥 发除去。所以，最后用70％乙醇漂洗数次。
（3）聚乙二醇（PEG）
优点： 可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相对分子质量
的DNA片段。应用6000相对分子质量的PEG进行 DNA沉淀时，使用浓度与DNA片段的大小成反比。 注意：
(1） 金属离子螯合剂：
DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因 此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。 如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠)、8-羟基喹啉； (2） 阴离于型表面活性剂：
如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还 能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷 的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。
核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电 吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非 极性的范德华力。
分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合 的蛋白质分开，同时避免核酸降解。
2.2.1 加入浓盐溶液（如NaCl）
核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力， 使氢键破坏，核蛋白解聚；
2.2.2 加入SDS
SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还 具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；
1）温度不要过高； 2）控制pH值范围(pH值5-9); 3）保持一定离子强度; 4）减少物理因素对核酸的机械剪切力.
核酸分离与纯化的技术路线与原则
核酸分离与纯化的技术路线与原则核酸包括DNA 、RNA两类分子，在细胞内均与蛋白质结合成核蛋白。
真核生物基因组中，95%DNA 为双链线性分子，存在于细胞核中，5%为双链环状分子，存在于细胞器中；原核生物DNA 及质粒DNA 为双链或单链环状分子；RNA 为单链线性分子，主要存在于细胞质中。
DNA 与RNA 性质的不同导致对其分离与纯化的条件也不相同。
一、核酸分离与纯化的原则(1)保证核酸一级结构的完整性。
生物的遗传信息全部贮存在核酸一级结构中，而且核酸的一级结构还决定其高级结构的形式及和其他大分子结合的方式。
所以，所提取的核酸一级结构的完整性直接影响着后续实验中对其结构与功能研究的质量。
因此，在制备核酸的过程中，要做到：尽量简化操作程序，缩短提取过程；避免过酸、过碱等化学因素对核酸链中磷酸二酯键的破坏，在pH 值4～10条件下进行操作；操作时动作要轻缓，提取的样品小包装保存，以免诸多的物理因素对核酸的降解；避免细胞内及环境中核酶对核酸的生物性降解。
(2)排除其他生物大分子的污染，如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应尽可能降低到最低程度，特别是提取DNA 分子时应除去RNA 分子，反之亦然。
(3)排除核酸样品中有机溶剂和过高浓度的金属离子。
二、分离与纯化的技术路线(一)核酸的释放通常情况下DNA 及RNA 均位于细胞内，因此核酸分离与纯化的第一步就是制备单个细胞，再破碎细胞，从而释放核酸。
破碎细胞的方法包括机械法与非机械法两大类。
机械法又可分为液体剪切法与固体剪切法；非机械法可分为干燥法与溶胞法。
由于溶胞法采用适宜的化学试剂与酶，能有效地裂解细胞，方法温和，能保证较高的核酸获得率，并能较好地保持核酸的完整性，从而得到广泛的应用。
(二)核酸的分离与纯化利用核酸与其他物质性质上的差异，可以分离与纯化核酸。
这种差异包括细胞定位与组织分布上的差异，物理、化学性质上的不同，以及各自独特的生物学特性。
操作过程中，既可以从复杂样品中抽提出核酸分子，也可以将样品中的非核酸成分(非核酸的生物大分子、非需要的核酸分子及在操作过程中加入的溶液与试剂)逐步清除。
第六章核酸的分离与纯化
三、鉴定、保存与应用
（一）核酸的鉴定
1．浓度鉴定核酸浓度的定量鉴定可通过紫外分光光度法与荧光光度法进行。
（1）紫外分光光度法：紫外分光光度法是基于核酸分子成分中的碱基均具有一定的紫外线吸收特性，最大吸收波长在250nm～270nm之间。这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后，其最大吸收波长不变。由核苷酸组成核酸后，其最大吸收波长为260nm，该物理特性为测定溶液中核酸的浓度奠定了基础。在波长260nm的紫外线下，1个OD值的光密度大约相当于50µg/ml的双链DNA，38µg/ml的单链DNA或单链RNA，33µg/ml的单链寡聚核苷酸。如果要精确定量已知序列的单链寡核苷酸分子的浓度，就必须结合其实际分子量与摩尔吸光系数，根据朗伯-比尔定律进行计算。若DNA样品中含有盐，则会使A260的读数偏高，尚需测定A310以扣除背景，并以A260与A310的差值作为定量计算的依据。紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25µg/ml的核酸溶液。
