病原体分子诊断技术进展.共30页文档
病原体快速检测的新方法
病原体快速检测的新方法随着科技的不断进步和创新，病原体快速检测的新方法逐渐崭露头角，为医疗领域带来了革命性的变化。
新技术的应用使得病原体的检测速度大大提高，同时还能保证准确性和可靠性。
本文将介绍最近几年出现的一些新方法，展示它们在病原体检测方面的巨大潜力。
一、基于PCR的技术聚合酶链反应（PCR）是一种常用的病原体检测方法，它能够迅速扩增目标DNA序列并进行定量分析。
近年来，一些改进的PCR技术被应用到病原体的快速检测中，如实时定量PCR（qPCR）和数字PCR （dPCR）。
qPCR技术通过荧光信号的检测，能够实现对病原体DNA定量测定，其灵敏度和准确性显著提高。
相对于传统PCR技术，qPCR的周期数更少，检测时间缩短，同时还能实现多个目标的同时检测。
dPCR技术则是将DNA分割为许多微小的反应区，每个区域中只有一个复制DNA片段。
通过统计每个反应区的阳性和阴性结果，可以精确计算目标DNA的定量含量。
dPCR技术在低浓度目标样本检测中表现出更好的灵敏度和特异性。
二、快速质谱技术质谱技术作为一种高灵敏度的分析方法，近年来在病原体快速检测中得到了广泛应用。
其中，基于飞行时间质谱仪（TOF-MS）和串联质谱仪（MS/MS）的技术更是在病原体检测领域取得了突破性进展。
TOF-MS技术通过将样品中的分子离子加速到一定速度，并测量它们到达飞行时间质谱仪检测器的时间差，从而得到分析物的质量谱图。
该技术具有高通量、高分辨率且快速的特点，可以在几分钟内完成对数百个病原体的同时检测。
MS/MS技术则是通过将质谱仪与多级质谱仪相结合，进一步提高了病原体的检测灵敏度和特异性。
通过选择性地断裂和分离离子对，MS/MS技术能够实现对特定病原体成分的定量和鉴定，大大提高了病原体检测的准确性。
三、纳米技术的应用纳米技术作为一种前沿领域的科技，对病原体的快速检测也带来了新的希望。
近年来，纳米材料和纳米结构被广泛应用于病原体的诊断和监测。
分子诊断技术的研究现状与未来发展
分子诊断技术的研究现状与未来发展分子诊断技术：研究现状与未来发展随着生物技术和医学的快速发展，人们对于疾病的认知和诊治方式也发生了翻天覆地的变化。
在各种新技术中，分子诊断技术无疑是最引人注目的。
分子诊断技术不仅可以帮助医生精确定位疾病，提高诊断准确性和和治疗效果，还可以减少医疗误诊和漏诊，为人类的健康事业做出更大的贡献。
本文将探讨分子诊断技术的研究现状和未来发展趋势。
一、分子诊断技术的基本原理和分类分子诊断技术是指通过对细胞、组织、血液等样品中的生物大分子，如蛋白质、核酸、糖类等进行分析，诊断疾病的一种技术。
其中最常见的就是核酸检测技术。
在核酸检测技术中，我们通常采用PCR技术、基因芯片技术、荧光定量PCR技术、液相芯片技术、次世代测序技术、图案识别技术等方法进行检测。
这些方法可以检测出DNA序列中的基因突变、插入、缺失等信息，精确诊断出某些基因相关的遗传病和某些癌症。
此外，蛋白质检测也是分子诊断技术的重要组成部分。
蛋白质检测包括常见的免疫组化技术、基质辅助激光解析检测技术等。
免疫组化技术可以检测出一些激素、酶和细胞表面分子，基质辅助激光解析检测技术则可以检测出致病蛋白突变和蛋白质印迹。
二、分子诊断技术的研究现状分子诊断技术已经在临床医学中得到了广泛的应用，并且在日益扩展。
特别是在肿瘤的诊断和治疗中，分子诊断技术的地位越来越重要。
随着核酸和蛋白质检测技术的不断更新和进化，研究也得到了不断的开展和深入。
1、核酸检测技术方面PCR技术是目前应用最广泛、最为成熟的核酸检测技术之一。
但是在PCR技术中，因为目标序列和引物序列之间的相互作用影响引物的模板特异性，常会导致假阳性和假阴性的出现。
因此，近年来有许多新技术的出现，以解决PCR技术的问题。
如ligase chain reaction(LCR)技术、聚合酶链反应-限制性酶片段长度多态性(PCR-RFLP)技术等。
液相芯片技术作为新型的核酸检测技术，也得到了广泛的关注。
CRISPR-Cas系统在病原微生物分子诊断中的研究进展
㊃综述㊃D O I:10.3969/j.i s s n.1672-9455.2024.05.023C R I S P R-C a s系统在病原微生物分子诊断中的研究进展*龙文巧1,许永杰2综述,张华1,2ә审校1.遵义医科大学,贵州遵义563000;2.贵州省人民医院检验科,贵州贵阳550000摘要:快速㊁灵敏㊁准确的病原微生物检测方法对感染性疾病的诊治及防控至关重要㊂基于成簇规律间隔短回文重复序列(C R I S P R)-C R I S P R相关蛋白(C a s)系统的检测技术在病原微生物核酸检测中具有高灵敏度和高特异度的特点,该文概述了C R I S P R-C a s系统的作用机制及不同C a s的核酸酶活性,总结了基于C I S P R-C a s系统的检测技术在病原微生物核酸检测中的研究现状,对该系统在核酸检测应用中的挑战进行了综合分析,并提出了目前存在的一些解决方案㊂目前基于C R I S P R-C a s系统的非核酸分析物检测仍处于前期研究阶段,但其在扩大检测范围㊁缩短检测时间㊁提高检测灵敏度等方面具有较大潜力,为开发基于C R I S P R-C a s系统的病原微生物检测平台提供新思路㊂关键词:成簇规律间隔短回文重复序列-成簇规律间隔短回文重复序列相关蛋白系统;病原微生物;核酸检测;非核酸分析物检测;应用中图法分类号:R446文献标志码:A文章编号:1672-9455(2024)05-0687-06A