BM—cycline 去除支原体
支原体清除实验
支原体清除实验支原体污染是细胞培养过程中的常见现象。
细胞被支原体污染之后，在显微镜下无法直接观察到，生长状态可能发生或不发生改变，因此一般不易被察觉。
但是支原体会改变细胞的很多生长参数，因而极易对后续实验造成影响，所以对支原体污染的检测和清除非常重要。
以下为一次支原体检测和清除的实例。
材料：细胞系：SH-SY5Y支原体PCR检测试剂盒：Myco-P-20 (上海炎熙生物 )支原体清除剂：Myco-E-1 (上海炎熙生物 )方法与结果：1，将已检测出有支原体污染的SH-SY5Y细胞以正常传代密度铺到6孔板中，一个孔加清除剂，作为测试孔，另一孔不加清除剂，作为阴性对照孔。
两孔之间间隔一个孔，以免互相污染。
2，在清除支原体的过程中细胞以常规方法传代培养，并使细胞在培养过程中一直处于清除剂的作用下。
在加清除剂后第4、8、9、11天各取1毫升培养上清。
每份上清与细胞已共培养48小时，除第9天的上清只共培养了24小时。
3，将这些培养上清在16000g离心5分钟，小心去除离心上清，将沉淀用无菌PBS洗三次，每次以16000g离心5分钟。
最后获得的沉淀用100微升纯水重悬，在100℃水浴中孵育5分钟，然后用于PCR反应。
4，按照支原体检测试剂盒Myco-P-20的说明书进行PCR检测操作，结果如下：4.1，与对照样品共同反应，用这种方式可以判断是否出现了假阴性结果。
在加清除剂后第4天的样品中仍可见到支原体阳性条带（约440bp），在第8、9、11天的样品中，已看不到支原体阳性条带。
4.2，不加对照样品，检测样品单独反应，用这种方式可以提高测试灵敏度。
可见在第8天和第9天的样品中，支原体阳性条带仍然出现，但是弱于第4天的样品。
在第11天的样品中，有明显的200bp以下的非特异的条带，且亮度高于阳性条带，所以判断此时的PCR产物是非特异反应的产物，样品中已没有支原体DNA。
注释：由于PCR是一种非常灵敏的检测方法，所以很容易出现假阳性条带。
《支原体清除试剂》使用说明书
5) 以后每隔 1 个月进行支原体的常规检测，以保证没有新的支原体污染。
注意事项
根据细胞污染情况，一个疗程是 7-15 天检测一次，如果检测之后发现没有支原体污染，还 建议试用对半浓度继续维持 15 天，最后撤掉。由于我们支原体清除试剂对细胞生长几乎没 影响，可以重复添加，对于实验室环境比较不受控的情况，建议重复添加以预防。
《支原体清除试剂》使用说明书
关于支原体
支原体（Mycoplasma）是一种没有细胞壁的原核生物，大小约 0.1 - 0.6 微米。目前， 已发现的支原体品种有 100 多种。 由于支原体直径较小，经常可以穿过实验室常规的 0.20 微米孔径的除菌滤膜，高压过滤时，甚至可以穿过 0.10 微米孔径的除菌滤膜，造成细胞的 支原体污染。
科佰产品
货ห้องสมุดไป่ตู้ CBP50044
名称 支原体清除试剂（1000x）
规格 1ml
价格 900.00
货期 现货
产品用途
该产品专用于消除那些被支原体和某些无细胞壁的细菌感染的细胞系。在小型或大型 细胞培养中，也可以直接添加到液体培养基中来预防支原体及常见的细菌污染。该产品仅 用于基础研究，非临床用品。
运输和储存
细胞培养的支原体污染来源主要有：（1）细胞之间的交叉污染，这是支原体污染的最 主要原因；（2）细胞培养操作人员的口腔、皮肤等。（3）细胞培养用的组分，如血清、培 养液等；
解脲支原体MB蛋白金标检测试剂盒(胶体金法)
解脲支原体MB蛋白金标检测试剂盒（胶体金法）
解脲支原体MB蛋白金标检测试剂盒（胶体金法）按2005版《医疗器械分类目录》，属临床医学检验辅助设备（6840）。
管理类别为Ⅱ类。
产品简介如下：
1结构组成
1.1产品结构
解脲支原体MB蛋白金标检测试剂盒由检测卡、检测条、样品稀释液、阳性对照液、阴性对照液等组成。
