第五章基因工程相关技术
基因工程的四大技术
基因工程的四大技术
1.基因克隆技术：基因克隆技术是指将某个有意义的DNA片段插入到载体DNA上，形成重组DNA分子，再将其导入细胞中，使细胞表达出与该DNA片段相关的功能蛋白质。
这一技术是基因工程的重要基础，也是其他技术的前提。
2. 基因敲除技术：基因敲除技术是利用RNA干扰或CRISPR/Cas9技术，将目标基因的DNA序列进行改变或剪切，使其失去功能。
这一技术可以用于研究基因功能，识别疾病基因，以及开发新的治疗方法。
3. 基因编辑技术：基因编辑技术是利用CRISPR/Cas9等技术，直接对基因进行编辑，使其发生精准的改变，如点突变、删除、插入等。
这一技术可以用于治疗遗传病、改良农作物品种等领域。
4. 基因合成技术：基因合成技术是利用化学合成方法，将DNA 序列按照设计的顺序合成，形成具有特定功能的基因。
这一技术可以用于合成人工基因、改良生物代谢途径等应用。
- 1 -。
5、15 基因工程--上下游技术
2 反转录PCR(RT-PCR)
用于直接扩增经反转录为CDNA的特定RNA序列的PCR 方法称为RT-PC方法。此方法敏感度极高,且简单易行。 目前许多公司设计了多种形式的RT-PCR试剂盒,使用 十分方便,例如"一步法RT-PCR试剂盒",利用 SuperScript逆转录酶和TaqDNA聚合酶的混合体系, 所有反应在一个试管内完成,灵敏度极高,只需0.1pg总 RNA便可扩增3.5kb的CDNA片段;"高温反转录-PCR 系统"采用热稳定型RNAaseH-反转录酶,可在70℃条 件下完成反转录过程,最长可反转录12kb的CDNA分子。
3 定量PCR
定量PCR主要分为DNA-PCR和mRNA-PCR定量两类。 DNA-PCR采用同位素或荧光等标记经电泳分离的PCR 扩增产物,进行自显影后根据底片的曝光强弱对模板 DNA进行定量。本实验需预先采用已知浓度的标准 DNA模板,在PCR扩增后测定放射性并绘制标准曲线,根 据标准曲线确定扩增产物量。mRNA-PCR需先经逆转 录获得CDNA后再进行PCR扩增,采取同DNA-PCR定量 的方法确定RNA数量,这种方法由于 现在测定DNA序列主要有两类方法： 1. Sanger等提出的酶法。 2. Maxam及Gilbert提出的化学降解法。
两种方法尽管大相径庭,但结果却是一致的。
20世纪70年代两种方法刚问世时,化学方法测序重 现率高,较易操作,只需高质量的化学试剂,因此为 多数研究人员所接受。而酶法需单链DNA模板和 特异的寡核苷酸引物及高质量的聚合酶,操作较复 杂。随着M13噬菌体和载体的发展,引物合成日渐 方便及测序技术的日臻完善,目前主要采用Sanger 等发明的酶法测序。
1、上游阶段：首先获得目的基因，然后用限制性内切
基因工程的主要技术原理
基因工程的主要技术原理基因工程是一种利用现代分子生物学和生物化学技术来对生物体进行基因组的修改、操作和调控的技术。
它的主要技术原理涉及到以下几个方面：1.DNA重组技术：DNA重组是基因工程的核心技术之一、它通过切割不同生物体中的DNA片段，然后重新组合、连接，将特定的基因或基因片段导入到目标组织、细胞或生物体中。
DNA重组技术包括PCR、限制酶切、DNA连接等。
2.遗传转化技术：遗传转化是将外源DNA导入目标生物细胞或组织中的过程。
常用的转化方法包括细菌的转化、植物的遗传转化以及动物细胞的转染等。
3.基因克隆技术：基因克隆是指通过复制DNA片段来得到多个完全相同的基因分子或有关基因分子的方法。
基因克隆包含了DNA提取、DNA扩增、DNA定序等技术。
5.选择标记技术：为了辅助识别和选择已经被转化的细胞或生物体，常常需要在外源基因上引入选择标记基因。
选择标记基因通常携带特定抗性或基因标记，如抗生素抗性基因或荧光蛋白基因。