d v a n c e s i n C R I S P R-C a s s y s t e m s-b a s e d m o l e c u l a r d i a g n o s i s o f p a t h o g e n i c m i c r o o r g a n i s m s*L O N G W e n q i a o1,X U Y o n g j i e2,Z HA N G H u a1,2ә1.Z u n y i M e d i c a l U n i v e r s i t y,Z u n y i,G u i z h o u563000,C h i n a;2.D e p a r t m e n t o f C l i n i c a lL a b o r a t o r y,G u i z h o u P r o v i n c i a l P e o p l e's H o s p i t a l,G u i y a n g,G u i z h o u550000,C h i n aA b s t r a c t:R a p i d,s e n s i t i v e a n d a c c u r a t e d e t e c t i o n o f p a t h o g e n i c m i c r o o r g a n i s m s i s c r i t i c a l f o r t h e d i a g n o-s i s,t r e a t m e n t,p r e v e n t i o n a n d c o n t r o l o f i n f e c t i o u s d i s e a s e s.B a s e d o n t h e h i g h s e n s i t i v i t y a n d s p e c i f i c i t y c h a r-a c t e r i s t i c s o f d e t e c t i o n t e c h n i q u e s o f c l u s t e r e d r e g u l a r l y i n t e r s p a c e d s h o r t p a l i n d r o m i c r e p e a t s(C R I S P R)-C R I S P R-a s s o c i a t e d p r o t e i n(C a s)s y s t e m s.T h i s r e v i e w s u mm a r i z e s t h e m e c h a n i s m o f C R I S P R-C a s s y s t e m, t h e n u c l e a s e a c t i v i t i e s o f d i f f e r e n t C a s a n d t h e r e s e a r c h s t a t u s o f C R I S P R-C a s d e t e c t i o n t e c h n o l o g y i n t h e d e-t e c t i o n o f p a t h o g e n i c m i c r o o r g a n i s m s.M o r e o v e r,t h e c h a l l e n g e s o f t h e C R I S P R-C a s s y s t e m i n t h e a p p l i c a t i o n o f n u c l e i c a c i d d e t e c t i o n a r e c o m p r e h e n s i v e l y a n a l y z e d,a n d s o m e e x i s t i n g s o l u t i o n s a r e p r o p o s e d.A t p r e s e n t, t h e d e t e c t i o n o f n o n-n u c l e i c a c i d t a r g e t s b a s e d o n t h e C R I S P R-C a s s y s t e m i s s t i l l i n t h e p r e l i m i n a r y r e s e a r c h s t a g e,b u t i t h a s g r e a t p o t e n t i a l t o e x p a n d t h e d e t e c t i o n f i e l d,s h o r t e n t h e d e t e c t i o n t i m e a n d i m p r o v e t h e d e t e c-t i o n s e n s i t i v i t y,w h i c h p r o v i d e s a n e w w a y f o r t h e d e v e l o p m e n t o f p a t h o g e n i c m i c r o b i a l d e t e c t i o n p l a t f o r m s b a s e d o n t h e C R I S P R-C a s s y s