1.2检测卡
由检测条和聚苯乙烯塑料外壳制成。
1.3检测条
由已包被了检测线和对照线的硝酸纤维素膜、化学偶合物膜、样品吸收膜，胶纸等部分经层压而成，再分切成固定宽度的条状。
1.4样品稀释液
分为A液和B液、均为无色透明液体。
1.5阳性对照液
为含灭活支原体的无色透明液体。
1.6阴性对照液
为含一定浓度人尿蛋白的无色透明液体。
2主要原材料
解脲支原体单克隆抗体：为两株纯化的高亲和力的抗解脲支原体单克隆抗体，一株用于胶体金标记，另一株用于包被硝酸纤维素膜。
金标检测条：由S1—S7部分构成：
S1选用亲和性高分子纤维素膜，经预先处理后制备成反应膜用来显示整体系统的反应结果；
S2、S3选用可使液体爬行速度较快，吸附力较强的粗纤维吸水纸或无纺布，其作用在于被粘贴在反应体的不同部位吸收待检样品标本；
S4同样选取吸附力较强的无纺布，作为金标记抗体的固相吸附材料；
S5为不同规格的双面胶，用于固定各种反应膜和吸水材料于S7上；
S6塑料基板，作为测试条反应体的支撑物；。
支原体的清除
资料来源：生物通
支原体的形态结构
支原体的体形多样，基本为球形，亦可呈球杆状或丝 状，其菌落呈针尖大小，故又称之为微小支原体。结构比较 简单，没有细胞壁，只有三层结构的细胞膜，故具有较大的 可变性。 支原体的大小为0.2～0.3um,可通过滤菌器。革兰氏染 色不易着色，故常用Giemsa染色法将其染成淡紫色。细胞 膜中胆固醇含量较多，约占36%，对保持细胞膜的完整性具 有一定作用。凡能作用于胆固醇的物质（如二性霉素B、皂 素等）均可引起支原体膜的破坏而使支原体死亡。
资料来源：生物通
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支原体的致病性
很多支原体能够致病。 肺炎：肺炎支原体（M. Pneumonia）。 泌尿生殖道感染：人型支原体（M. humenis，MH）、 解脲支原体（Ureaplasma urealyticum，UU）和生殖 器支原体（M. genitalium，MG）。 关节炎：M. fementans, M. arthritidis 中枢神经：肺炎支原体（M. Pneumonia） 心脏：肺炎支原体（M. Pneumonia）
• 不能断定种类，
• 需要有经验
资料来源：生物通
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荧光染色法
处理
未处理
23 清华资料
支原体污染检测的方法
培养法： • 培养基及培养条件要求严格；
• 不同种类的培养条件不一致；
• 特别费时（1~4周）； • 分析困难； • 肉汤培养和平皿培养均行； • 优点：仅检查活支原体；
• 敏感度：1 CFU -> 30 GU。
资料来源：生物通
8
支原体的培养特性
支原体可在鸡胚绒毛尿囊膜上或细胞培养中生长。用培养基培养时， 营养要求比一般细菌高，除基础营养物质外还需加入10～20%人或动物血 清以提供支原体所需的胆固醇。最适pH7.8～8.0之间，低于7.0则死亡， 但解脲脲原体最适pH6.0～6.5。
细胞支原体污染清除方法比较及清除后的应用
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及Ａ５ ２ ４ ０ ０ ０ ２ ０ ），Ｒ Ｐ ＭＩ １ ６ ４ ０ 培养基 （ 规 格及 批号 ：１ ０ Ｘ１ Ｌ ，批号 １ １ ４ ６ ５ ６ ３ ） ，胎牛 血清 （ Ｆ Ｂ Ｓ规格 及批号 ：５ ０ ０ ＭＬ ，２ １ ０ １ ７ ０ Ｋ）购 自 Ｇ ｉ ｂ ｃ ｏ 公 司 ；所用 化学试 剂均 为 国产 分析纯 ；实验 室用水 为超 纯水 ； ２ ． ２ 细胞上 清效价 比较 ：在 比较细 胞损伤及 清除污染 的同时 ，对 于分 泌 抗体的杂交瘤 细胞 ，我 们还需要 重点关注支 原体去清 除的同时是否