6.基因表达调控技术：为了使外源基因在目标生物体中得到高效表达，常需对其进行适当调控。
基因表达调控技术包括启动子的选择、转录因子的调控、信号通路的调节等。
7. 基因测序技术：基因测序是确定DNA序列的方法，可用于分析基因组结构、功能和演化。
目前，最主要的基因测序技术是高通量测序技术，如Illumina测序技术和PacBio测序技术。
8.产生转基因生物技术：基因工程的一个重要应用是产生转基因生物。
转基因生物是指通过基因工程技术将外源基因导入到目标生物体中，使其获得新的性状或功能。
常见的转基因生物包括转基因植物、转基因微生物等。
以上是基因工程的主要技术原理。
随着科学技术的不断进步，基因工程技术将进一步发展和应用，为解决人类面临的许多生物学和医学问题提供更好的解决方案。
何水林版基因工程第五章基因的转移与重组体的筛选和鉴定
带酶切位点的PCR产物 5’- GCAGAATTC
PCR产物 PCR产物
GGATCCGCG CCTAGGCGC BamH I位点
-3’
-5’
3’- CGTCTTAAG
EcoR I位点
EcoR I BamH I 5’AATTC 3’- G PCR产物 PCR产物 G -3’ CCTAG -5’
两头各有一个粘性末端！
4. DEAE-葡萄糖转染法 二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖为多聚阳离子试剂，能 促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。
葡聚糖
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++ - - - -- - DNA - - --- -
4、在培养基中生长数小时之后，球形细胞复原并增殖。
操作步骤： 10ng 载体DNA 100L 感受态细胞 10-100L转化液 涂Amp＋平板
（p140）
吸附DNA 冰浴30min
摄入DNA 42℃ 1~2min
37℃ 振荡培养1h
加入1mL LB培养基 （Amp-）
转化率：106-108/g DNA
（一）转化率的计算：
转化率 ＝ 产生菌落的总数 / DNA的加入量
生物学知识点 基因工程
生物学知识点基因工程基因工程是生物学中的一个重要分支，它涉及到对基因的操作和改造，以达到改良生物体的目的。
本文将介绍基因工程的基本概念、技术方法以及应用领域。
一、基因工程的概念与原理基因工程是指通过对生物体的基因进行人为的操作和改造，以达到改良生物体的目的的一门学科。
其基本原理是利用现代分子生物学的技术手段，对生物体的基因进行剪接、克隆、转移等操作，从而实现对生物体特性的调控和改变。
基因工程的核心技术是基因重组技术，即将不同生物体的基因进行重组，形成新的基因组合，然后将其导入目标生物体中，使其表达出新的特性。
基因重组技术主要包括以下几个步骤：1. DNA提取：从生物体中提取出含有目标基因的DNA片段。
2. 基因剪接：利用限制酶将目标基因与载体DNA进行剪接，形成重组DNA。
3. 转化：将重组DNA导入到宿主细胞中，使其表达出目标基因。
4. 选择与筛选：通过选择性培养基或标记基因等方法，筛选出带有目标基因的转基因细胞或生物体。
5. 鉴定与分析：对转基因细胞或生物体进行鉴定和分析，确认其是否成功表达目标基因。
二、基因工程的应用领域1. 农业领域：基因工程在农业领域的应用十分广泛。
通过基因工程技术，可以改良农作物的抗病性、耐逆性和产量等性状，提高农作物的品质和产量。
例如，转基因水稻可以提高抗虫性和耐盐碱性，转基因玉米可以提高抗除草剂和杂草的能力。
2. 医学领域：基因工程在医学领域的应用主要包括基因治疗和基因诊断。
基因治疗是指利用基因工程技术，将正常的基因导入到患者体内，以治疗遗传性疾病或其他疾病。