t e m.K e y w o r d s:C R I S P R-C a s s y s t e m;p a t h o g e n i c m i c r o o r g a n i s m s; n u c l e i c a c i d d e t e c t i o n; n o n-n u c l e i c a c i d a n a l y t e s d e t e c t i o n;a p p l i c a t i o n常见的病原微生物如病毒㊁细菌㊁真菌等引起的感染性疾病仍是危害人类健康的主要原因之一[1]㊂因此,快速㊁灵敏㊁准确㊁简便的检测方法对感染性疾病的诊断㊁疗效评估及预防控制具有重要意义㊂基于成簇规律间隔短回文重复序列(C R I S P R)-C R I S P R相关蛋白(C a s)系统的检测技术因具有高灵敏度㊁高特异度㊁快速㊁便携等优点而广泛应用于病原微生物的检测中[2]㊂1987年I S H I N O等[3]在大肠杆菌中首次发现了C R I S P R基因组,2005年H A F T等[4]鉴定了C a s的功能,随后P O U R C E L等[5]证明了C R I S P R-C a s系统是细菌抵抗噬菌体入侵的适应性免疫系统㊂目前C R I S P R-C a s系统除了应用于基因编辑技术外,还广泛应用于病原微生物核酸检测技术[6]㊂基于C R I S P R-C a s系统的核酸检测技术表现出高灵敏度㊁高特异度㊁快速等优点,可实现现场检测,在感染性疾病诊断方面具有巨大应用前景㊂同时,基于C R I S P R-C a s系统的核酸检测技术的进一步应用也存在许多挑战,这些挑战包括开发快速高效的核酸提取方式㊁简便的检测程序及高通量检测技术等[7]㊂随着基于㊃786㊃检验医学与临床2024年3月第21卷第5期 L a b M e d C l i n,M a r c h2024,V o l.21,N o.5*基金项目:国家自然科学基金项目(82160026)㊂ә通信作者,E-m a i l:780837482@q q.c o m㊂C R I S P R-C a s系统的核酸检测技术的发展,非核酸分析物的检测也成为当前研究热点[8]㊂本文概述了C R I S P R-C a s系统的作用机制和不同效应蛋白的核酸酶活性,综述了C R I S P R-C a s系统在病原微生物核酸检测中的应用研究进展和挑战,并进一步介绍了C R I S P R-C a s系统在抗原㊁血清学抗体㊁病原体等非核酸分析物检测方面的最新研究热点㊂1 C R I S P R-C a s系统概述C R I S P R-C a s系统由存储记忆的C R I S P R和C a s 基因组成,这两部分共同作用形成C R I S P R-C a s效应复合体,参与核酸识别㊁切割过程[4]㊂C R I S P R-C a s系统通过将外来噬菌体D N A储存到细菌宿主染色体中形成记忆,进而阻止噬菌体再次感染㊂C R I S P R-C a s 系统遵循免疫的3个主要阶段[9]:(1)适应㊂对外来核苷酸序列识别㊁处理后将间隔序列整合到C R I S P R 基因座中,由此存储首次感染的记忆㊂(2)C R I S P R R N A(c r R N A)成熟㊂间隔序列翻译成c r R N A和反式激活R N A通过碱基配对形成向导R N A(s g R N A),用于募集C a s㊂(3)干扰㊂C a s通过结合s g R N A形成效应复合物,在原间隔相邻基序(P AM)的协助下对靶标识别并切割,完成对外来核苷酸序列的特异性清除㊂不同的C a s具有不同的核酸内切酶活性,当前研究主要集中于C a s9㊁C a s12㊁C a s13㊁C a s14,C a s9结合s g R N A后特异性识别和切割靶标,通过对切割产物的分析实现靶标的检测[10]㊂而C a s12㊁C a s13㊁C a s14识别并结合c r R N A及靶标后形成效应复合体,该复合体可非特异性切割任意单链D N A或单链R N A,该过程被称为反式切割㊂此类蛋白反式切割大量带有标记的单链D N A或单链R N A报告探针,进而输出检测信号㊂基于C R I S P R-C a s系统的病原微生物检测技术可分为两类[11]:第1类是通过提取基因组,联合C R I S P R-C a s系统建立核酸检测方法;第2类是通过适配体或抗体识别非核酸分析物,直接或间接与C R I S P R-C a s系统联合,实现非核酸分析物的检测㊂2基于C R I S P R-C a s系统的病原微生物核酸检测基于C R I S P R-C a s系统的核酸检测技术常通过对样品中的微量核酸进行特异性识别和信号放大完成相关检测㊂目前,基于C R I S P R-C a s9/C a s13/ C a s12/C a s14系统的检测技术具有高特异度㊁高灵敏度㊁快速等特点,已被广泛应用于核酸检测中㊂基于C R I S P R-C a s9系统的检测技术依赖于该系统识别及切割双链D N A(d s D N A)的能力,用于病原微生物的核酸检测㊂P A R D E E等[12]将基于C R I S P R-C a s9及含有激发序列的t o e h o l d传感器联合依赖核酸序列的扩增(N A S B A)方法开发一种显色纸片检测技术,建立了可视化检测寨卡病毒检测技术,该技术通过比色法输出检测信号,检测灵敏度可达3f m o l/L,能鉴别美洲和非洲寨卡病毒株,且不需要昂贵的设备㊂但N