2．纯度鉴定紫外分光光度法还是荧光光度法，均可用于核酸的纯度鉴定。
核酸的分离与纯化讲解
• 二.质粒和噬菌体DNA的提取和纯化
• （一）质粒DNA的提取 • 基本步骤 • 1.细菌的培养 • 2.细菌的收集与裂解 • 3.质粒DNA的纯化 • 提取方法
• 煮沸法： • 碱法：最常用的质粒DNA提取方法。 • SDS法：
• （二）噬菌体DNA的提取
• 1.细菌培养 • 2.细菌的感染及裂解 • 3.噬菌体的沉淀及纯化 • 4.噬菌体DNA的提取
• 图1 玻璃砂研磨提取总DNA的电泳结果
• 1-4孔为低pH值法，5-8孔为CTAB法，9-12孔为苯酚法 • 1,2为西洋参；3.鲜品布渣叶；4.干品布渣叶
• 图2 氧化铝研磨提取总DNA的电泳结果
• 1-4孔为低pH值法，5-8孔为CTAB法，9-12孔为苯酚法 • 1,2为西洋参；3.鲜品布渣叶；4.干品布渣叶
一、概述
• 核酸分离提取的原则 • 常用方法及基本原理 • DNA的分离纯化 • RNA的分离纯化
第一节 核酸分离提取的原则
• 一、基本原则
• 1.保证核酸一级结构的完整性。 • 2.排除其它分子的污染。
• 二、注意事项
• 1.简化操作步骤，减少对核酸的破坏。 • 2.避免过酸（碱）等化学因素的影响（pH4～10）。 • 3.减少物理因素对核酸的降解。 • 4.防止核酸的生物降解。
• ③分离浮力密度不同的DNA分子或其他分子颗粒， 如图1。
图1 氯化铯梯度纯化λ噬菌体
噬菌体在1.45g/ml与1.50g/ml氯化铯界面之间形成一肉眼可 见的带。在1.45g/ml与1.50g/ml氯化铯界面之间可看到一个 由噬菌体颗粒形成的浅蓝色带。
• ④纯化DNA分子。在中性CsCl溶液中，DNA的 浮力密度为1.7g/ml，RNA为2.0g/ml，蛋白 质的浮力密度为1.3～1.4g/ml。在起始密度 为1.7g/ml的CsCl溶液中进行超速离心，可 以很好地将三者区分开。蛋白质浮在上层液 面，DNA分子在离心管中间形成区带，RNA沉 于管底，从而达到从DNA样品中去除微量RNA 和蛋白质的目的。
核酸分离纯化方法
核酸分离纯化方法
核酸分离纯化方法包括以下几种常用方法：
1. 酚酸法（Phenol-Chloroform Extraction）：通过酚酸混合液溶解蛋白质，然后进行醚抽提，可分离出核酸。
该方法通常用于大量样品的纯化。
2. 高盐法（Salt Precipitation）：通过加入高浓度盐溶液，如氯化钠，使核酸在低温下形成沉淀，然后离心分离。
3. 硅胶柱法（Silica Column）：将核酸样品通过硅胶柱，利用硅胶对核酸的亲合性，使核酸固定在柱中，通过洗脱剂洗脱纯化的核酸。
4. 钠离子交换柱法（Sodium Ion Exchange Column）：利用柱内载体对核酸的亲合性，在一定的钠离子浓度下，核酸与载体结合，通过洗脱缓冲液洗脱纯化的核酸。
5. 凝胶电泳法（Gel Electrophoresis）：利用电场作用，将核酸样品在凝胶上进行分离和纯化。
根据核酸的大小，可选择琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
核酸的分离和纯化
6
1.2 核酸分离与纯化的要求
(1) 为保证核酸的完整性，
化学因素？ 生物因素？ 物理因素？
（防止降解），在实验中应注意：
① 尽量简化步骤，缩短提取时间，减少各种 有害因素对核酸的破坏。
② 减少化学因素对核酸的降解，pH4-10。
核酸的分离和纯化
7
③ 防止核酸的生物降解（细胞内或外的 各种核酸酶水解）。
优点： 对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除 去，不影响以后实验。
缺点： 需要量大，一般要求低温操作。
核酸的分离和纯化
21
异丙醇
优点： 需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的DNA 样品沉淀。一般不需低温长时间放置。
缺点： 易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥
发除去。所以，最后用70％乙醇漂洗数次。
核酸的分离和纯化
16
使用酚时应注意
(1）使用注意 酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈
现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物， 例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提 实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。
(2）安全操作 酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操
作时应戴手套。
核酸的分离和纯化
17
③ 去除对后续实验有影响的物质，如有机 溶剂和过高浓度的金属离子。
核酸的分离和纯化
10
2. 核酸制备的基本步骤
I.材料准备
破碎细胞
II.破碎细胞或包膜－内容物释放
提取
III.核酸分离
纯化
IV.沉淀或吸附核酸，纯化并去除杂质
V.核酸溶解在适量缓冲液或水中
核酸的分离和纯化
11
2.1 破碎细胞
(1)玻璃匀浆器匀浆
2.3 沉淀核酸
重新调整核酸的浓度，起到浓缩核酸的作用； 去除溶液中某些盐离子与杂质； 改变核酸的溶解缓冲液。