基因诊断是指通过对患者的基因进行检测和分析，以确定患者是否携带某种疾病的遗传基因。
3. 环境保护领域：基因工程可以应用于环境污染治理和生物修复。
通过基因工程技术，可以改造微生物，使其具有降解有机污染物的能力，从而实现对环境污染物的清除和修复。
4. 工业领域：基因工程在工业领域的应用主要包括生物制药和生物能源。
基因工程原理-第5章重组基因导入受体细胞
转化率＝
转化子 DNA分子数
＝
Ca2+诱导大肠杆菌转化法
① 低温下使磷质层形成液晶结构， Ca2+： 使膜间核酸酶分离 ② 与DNA结合，抗DNase
（1）感受态的制备
对数生长后期的菌体 5x107个/毫升
冰浴10分钟
含CaCl2缓冲液 15分钟 含CaCl2缓 冲液
（3）筛选转化子。
（2）DNA分子转化感受态细胞
菌间接合转移的有关基因
tra。
（Vir 区）
（Con区）
出毒性。占Ti质粒 1/3。
Ori区 ——复制起始区。
外源基因
Ti质粒载体
限制性酶 切开
（1）叶盘法转化植物细胞
（2）整体植株接种转化法
人为地在整体植株上造
成创伤部位，然后把农杆菌
接种在创伤表面，使农杆菌 按照天然的感染过程在植株
体内进行侵染。获得转化的
CHO，猴肾细胞等
• 受体动物：鼠、牛、羊、鱼等
第二节 重组基因导入受体细胞
一、重组基因导入原核受体细胞
接受DNA片段
（一）转化
1928年英国学者F·Griffth在肺炎双球菌中发现的，证
明了遗传的物质基础是DNA。
转化（transformation）——重组质粒DNA分子进入受体细胞，并在受 体细胞稳定维持和表达的过程，转化后的受 体菌，称转化子。 转化子 细胞数
（二）植物病毒介导基因转移 DNA病毒20%
植物病毒
RNA病毒80%
花椰菜花叶病毒：双链DNA病毒
（三）化学诱导DNA直接转化 （1）多聚物介导法 聚乙二醇 多聚赖氨酸 多聚鸟苷酸
（2）脂质体介导基因转化
脂质体
（四）物理方法介导DNA直接转化 （1）基因枪转化
基因工程的基本技术路线
基因工程的基本技术路线在这个瞬息万变的科学时代，基因工程就像是开启了一扇通往未来的大门。
相信很多小伙伴对基因工程这个词不陌生吧？简单来说，基因工程就是通过各种技术手段对生物的基因进行改造，来达到我们想要的结果。
就好比是给你的手机换个壳，里面的系统不变，但外观却焕然一新。
今天就让我们轻松聊聊基因工程的基本技术路线，看看它究竟是怎么一回事！1. 基因克隆1.1 什么是基因克隆？基因克隆，听起来就像是“复制粘贴”的感觉，其实就是把一个特定的基因复制出来，搞个“一模一样”的版本。
为什么要这么做呢？因为我们需要研究基因的功能，或者用这些基因来生产某些有用的蛋白质。
比如说，科学家们可以通过克隆某种植物的抗病基因，来培育出更强壮的农作物，这样一来，农民的收成可就不愁了。
1.2 基因克隆的步骤那么，基因克隆的过程到底是怎样的呢？这可是个不小的工程，首先得找出我们想要克隆的基因。
这个过程就像是在找一颗针掉在了大海里，得小心翼翼才能找到。
找到之后，我们就会用酶把这个基因从DNA中剪切出来。
接下来，将它插入到一个载体上，这个载体就像是一辆小车，能把基因送到合适的地方。
最后，把载体放入细胞里，让它在细胞中复制，等时间一到，我们就能收获一大堆“克隆版”基因了。
2. 基因编辑2.1 CRISPR技术说到基因工程，基因编辑就不能不提！现在最流行的编辑工具就是CRISPR了，听起来酷吧？CRISPR就像是一个超级精准的剪刀，可以在特定的地方“剪”掉或“插入”基因。
这种技术的出现，真是让科学家们欢呼雀跃。
想象一下，我们可以直接对植物的基因进行修改，让它们更耐旱、抗虫害，种地的成本一下子就降下来了。
2.2 基因编辑的应用基因编辑的应用简直是无穷无尽！不光是农作物，动物也能受益。
比如说，科学家们可以编辑小猪的基因，让它们长得更快、更健康，简直是“猪界超模”。