A S B A需要3种酶使得反应成本较高,反应成分较复杂,检测时间较长㊂选择合适的核酸扩增方法对提高检测平台的综合检测性能至关重要㊂此外,去核酸酶活性的C a s9(d C a s9)保留了d s D N A的结合能力,对目标核酸序列无切割活性,也可用于核酸检测㊂H A I J I A N等[13]开发了C R I S P R芯片(C R I S P R-C h i p)技术,该技术将d C a s固定于石墨烯电子晶体管,在s g R N A辅助下,加入目标d s D N A后在晶体管上形成d C a s-s g R N A-d s D N A复合物,该复合物会改变晶体管电导率,可根据电导率变化得出检测结果㊂C R I S P R-C h i p技术无须对靶标进行检测前扩增,可直接检测到1.7f m o l/L的目标d s D N A,耗时15m i n㊂C a s9和d C a s9常用于核酸检测,但此类技术的信号放大及输出过程较复杂㊂C a s12a㊁C a s13a㊁C a s14等具有反式切割活性的发现为开发更简便㊁快速㊁精准的基于C R I S P R-C a s系统的检测平台提供更多可能㊂基于C R I S P R-C a s12/C a s13/C a s14系统的检测技术通常利用C a s的反式切割活性直接切割带标记的检测探针,从而产生各种信号(如荧光㊁比色㊁电化学等),直接㊁快速地获得较高的检测灵敏度㊂K E L L-N E R等[2]将重组酶聚合扩增技术(R P A)联合C R I S P R-C a s13a系统,建立了S H E R L O C K技术㊂该技术通过切割淬灭的荧光报告探针放大和输出检测信号,在寨卡病毒检测中可达到单碱基分辨率,并极大地提高了检测的灵敏度㊂此外,C a s12a同样具有强大的反式切割活性,C H E N等[14]将C R I S P R-C a s12a 系统联合R P A开发了D E T E C T R技术㊂S H E R-L O C K及D E T E C T R技术具有高灵敏度㊁高特异度和快速等优点,并为开发更多新的基于C R I S P R-C a s 系统的检测技术提供基础㊂但此类技术有两步反应,增加了检测过程中被污染的风险,进一步的研究可通过将核酸扩增过程与C R I S P R检测过程整合于单一反应体系中进而降低检测过程被污染的风险㊂基于C R I S P R-C a s系统的检测技术在实际应用中面临着复杂的核酸提取方式和检测程序,以及难以实现对单一c r R N A及C a s进行多重靶标检测等挑战,这些挑战限制了新技术在实际样本检测中的应用㊂3病原微生物核酸检测的挑战基于C R I S P R-C a s系统的病原微生物核酸检测在临床应用上面临需开发简易的核酸提取方法,简化检测程序,建立多重检测平台等诸多挑战[7],笔者进一步讨论了目前的一些解决方案㊂3.1核酸提取的简化简化核酸提取过程仍然是快速核酸检测技术发展的主要瓶颈,因此需要开发快速高效的核酸提取方法促进基于C R I S P R-C a s系统的检测技术的应用㊂MY H R V O L D等[15]建立了样本加㊃886㊃检验医学与临床2024年3月第21卷第5期 L a b M e d C l i n,M a r c h2024,V o l.21,N o.5热消除核酸酶非提取(HU D S O N)技术,将HU D S O N 与S H E R L O C K技术联合,在提取和纯化D N A或R N A的情况下裂解病毒,可以直接从临床样本中检测病毒核酸,极大地简化了操作步骤,降低了气溶胶污染的风险㊂然而,HU D S O N技术缺乏纯化和浓缩核酸的步骤,可能会降低检测复杂样本中目标核酸的能力㊂纳米材料和技术可以通过简便的工艺从复杂样品中提取目标核酸㊂纳米级的隔离膜具有较大的比表面积,R O D R I G U E Z等[16]开发了基于纸张核酸扩增的流控芯片技术,该技术使用的隔离膜通过静电作用和氢键结合力将高盐溶液中的目标核酸快速㊁高效地分离,使吸附在膜上的核酸保持稳定的结合,通过环介导等温扩增(L AM P)技术在原位扩增,实现目标序列的富集㊁纯化和扩增,完成从样品到结果的集成检测㊂目前,芯片上的等温放大步骤需要外部热源,该技术使用加热模块来辅助等温扩增,因此,若在基于纸张的微流控检测平台中整合一个集成的加热系统将大大加强其便携性㊂3.2检测过程的简化大多数基于C R I S P R-C a s系统的检测技术仍然使用标准的两步检测法,此类方法增加了检测的时间和检测过程中交叉污染的风险,这促使研究者开发单管检测策略㊂常规两步检测法首先利用核酸扩增技术提高靶标的浓度,再联合C R I S P R-C a s系统产生放大的检测信号[2]㊂但核酸扩增技术扩增靶标的同时,还增加了非特异性扩增的风险,故研究者们开发了无须靶标扩增的超灵敏的检测方法㊂3.2.1单管检测策略基于C R I S P R-C a s系统的单管检测技术将核酸扩增和C R I S P R-C a s系统反应整合于一个缓冲体系,用于快速现场检测㊂单管检测是在反应管底部添加核酸扩增试剂,在反应管盖上也添加C a s12a和c r R N A试剂,反应管底部的核酸扩增完成后,将预先加在管盖上的C a s12a和c r R N A试剂通过离心移至管底,使C a s12a和c r R N A试剂与扩增子混合,实现在1管内完成扩增和检测,避免了气溶胶污染[17]㊂但此技术先进行靶标扩增再将扩增产物与C R I