测 效价 ，效价 略降 ，筛选 单集 落 亚克 隆，重复３ 次 。④抗 生素法 （ 支 原 体清 除剂法 ） ：使用含 支原体 清除剂 １ ％ Ｍｙ ｃ ｏ 一 ３ １ ６ ４ ０ 完 全培养基 培养 有支原体 污染 的杂 交瘤细胞 ２ － ８ Ｆ ９ 及１ － １ ２ Ａ ５ ，３ 天换液 １ 次 ，连续
于 相应平 台可 见 ，清除 剂 法对 细 胞损 伤较 大，抗体 相应 功 能下 降 ；而 实体 瘤法教 温和 ，抗 体 相应 功 能保持 较 完好 。 【 关键 词 】 支原体 ；杂 交瘤细 胞 ；抗体
中 图分类 号 ：Ｒ ３ ７ ５
文 献标 识码 ：Ｂ
文章 编号 ：１ ６ ７ １ — ８ １ ９ ４（ ２ ０ １ ４ ）３ ０ — ０ ０ ６ ９ — ０ ２
改变 的细胞原 有的生物性 质 ，即其 分泌抗体 的能力是否发生 改变 。图
１ 是 四种不同方法去 除污染 后细胞上清分泌抗体功 能的 比较 。 从 图１ 中我们可 以看 到四种 处理方 法 中实 体瘤 方法处 理后 细胞分 泌抗体 的能力 与为感染前 的较一致 ，支 原体清 除剂 处理后细 胞上 清的 Ｏ Ｄ 值 低０ ． ２ 左 右 ，亚 克其次 ，腹腔处理 方法细 胞分泌抗 体的功 能基本
支原体清除剂说明书
支原体清除剂说明书货号：CA1090规格：200μL保存：-20℃，一年（避免反复冻融，建议分装保存。
）注意：1.请在收到货后，将试剂管瞬时离心。
2.产品出现沉淀属正常现象，在分装或使用前须在室温下震荡溶解至澄清透明状，不影响产品的使用效果。
产品说明：支原体是一种大小仅为0.2~0.3μm，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22~0.45μm）的原核生物，在细胞培养过程中，支原体感染发生率达到63%，因而细胞培养过程中被支原体污染是一个世界性的难题。
多篇文献研究表明：当细胞（特别是传代细胞）被支原体污染后，细胞内的DNA、RNA及蛋白表达发生改变，而细胞的生长率一般并未发生显著的影响，因而细胞被支原体污染一般难以察觉。
支原体清除剂用于解决因支原体污染而导致细胞污染或状态下降的问题，同时其对于常见的革兰氏阴性和阳性菌也有一定的清除作用，从而确保研究人员的研究结果真实、可信。
使用说明：1．建议现配现用，并保持细胞密度在50～60%。
2．推荐稀释比例为1:1000。
例如10mL的培养基加入10μL支原体清除剂混匀。
3．弃去旧的培养基，用PBS将细胞清洗干净，再加入含有支原体清除剂的新鲜培养基，1天1次，连续处理3天；或者2天1次，连续处理5～6天。
若细胞污染非常严重时，需延长处理时间。
4．若细胞对支原体清除剂敏感，或生长明显被抑制时，可调整稀释比例，如：1:2000或1:30005．处理完毕后，加入新鲜培养基，培养基中可添加支原体预防剂预防支原体再次污染。
6．因支原体清除剂本身具有广谱抑菌性，为了降低对细胞的影响，强烈建议不要和其它抗生素同时使用。
产品优势：1．特异性清除培养基中的支原体；2．只需要处理3天左右，便可以有效清除支原体；3．活性成分为多肽类，不会产生耐药性；4．对细胞几乎无毒性，在100多种细胞上进行过验证，包括但不限于HEK293、Hela、MCF-7、MRC-5、NIH-3T3、CCC-ESF、CHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、H295R、HL-60、K562、MDA-MB-231、SP2/0、T47D、BM和BV2等；5．广谱性，可替代双抗，可以清除常见的革兰氏阴性和阳性菌；6．可直接加入血清、培养基中，用于清除支原体污染；。
细胞培养过程中支原体污染的防治与检测方法