DNA纯化柱
核酸提取（离心柱型） 利用硅胶膜特异吸附核酸
核酸的分离和纯化
18
2.3.1 核酸的有机溶液沉淀法
当核酸溶液的pH值 大于4时，核酸分子呈 多聚阴离子状态。
钾、钠、镁、锂及铵 根等阳离子形成的盐， 通过屏蔽带负电的磷酸 基团使DNA分子聚结在 一起而不溶于许多有机 溶剂。
Na+ Mg2+ Li+
核酸的分离和纯化
19
① 核酸沉淀的盐类及浓度
盐 贮存液浓度（mol/L) 终浓度(mol/L)
MgCl2
1
0.01
NaAc
3 (pH5.2)
0.3
KAc
3 (pH5.2)
0.3
NH4Ac
10
2.5
NaCl
5
0.2
LiCl
8
0.8
核酸的分离和纯化
20
② 常用的有机沉淀剂
乙醇
核酸的分离和纯化
22
聚乙二醇（PEG）
优点： 可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相对分子质量
的DNA片段。应用6000相对分子质量的PEG进行 DNA沉淀时，使用浓度与DNA片段的大小成反比。 注意：
PEG沉淀一般需加0.5mol/L的NaCl或10 mmol/L 的MgCl2。
核酸的分离Leabharlann 纯化23核酸的分离和纯化
3
核酸的分类：
DNA 核内染色体 DNA。 核外也有少量DNA，如线粒体DNA，叶绿体 DNA。 质粒DNA。
RNA 存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。
除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病 毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。
核酸的分离和纯化
核酸的分离和纯化
核酸的分离和纯化
1
找答案？
➢ 核酸分离纯化的原则是什么？为防止 核酸降解需要注意什么？
➢ 核酸制备基本步骤？ ➢ 如何鉴定核酸浓度和纯度？ ➢ 核酸的保存方法有哪些？
核酸的分离和纯化
2
前言
核酸（nucleic acid）是以核苷酸为基本组成单位 的生物信息大分子。是遗传信息的携带者，是基 因表达的物质基础。
4
主要内容
1. 核酸分离与纯化的原则及要求 2. 核酸制备的基本步骤 3. 核酸的鉴定和保存 4. 核酸提取方法简介
核酸的分离和纯化
5
1. 核酸分离与纯化的原则及要求
1.1 核酸分离与纯化的一般原则
(1) 保持核酸分子一级结构的完整性，是核酸结 构和功能研究的最基本要求。
(2) 排除其他分子的污染，保证核酸的纯度。
分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白 质分开，同时避免核酸降解。
核酸的分离和纯化
14
（1）加入SDS
SDS除有破膜和抑制核酸酶的作用外，还具有 使核酸从蛋白质上游离出来的功能；
（2） 加入浓盐溶液（如NaCl）
核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使 氢键破坏，核蛋白解聚；
核酸的分离和纯化
(2)液氮研磨法
富含DNA酶的胰、脾、胸腺、淋巴； 富含胶原蛋白的皮肤、肌腱； 坚硬的组织如骨骼。
核酸的分离和纯化
12
(3)高速组织捣碎机捣碎 (4)超声波处理法
(5)化学处理法(SDS、吐温80等）
(6)生化法（溶菌酶、纤维素酶等）
核酸的分离和纯化
13
2.2 核酸分离，去除蛋白
核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力(核 酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。
精胺
精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀DNA。
原理是： 精胺与DNA结合后，使DNA在溶液中结构凝缩
15
（3）酚/氯仿抽提
酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑 制作用。
氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中 的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。
在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促使 水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯：异 戊醇=25：24：1）。
④
所用器械和一些试剂需高压灭菌，提取缓
冲液中需加核酸酶抑制剂。操作温度为0~4℃。
DNA酶需要金属离子Mg2+、Ca2+的激活，因此 使用金属离子螯合剂，如EDTA或柠檬酸盐等； 阴离子表面活性剂SDS。
RNA酶分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、 耐酸碱、不易失活，生物降解是RNA提取过程中 的主要危害因素。0.1%DEPC浸泡，器械180℃ 干烤8h。
核酸的分离和纯化
8
④ 减少物理因素对核酸的降解，主要 是机械剪切力，其次是高温。
机械剪切力包括强力高速的振荡、突然暴 露于低渗液、样品反复冻融等。
高温，如长时间的煮沸。
核酸的分离和纯化
9
(2) 核酸纯度的要求：
① 非核酸生物大分子的污染降低到最低程 度，如蛋白质、多糖和脂类分子；
② 排除其它核酸分子的污染，如制备RNA 时，DNA分子是污染物；