S P R-C a s系统反应,检测时间较长㊂因此,研究者们将靶标的扩增与C R I S P R-C a s系统整合于一个缓冲系统中同时进行反应,缩短了检测时间㊂根据核酸扩增步骤和C R I S P R-C a s系统反应的温度偏好, J O U N G等[18]将L AM P介导的核酸扩增反应(55~ 65ħ)与耐高温的C a s12b(31~59ħ)集中于一管中同时完成核酸扩增与信号检测,建立了单管检测技术㊂该技术不但降低了交叉污染的风险,还明显缩短了检测时间㊂同样,该技术的核酸扩增过程也需要加热,未来的研究可通过开发集成加热系统,进一步简化工作流程,进而在不同环境下均可进行相关核酸检测㊂3.2.2无扩增检测策略无核酸扩增步骤的检测策略具有快速㊁避免非特异性扩增㊁不易产生交叉污染等优势,但可能会造成检测灵敏度下降㊂为解决灵敏度下降这一问题,研究者们通常使用超灵敏信号报告系统㊁信号级联放大技术,以及微小体积等方式提高灵敏度[13]㊂首先,电化学传感器㊁金属纳米材料㊁高性能的表面增强拉曼散射技术等可放大来自C R I S P R-C a s系统的微弱信号,超灵敏地检测低浓度靶标㊂其次,因实验中C R I S P R-C a s系统反应速率与C a s-c r R N A复合物的数量呈正比,基于C R I S P R-C a s系统的检测用多个C a s-c r R N A复合物直接靶向目标序列的不同位点,通过加快信号积累速率,在更短的时间内达到检测信号阈值[19]㊂此外,根据C a s的反式切割活性与底物浓度呈正比的原理,空间限制检测体系可浓缩底物进而提高检测灵敏度[20]㊂不同无扩增策略的组合可提高检测的灵敏度㊂基于C R I S P R-C a s系统的无扩增数字R N A检测技术通过采用多个C a s13a-c r R N A复合物靶向多个位点在空间限制体系(反应体积减小到n L水平)中检测新型冠状病毒(S A R S-C o V-2),检测限为5f m o l/L,耗时5m i n[21]㊂因此,合理整合上述策略可以实现无扩增㊁快速㊁灵敏的靶标检测㊂但由于缺乏靶标扩增步骤,用来增加灵敏度的策略可能会增加检测方法的复杂性和费用,在选择或设计检测方法时,必须综合考虑这些策略的优缺点㊂3.3多重检测多重检测可以提高诊断效能,实现大规模样本的高通量检测㊂G O O T E N B E R G等[22]利用P s m C a s13b㊁L w a C a s13a㊁C c a C a s13b和C a s12a分别切割富含特定核苷酸序列的报告探针,实现了四重检测㊂但在该检测方法中,C a s的反式切割可能会产生信号重叠以降低检测的特异度,且该技术涉及较多的蛋白质种类,导致检测成本较高㊂因此,一种通过D N A阻断剂调控C a s反式切割活性的检测方法以单一蛋白实现了多重靶标的检测一定程度上降低了检测成本㊂H A N等[23]开发了一种基于C a s12a-D N A 阻断剂的多重检测(C A S T I)技术㊂C A S T I可以通过联合R P A扩增靶标,以一种C a s实现人乳头瘤病毒(H P V)16和H P V18基因的检测,检测限为1a m o l/L㊂该多重检测平台有助于在设备有限的条件下进行病原微生物的检测㊂然而,与检测人工合成的D N A靶标相比,该技术在细胞系和临床样本中检测目标D N A的效率较低,因此,需要进一步优化实验条件以避免样本中其他D N A或R N A的干扰㊂此外,A C KE R MA N等[24]将核酸多重评估的组合排列反应(C A R M E N)联合C R I S P R-C a s13a系统,开发一种多通道检测方法(C A R M E N-C a s l3)㊂C A R M E N-C a s l3已可同时检测169种人类病毒,还能区分多种㊃986㊃检验医学与临床2024年3月第21卷第5期 L a b M e d C l i n,M a r c h2024,V o l.21,N o.5亚型的流感病毒,检测时间为5m i n㊂C A R M E N-C a s13的灵敏度和特异度可与S H E R L O C K技术匹配,这对病原微生物高通量检测及流行病学研究至关重要㊂该技术可检测来自不同人群的数千份样本,需要专业人员对检测结果进行仔细分析解释㊂该技术若能与移动电话应用程序连接将直接读出检测结果,会有更大的应用潜力㊂4基于C R I S P R-C a s系统相关的病原微生物非核酸分析物检测病原微生物及其抗原和血清学抗体等非核酸分析物往往在发病早期和治疗开始后以低浓度出现㊂灵敏和可定量的基于C R I S P R-C a s系统的检测技术有助于发现早期病变和准确评估疾病疗效[25]㊂近年来,基于C R I S P R-C a s系统的检测技术已用于检测多种类型靶标,包括病原体㊁抗原㊁血清学抗体等㊂4.1基于C R I S P R-C a s系统相关的病原微生物直接检测基于C R I S P R-C a s系统的病原微生物直接检测常通过抗体或适配体识别致病菌,再与C R I S P R-C a s系统联合放大检测信号,实现免培养㊁免提取的病原微生物直接检测㊂基于抗体的检测方法利用抗体对靶细菌识别,通过免疫夹心法联合C R I S P R-C a s12a 系统输出检测结果㊂D U A N等[26]开发了一种基于C R I S P R-C a s12a系统引导㊁无D N A提取和扩增㊁可快速直接检测病原体的生物传感器(C A T C H E R)㊂C A T C H E