再比如说，人类基因组的研究，甚至可以帮助我们治疗某些遗传病，真是“扭转乾坤”的好技术。
第五章 微生物基因工程育种
1960年，F.Jacob和J.Monmd提出了操纵元 （操纵子）的概念，揭示了原核生物基因表达 调控的重要规律。
基因的现代概念
移动基因（movable gene） 断裂基因（split gene） 假基因（pseudogene） 重复基因（repeated genes） 重叠基因（overlapping genes） 或嵌套基因（nested genes）
基 因 工 程 流 程 示 意 图
基因工程的应用
基因工程技术已经在医学、工业、 农业等各个领域得到了广泛的应用。
在医学上的应用
基因工程被用于大量生产过
去难以得到或几乎不可能得到的
蛋白质－肽类药物。
转基因动物和植物
转基因动物首先在小鼠获得成功。现在
转基因动物技术已用于牛、羊，使得从 牛/
第五章 工业微生物基因育种
王陶 2012年2月
目的与要求
了解和掌握基因工程育种的原理与方法； 了解基因工程的主要载体与基因定位诱变的 原理与方法。
教学重点：质粒的特性与基因工程操作原理 教学难点：基因定位诱变的原理
教学内容
1、概述 基因工程在微生物育种中的地位和作用，原理 2、基因工程载体 几种常见的载体 3、基因工程所用的酶 限制性内切酶，核酸酶，连接酶，聚合酶等 4、基因工程的主要步骤 5、基因定位诱变
孟 德 尔 研 究 的 七 对 性 状
豌豆杂交操作
孟 德 尔 分 离 律
孟 德 尔 自 由 组 合 律
黄圆 绿圆 黄皱 绿皱
1909年，丹麦的遗传学家W.
Johanssen 根据希腊语“给予生命”之义，创造了 “gene‖一词。但它只是一个抽象的单 位，并不代表物质实体。
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本章内容
❖ 核酸的琼脂糖凝胶电泳 ❖ 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ❖ 琼脂糖凝胶DNA片段的回收 ❖ 感受态大肠杆菌的制备
聚丙烯酰胺 凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）
PAGE原理
Acr(单体丙烯酰胺) Bis(交联剂) AP(催化剂过硫酸铵) TEMED(加速剂)
以此凝胶为支 持物的电泳称 PAGE。
电泳的合适电压和温度
❖ 电泳时电压不应该超过 20V/cm，电泳温度 应该低于30℃。
❖ 注意如果电泳时电压和 温度过高，可能导致出 现条带模糊和不规则的 DNA带迁移的现象。 特别是电压太大可能导 致小片段跑出胶而出现 缺带现象
DNA样品的纯度和状态
❖ 注意样品中含盐量太高和含杂质 蛋白均可以产生条带模糊和条带 缺失的现象。
本章内容
❖ 核酸的琼脂糖凝胶电泳 ❖ 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ❖ 琼脂糖凝胶DNA片段的回收 ❖ 感受态大肠杆菌的制备 ❖ 基因组DNA的提取与纯化 ❖ RNA的提取与cDNA合成
琼脂糖凝胶
DNA片段的回收
琼脂糖凝胶DNA片段的回收
操作流程
切胶
融胶
电转 电泳 离心
硝酸纤维膜
洗脱
目
线
的
性
基
载
因
体
本章内容
❖ 用棉塞塞住瓶口,并用牛 皮纸封住扎紧后,将烧瓶 于120℃消毒20min.
LB平板培养基配制
❖ 消毒结束后, 在超净工作台内将培养 基倒入消过毒的平皿中(培养基的厚度 为3~5毫米).
❖ 侍培养基冷却凝固后,于4℃中保存备 用.
细菌划线培养
❖ 取一块无抗菌素的LB平板培养基,在超净工作台内,用细菌接 种环挑取细菌,于培养基上作蛇形画线.
细菌划线培养
❖ 将平板置入37℃培养箱中倒置培养 12~16小时,然后取出观察有无菌落长出.