细胞培养过程中支原体污染的防治与检测方法邢龙彬;刘长政;焦晓磊;刘彤;杜智;高英堂【期刊名称】《世界华人消化杂志》【年(卷),期】2016(0)10【摘要】目的:为高效便捷地去除细胞培养过程中支原体污染,采用多种抗生素和检测方法对污染细胞进行处理和检测.方法:分别采用Plasmocin、BM-Cyclin、MRA3种药物对污染细胞进行处理,以CLARK的一步法试剂、Biotool的快速检测试剂和自行研制的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)等3种方法进行检测.结果:一步法试剂检测显示Plasmocin处理14d后支原体消除,快速检测试剂检测显示BM-Cyclin处理21d彻底消灭支原体,而MRA经PCR检测发现彻底消除支原体需要14d;另外,3种药物交替使用清除支原体的效果更加显著.结论:通过使用3种抗生素和3种支原体检测方法,使细胞培养过程中的支原体污染得到有效控制,为更好地开展细胞研究奠定基础.【总页数】8页(P1557-1564)【关键词】支原体;细胞培养;防治;检测【作者】邢龙彬;刘长政;焦晓磊;刘彤;杜智;高英堂【作者单位】天津医科大学第三中心临床学院,天津市300070;天津市人工细胞重点实验室天津市肝胆疾病研究所天津市第三中心医院,天津市300170【正文语种】中文【中图分类】R378.3【相关文献】1.细胞培养过程中支原体污染的检测及预防 [J], 桂馨;钱洁;许洁;邢丽波2.动物细胞培养中支原体污染的检测方法比较研究 [J], 刘谋渊;刘岚;赵娇;余红3.细胞培养过程中支原体污染的检测和去除研究 [J], 陈琳4.用巢式多聚酶链反应检测细胞培养中污染支原体方法的建立 [J], 王正森;吴建新;赵小元;孙宝岭;郭章溉;李敏5.一种高度敏感的检测细胞培养中污染支原体的方法 [J], 黄传书;金伯泉;汪美先;张建平;孙凯;陈常庆;顾文琴;喻缨因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
细胞支原体污染的影响、检测方法及清除方法
细胞支原体污染的影响、检测方法及清除方法支原体简介支原体（mycoplasma）：又称霉形体，为目前发现的最小的最简单的原核生物。
支原体细胞中唯一可见的细胞器是核糖体（支原体是原核细胞，原核细胞的细胞器只有核糖体）。
支原体是在1898年发现的，又称人形支原体，是一种简单的原核生物。
其大小介于细菌和病毒之间。
结构也比较简单，多数呈球形，没有细胞壁，只有三层结构的细胞膜，故具有较大的可变性。
支原体的大小为0.2～0.3um,可通过滤菌器，常给细胞培养工作带来污染的麻烦。
菌落小（直径0.1~1.0mm），在固体培养基表面呈特有的"油煎蛋"状。
无细胞壁，不能维持固定的形态而呈现多形性，对渗透压敏感，对抑制细胞壁合成的抗生素不敏感。
支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染（一些支原体在人体是正常菌群）、培养基的污染、污染支原体的细胞造成的交叉污染、实验器材带来的污染和用来制备细胞的原始组织或器官的污染。
支原体污染对细胞的影响1、影响细胞的生长状态及形态支原体可使培液中支持细胞生长的营养物质含量减少，造成细胞生长缓慢甚至停止；细胞状态变差，生长变慢，在显微镜下观察可能会有小黑点，但培养基一般不发生浑浊。
会导致细胞微管解聚，引起细胞一系列病变，表现为细胞收缩、贴壁细胞脱落、裂解等。
细胞传代以后就出现细胞间黑点，细胞空泡化，很多类似凋亡、坏死的细胞，最终细胞漂浮，完全死亡。
2.影响细胞的代谢和功能（1）培液中的精氨酸被支原体大量消耗，引起细胞蛋白质、DNA、rRNA、mRNA的合成障碍；（2）支原体活动使培养基成分发生改变（如发酵型支原体降解糖类产生酸性物质），影响细胞代谢；（3）支原体吸附在细胞表面，破坏细胞膜的完整性，影响细胞信号传递；（4）支原体消耗细胞的核苷库—染色体异常。