R通过免疫夹心结构(标记鼠伤寒抗体的磁珠㊁靶细菌㊁标记鼠伤寒抗体和D N A核酸内切酶Ⅰ的胶体金),经磁分离后巧妙地利用D N A核酸内切酶Ⅰ将溶液中单链D N A激活探针降解为短寡核苷酸,改变C R I S P R-C a s12a系统生物活性,进而输出检测结果,检测限为7.9ˑ101C F U/m L㊂该方法为非核酸分析物的检测提供了一个通用平台㊂相比价格较贵的抗体识别方法,适配体识别方法成本较低且步骤更简便㊂基于适配体的方法,研究者通常识别适配体靶标后释放一个D N A或R N A激活探针用于激活C R I S P R-C a s系统,进而完成信号的放大及输出㊂S H E N等[27]开发了将核酸变构探针(A P)与C R I S P R-C a s13a系统联合的A P C-C a s检测方法㊂该方法通过A P识别靶细菌后暴露引物结合位点,引物在D N A聚合酶和T7启动子作用下进行D N A序列的延伸和转录,产生大量单链R N A激活探针及C R I S P R-C a s13系统,通过荧光信号输出结果㊂该技术可快速㊁直接㊁定量检测各种样本中肠炎单胞菌数(1~ 105C F U/m L)㊂以上病原微生物直接检测技术省去了检测前核酸提取和扩增步骤,明显缩短了检测时间㊂4.2基于C R I S P R-C a s系统相关的病原微生物抗原检测病原微生物抗原与致病力密切相关,抗原检测也是传染性疾病诊断的主要方式之一㊂基于C R I S P R-C a s系统的检测技术检测抗原时大多需利用适配体识别抗原后将抗原转化为核酸信号,联合C R I S P R-C a s系统放大检测信号,实现抗原快速检测㊂生物毒素是细菌产生的一类重要抗原,会引起人类急性中毒㊁致癌或致畸等,生物毒素的检测有助于评估细菌感染严重程度和预防毒素引发的休克㊂A B-N O U S等[28]利用核酸适配体联合C R I S P R-C a s12a系统识别黄曲霉毒素M1(A F M1),开发了简便㊁高效的抗原检测技术㊂在添加了A F M1的牛奶样品中,该技术在0.5~50.0n g/L呈现出较宽的线性关系㊂该技术利用比色法,通过颜色的变化输出检测结果,不需要昂贵设备,信号输出方式简便,便于现场检测,但比色这一信号输出方式灵敏度相对较低㊂研究者可探索使用包括金属有机框架在内的新型纳米材料来提高传感器的灵敏度㊂此外,病毒抗原往往决定了病毒的宿主㊁组织嗜性及其致病的能力,也成为检测的重要靶标㊂通过适配体联合C R I S P R-C a s12a系统,研究者建立了S A R S-C o V-2抗原的电化学检测平台[29],实现核衣壳蛋白的检测㊂与常规抗原检测法相比,基于C R I S P R-C a s系统的抗原检测技术提高了抗原检测的特异度和灵敏度,并可对抗原进行定量检测㊂4.3基于C R I S P R-C a s系统相关的病原微生物抗体检测抗体检测在疾病诊断㊁疗效评估和流行病学调查中具有重要意义㊂B A R B E R等[30]建立了C R I S P R-C a s9系统介导的自组装固定肽(P I C A S S O)技术㊂P I C A S S O技术通过将能与靶分子特异性结合的重组肽段与d C a s9融合形成复合物,利用s g R N A引导该复合物与微阵列表面上特定位置的D N A进行自组装,构建D N A-蛋白质微阵列,用于检测不同抗体㊂P I C A S S O技术能快速识别样本中的上千种抗体,实现了病原微生物血清学抗体快速高通量检测㊂P I C-A S S O技术已被用于检测新型冠状病毒感染(C O V-I D-19)恢复期患者血清S A R S-C o V-2的抗体㊂但该技术难以避免非特异性背景信号,未来的研究可通过改变微阵列表面寡核苷酸的间距密度及d C a s9与其融合蛋白之间的连接长度等进一步优化实验条件,提高检测特异度㊂5总结与展望基于C R I S P R-C a s系统的检测技术在病原微生物核酸和非核酸靶标的检测中迅速发展,实现对超低浓度样品的精确㊁灵敏检测㊂本文归纳了基于C R I S P R-C a s系统的检测技术的构建和应用,讨论了该技术目前存在的挑战及可能的解决办法,进一步阐述了基于C R I S P R-C a s系统的检测技术在病原微生物非核酸分析物检测方面的最新研究热点㊂核酸靶标的检测通过开发简易的核酸提取方法,简化检测程㊃096㊃检验医学与临床2024年3月第21卷第5期 L a b M e d C l i n,M a r c h2024,V o l.21,N o.5序,建立多重检测平台等方式提高了检测性能㊂非核酸靶标的检测则需通过适配体㊁抗体及其他方式将靶标转换成核酸信号进一步完成检测,在病原微生物检测领域展现出了更广阔的应用前景㊂尽管C R I S P R-C a s系统在病原微生物检测中具有各种优势,但仍有一些挑战需要克服㊂(1)靶基因片段选择的局限性㊂C R I S P R-C a s系统在C a s锚定目标序列时依赖于P AM,在选择检测的靶基因片段时存在一定的局限性㊂(2)c r R N A和单链D N A㊁单链R N A报告探针在添加R N A酶抑制剂的临床复杂样本中仍存在降解风险㊂(3)C a s存在一定的背景活性,不同批次的背景活性不同,导致样品检测结果不同㊂基于C R I S P R-C a s系统的检测技术在临床应用上具有巨大的潜力㊂基于C R I S P R-C a s系统的检测技术与人工智能相结合,可以促进感染性疾病的早期诊断,直接向卫生专家甚至普通人群发出警报㊂此外,基于C