PAGE注意事项
❖ （1）安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定螺丝，避免 缓冲液渗漏。
❖ （2）用琼脂(糖)封底及灌胶时不能有气泡，以免电泳时 影响电流的通过。
❖ （3）样品中应含一定浓度的蔗糖溶液，目的是用以防止 样品因对流而被稀释。
❖ （4）加样时样品不能超出凹形样品槽。加样槽中不能有 气泡，如有气泡，可用注射器针头挑除。
Ca2+
Ca2+
感受态大肠杆菌：在基因工程操作过程中，我们把处于易 接收外源ＤＮＡ状态的大肠杆菌，称为感受态大肠植菌．
经典氯化钙法制备感受态大肠杆菌的原理
DNA 分子
Ca2+Ca2C+a2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+ Ca2+Ca2+
Ca2+
感受态
Ca2+
Ca2+
大肠杆菌 Ca2+
Ca2C+a2+Ca2+Ca2+Ca2C+a2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+CaC2a+2+Ca2+
选择电泳方法
１．一般的核酸检测只需要琼脂糖凝 胶电泳就可以； ２．如果需要分辨率高的电泳，特别 是只有几个bp的差别应该选择聚丙 烯酰胺凝胶电泳； ３．用普通电泳不合适的巨大DNA 链应该使用脉冲凝胶电泳。注意巨 大的DNA链用普通电泳可能跑不出 胶孔导致缺带。
适合的电泳缓冲液
常用的缓冲液有TAE和 TBE，而TBE比TAE有着 更好的缓冲能力。
核酸琼脂糖 凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳原理与操作
核酸的琼脂糖凝胶电泳—注意事项
准备干净的配胶板和电泳槽 选择电泳方法 适合的电泳缓冲液 正确选择凝胶浓度 电泳的合适电压和温度 DNA样品的纯度和状态 DNA的上样 Marker的选择 凝胶的染色和观察
准备干净的配胶板和电泳槽
注意:DNA酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象
电泳缓冲液配制
注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，
PH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳 产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。
正确选择凝胶浓度
❖ 浓度通常在0.5～2％之 间，低浓度的用来进行 大片段核酸的电泳，高 浓度的用来进行小片段 分析。低浓度胶易碎， 小心操作和使用质量好 的琼脂糖是解决办法。
Marker的选择
❖ DNA电泳一定要使用DNA Marker或已知 大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。
凝胶的染色和观察
❖ 实验室常用的核酸染色 剂是溴化乙啶（EB）， 染色效果好，操作方便， 但是稳定性差，具有毒 性。而其他系列例如 SYBR Green， GelRed，虽然毒性小， 但价格昂贵。
❖ 注意变性的DNA样品可能导致 条带模糊和缺失，也可能出现不 规则的DNA条带迁移。在上样 前不要对DNA样品加热，用 20mM NaCl缓冲液稀释可以 防止DNA变性。
DNA的上样
❖ 正确的DNA上样 量是条带清晰的 保证。注意太多 的DNA上样量可 能导致DNA带型 模糊，而太小的 DNA上样量则导 致带信号弱甚至 缺失。
基因工程概论
第五章: 基因工程基本技术
主讲教师: 答疑电话:
Email:
引言
酶切
目 的 基 因
载
目
线
体
的
性
基
载
琼脂糖凝胶 因
体
回收技术
M
转化
电泳技术
连 接 反 应
肠感 杆受 菌态
大
重组载体
鉴定
筛选
本章内容
❖ 核酸的琼脂糖凝胶电泳 ❖ 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ❖ 琼脂糖凝胶DNA片段的回收 ❖ 感受态大肠杆菌的制备
钙磷复合物
DNA 分子
LB平板培养基配制
用天平准确称取下列物品并 置入一个洁净的100毫升 三角烧瓶中:
❖ 胰蛋白胨 1g ❖ 浓缩酵母浸出粉 0.5g ❖ NaCl 0.5g ❖ 1.5g的琼脂粉
LB平板培养基配制
❖ 在烧瓶中置入一磁力搅 拌棒并加入100毫升 ddH2O溶解上述物质, 然后磁力搅拌混匀.
❖ 核酸的琼脂糖凝胶电泳 ❖ 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ❖ 琼脂糖凝胶DNA片段的回收 ❖ 感受态大肠杆菌的制备 ❖ 基因组DNA的提取与纯化 ❖ RNA的提取与cDNA合成
感受态大肠 杆菌的制备
感受态大肠杆菌：在基因工程操作过程中，我们把处于易 接收外源ＤＮＡ状态的大肠杆菌，称为感原理
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+ Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+ Ca2+ Ca2+
DNA 分子
大肠杆菌
Ca2+ Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
DNA 分子
Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+
Ca2+ Ca2+
Ca2+
Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+