R I S P R-C a s系统技术的检测结果可以通过移动电话应用程序连接到云数据进行分析和储存,可用于构建医疗大数据分析平台,为临床诊疗及科学研究提供有力证据㊂C R I S P R-C a s系统现在能够检测的不仅是基因组材料,还有望扩展到更多领域㊂除病原微生物及其抗原和血清学抗体等非基因组目标外, C R I S P R-C a s系统在癌症生物标志物㊁人体样本罕见突变㊁食品水样污染检测㊁植物病原微生物检测等领域的新应用仍有待进一步探究㊂参考文献[1]D I L N AWA Z F,A C HA R Y A S,K A N U N G O A.A c l i n i c a lp e r s p e 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临床医学中的感染性疾病诊断与治疗进展
临床医学中的感染性疾病诊断与治疗进展感染性疾病作为临床医学领域的一个重要方向，一直以来都备受关注。
随着科技的不断发展，感染性疾病的诊断与治疗也在不断进步与完善。
本文将从以下几个方面进行论述，探讨临床医学中感染性疾病诊断与治疗的最新进展。
一、病原体检测技术的发展准确快速的病原体检测是感染性疾病的关键。
传统的病原体检测方法主要依赖于细菌培养和荧光抗体技术，但这些方法存在培养时间长、检测结果需综合考虑的问题。
随着分子生物学的迅猛发展，一些新的技术应运而生。
比如PCR技术，该技术通过扩增病原体特异性基因，可以在数小时内得到结果。
此外，还有基因芯片、质谱等技术的应用，进一步提高了病原体检测的准确性和敏感性。
二、抗感染药物的筛选与研发由于细菌等病原体对抗感染药物的耐药性不断增强，传统的抗感染药物已经难以满足临床需求。
因此，寻找新的抗感染药物成为迫切任务。
目前，很多研究团队正在利用高通量筛选技术，寻找新的抗感染药物靶点。
另外，一些新型药物如肽类抗菌剂、抗生素靶向疗法等也在临床上取得了一定的突破。
这些新的抗感染药物不仅具有更好的耐药性，还能降低抗生素的副作用，提高治疗效果。
三、个体化治疗的应用个体化治疗是近年来发展起来的一种新理念，即根据患者的个人情况制定最佳的治疗方案。
在感染性疾病的治疗中，个体化治疗已经开始得到广泛应用。
传统上，对于感染性疾病的治疗，一般采取广谱抗生素的经验选择。
然而，个体化治疗将根据患者的细菌谱、药物代谢能力等个人特征，制定更加精准的个体化治疗方案。
这种针对性的治疗可以提高治疗效果，同时减少抗生素的滥用。
四、病原体耐药性的监测与预警病原体的耐药性是目前感染性疾病治疗的一个重要难题。
为了更好地解决这个问题，临床医学界开展了病原体耐药性的监测与预警工作。
通过对患者病原体进行耐药性检测，可以及早发现并控制患者耐药菌的传播。
此外，全球范围内建立的耐药性监测和预警系统，可以提供给临床医生有关耐药性发生和发展的最新信息，帮助医生做出更明智的治疗选择。
分子诊断及其临床应用
总结词
通过分子诊断技术，对遗传性疾病进行早期筛查和预 防，降低疾病的发生率和危害。
详细描述
利用基因检测技术，检测遗传性疾病相关基因突变， 为有遗传性疾病家族史的人群提供早期筛查服务。通 过早期筛查，及时发现潜在风险，采取相应的预防措 施，降低遗传性疾病的发生率和危害。
案例三：病毒检测在疫情防控中的作用
高灵敏度与特异性
分子诊断技术能够检测到极低浓度的病原体 或异常基因，提供更准确的诊断结果。
早期诊断
分子诊断有助于在疾病早期发现，从而提高 治愈率，降低治疗成本。
个性化治疗
通过对基因突变等进行检测，为患者提供更 个性化的治疗方案。
监测治疗效果
实时监测患者体内病原体或异常基因的变化 ，指导调整治疗方案。
详细描述
基因芯片技术利用微阵列技术将大量基因探 针固定在硅片、玻璃片或聚合物薄膜等固相 支持物上，通过与标记的样本进行杂交，检 测出样本中与探针互补的核酸序列。基因芯 片技术可应用于基因表达谱分析、单核苷酸 多态性检测、基因组测序等方面，具有高通
量、词
生物信息学分析是通过计算机技术对生物学数据进行分析和挖掘，以揭示生命现象的本 质和规律。
分子诊断及其临床应用
汇报人：可编辑 2024-01-10
目录
• 分子诊断概述 • 分子诊断技术 • 分子诊断在临床应用中的优势与挑战 • 分子诊断在常见疾病中的应用 • 分子诊断的伦理和社会影响 • 案例研究
01 分子诊断概述
定义与特点
定义
分子诊断是指利用分子生物学技术， 对生物样本进行检测和分析，以评估 和预测疾病状态、进程和治疗效果的 方法。
要点一
总结词
要点二
详细描述
利用分子诊断技术，快速、准确地检测病毒，为疫情防控 提供有力支持。
疾病分子诊断技术的探究
疾病分子诊断技术的探究随着医学技术的不断发展，疾病诊断和治疗方式也在不断更新。
疾病分子诊断技术是其中之一，它利用在生化反应和生命过程中起重要作用的分子来诊断疾病。
本文将探究疾病分子诊断技术的发展、工作原理和应用前景。
一、疾病分子诊断技术的发展疾病分子诊断技术最初的起源要追溯到上个世纪50年代的电泳法。
当时研究人员使用电泳法分离和检测DNA等分子，这标志着疾病分子诊断技术的萌芽。
以后，随着细胞基因组学、蛋白质组学、代谢组学等技术的发展，疾病分子诊断技术也得到了迅速发展。
目前最常用的疾病分子诊断技术是聚合酶链式反应技术（PCR）和基因芯片技术。
二、疾病分子诊断技术的工作原理疾病分子诊断技术的工作原理是通过检测疾病相关分子的数量和类型来诊断疾病。
以PCR技术为例，PCR是一种体外人工合成DNA的技术，它可以放大极少量的DNA分子至足够检测的水平。
它的基本原理是利用DNA聚合酶在一系列循环反应中，复制特定DNA序列。
PCR技术可以在短时间内产生大量DNA分子，从而能够对DNA进行检测和分析。
基因芯片技术是另一种疾病分子诊断技术。
它是一种高通量技术，可以同时检测成千上万个基因，从而避免重复操作和提高检测效率。
其基本原理是先将DNA分子或基因片段定位在芯片上，然后在此基础上进行分析和检测。
除了基因芯片，代谢组学和蛋白质组学也是常用于疾病分子诊断的技术。
三、疾病分子诊断技术的应用前景疾病分子诊断技术在许多疾病的诊断、治疗和研究中都得到了广泛的应用。
这些技术因其快速、准确、灵敏和可靠的特点而受到专业医生和研究人员的认可，并逐渐成为医学、药物开发和疾病控制领域中重要的工具之一。
例如，PCR技术可以检测各种感染病原体，如病毒、细菌和真菌等，从而帮助医生确定感染的类型和选择适当的治疗方案。
基因芯片技术可以检测肿瘤相关的基因变异，从而帮助医生确定肿瘤的类型和治疗方案。
代谢组学和蛋白质组学可以检测人体生物分子的含量和代谢状态，从而帮助医生预测疾病风险和制定个性化治疗方案。
分子生物学检验技术在医学检验中的应用进展
1引言分子生物学检验是分子生物学技术在临床检验诊断应用中发展起来的，以疾病为中心、以生物分子标志物为靶标的新一代临床检验诊断技术，可以实现对微量生物样本、微量生物分子及其微小变化的快速检验，成为疾病风险分析和早期诊断的重要手段[1]。
2分子生物学检验应用的主要技术①聚合酶链式反应（PCR）是一种在生物体细胞外通过酶促合成特异DNA片段的方法，又称多聚酶链反应。
该技术突破了以往在科学研究和检验诊断中不易获得丰富的样品靶DNA序列的缺陷。
在目前的临床分子生物学中，PCR技术已广泛应用于寄生虫学、微生物学、肿瘤学、遗传学、免疫学、基因治疗、食品检测、出入境检验检疫等诸多领域[2]，并以PCR 技术为基础衍生出了其他技术，如PCR-限制性片段长度多态性分析法是检测与特定的酶切位点有关突变的方法；等位基因特异性PCR技术可以进行基因型鉴定；PCR-单链构象多态性技术可以揭示产物序列内的多态性；实时荧光“定量聚合酶链反应，定量PCR”可以对目的DNA进行定量，更加准确和方便。
②生物芯片技术代表高通量密集型的技术，主要依据芯片上固定的探针（基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片）地不同，能够一次性地对大量的生物分子进行检测。
如基因表达谱、突变测定、多态性分析、基因组文库、杂交测序等[3]。
在临床诊断、科学研究和流行病学筛选中具有广泛的应用前景。
③分子生物传感器是一种对生物物质敏感并可以将其浓度转换为电信号进行检验的仪器，是以固定化的生物分子作为识别原件与适当的理化换能器以及信号放大器装置构成的一整套分析系统。
分子生物传感器可以广泛地应用于人体体液中一些小分子有机物、生物大分子等多种物质的检验检测中。
这些项目都为病情的诊断、职业环境的监测提供了可靠的分析数据[4]。
④DNA测序技术可以为临床疾病的分子诊断提供最精确的判定依据。
第一代测序以双脱氧末端终止法为主，缺点是费用高、速度慢。
第二代测序以焦磷酸测序、合成测序和芯片测序三大技术平台为代表，使DNA测序进入了通量高、成本低、规模大的时代。
分子诊断发展简史
分子诊断发展简史：一场由“螺旋双杰”引发的发明分子诊断发展四阶段第一阶段：利用分子杂交技术进行遗传病基因诊断：通过婴儿胚胎期进行产前诊断，超早期预知某些疾病发生、发展和预后。
1978年著名没计划以科学家简悦威等应用液相DNA 分子杂交成功进行了镰形细胞贫血症的基因诊断。
第二阶段：以PCR为基础的分子诊断：PMullis发明PCR技术后迅速发展，标志着传统基因诊断发展到更全面的分子诊断技术。
第三阶段：以生物芯片技术为代表的高通量检测技术：1992年美国Affymetrix制作出第一章基因芯片，标志着分子诊断进入生物芯片技术阶段。
生物芯片技术解决了传统核酸印迹杂交技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、低通量的问题。
第四阶段：以NIPT为代表的第二代测序技术：Ronaghi分别于1996年与1998年提出了在固相与液相载体中通过边合成边测序的方法-焦磷酸测序。
目前常见的高通量第二代测序平台主要有Roche454、IlluminaSolexa、ABISOLiD和LifeIon Torrent等，其均为通过DNA 片段化构建DNA文库、文库与载体交联进行扩增、在载体面上进行边合成边测序反应，使得第1代测序中最高基于96孔板的平行通量扩大至载体上百万级的平行反应，完成对海量数据的高通量检测。
1代、2代测序区别分子诊断三座丰碑1953年，沃森和克里克发现了DNA双螺旋的结构，开启了分子生物学时代，使遗传的研究深入到分子层次，“生命之谜”被打开，人们清楚地了解遗传信息的构成和传递的途径。
在以后的近50年里，分子遗传学、分子免疫学、细胞生物学等新学科如雨后春笋般出现，一个又一个生命的奥秘从分子角度得到了更清晰的阐明。
DNA双螺旋结构的出现时分子生物学行程的重要标志，对人们认识蛋白质合成、DNA复制和突变具有重要意义，为分子诊断的蓬勃发展奠定基础。
“DNA之父”Wa tson、Crick50年前，科学界的“八大恶棍”之一凯利•穆利斯还只是美国某制药公司的小职员，整天做着把先天致病基因给剔除掉的白日梦，然而先要复制DNA，才有足够的时间慢慢修复。