3、其他此外，支原体污染还会影响一些病毒在细胞中的产量、使恶性细胞致癌能力下降、影响淋巴细胞分化等。
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BM-cycline消除支原体
支原体最突出的结构特征是没有细胞壁，一般来讲，对作用于细胞壁生物合成的抗生素，如 -内酰胺类、万古霉素等完全不敏感；对多粘菌素、利福平、磺胺药物普遍耐药。
对支原体最有抑制活性及常用于支原体感染治疗的抗生素是四环素类、大环内酯类及一些氟喹诺酮；其他类抗生素如氨基糖苷类、氯霉素对支原体有较小抑制作用，所以常不用来作为支原体感染的化学治疗剂。
去除支原体常用方法有抗生素处理、抗血清处理、抗生素加抗血清和补体联合处理。
一、 BM-cycline 的成分和原理
BM-cycline包括泰妙菌素（泰妙霉素 Tiamulin 或pleuromulin即BM-cyclineⅠ）和二甲胺四环素（米诺环素Minocycline 即BM-cyclineⅡ）。
抑制支原体及细菌生长，高效去除培养细胞中已感染的支原体。
适用于多种培养细胞，无明显副作用，又不影响细胞本身的代谢，而且处理过的细胞不会重新感染支原体。
泰妙菌素抑菌原理：泰妙菌素与细菌核糖体的肽基转移酶中心结合，导致多肽链起始复合物不能正确地装配，生理性地失活，易分解，并且不能进入多肽链延长期，从而导致细菌无法合成自身蛋白质。
二甲胺四环素抑菌原理：是与核糖体30S亚基的A位置结合，阻止肽链的延长，从而抑制细菌或其他病原微生物的蛋白质合成。
二、BM-cycline消除支原体的方法
1．抗生素制备
用PBS将BM-cyclineⅠ和Ⅱ配成250×浓缩液,即2500ug/mL和1250 ug/mL,-20℃保存备用，终浓度BM-cyclineⅠ为10 ug/mL、 BM-cyclineⅡ为5 ug/mL，使用浓度参考《组织培养和分子细胞学技术》117页表6－2。
2. 实验步骤
贴壁细胞：
贴壁细胞传代的同时加入BM-cyclineⅠ10 ug/mL，37℃培养3天，胰蛋白酶消化传代，加入BM-cyclineⅡ5 ug/mL，37℃培养3天，继续传代培养，追加BM-cyclineⅡ5 ug/mL培养2-4天后弃药液D-Hank’ s液洗2次，胰蛋白酶消化传代进行常规培养。
悬浮细胞：
取受支原体污染的细胞，吸除培养液，加入含BM-cyclineⅠ的培养液培养3天后，悬
浮离心，吸除培养液，再加入含BM-cyclineⅡ的培养液培养4天，如此3-4个循环，每个循环末均用用Hoechst33258(二苯并咪唑，用PBS配制工作浓度为0.05ug/mL)荧光染色镜检。
消除支原体的细胞再不加抗生素的培养液中传代3-4次即可获得纯净的无支原体污染的细胞。
如清除不彻底可再进行处理至纯净为止（一般3个轮回即能被完全消除，也有只进行一个BM-cyclineⅠ和BM-cyclineⅡ循环，就能去除支原体的）。
BM-cyclineⅠ和BM-cycline Ⅱ与CIP（4-氟，2-羟基喹啉）联合应用亦可，即先用含CIP的培养液培养12天后，再按上述方法处理。
（DNA荧光染色法：荧光染色用能与DNA特异性结合的荧光染料Hoechst 33258，可使支原体内含有的DNA着色，染色后用荧光显微镜观察。
具体方法如下：首先将细胞接种盖玻片上，在细胞未长满前取出玻片，用不合酚红的Hanks液漂洗一下，用l： 3醋酸甲酵固定10Min，然后用生理盐水漂洗．置于用生理盐水配浓度为50pg／ml的Hoechst 33258中染色10min。
染色后用蒸溜水洗1—2min．向细胞面滴加pH5．5磷酸缓冲液数滴，然后置荧光显微镜下观察。
镜下支原体为散在于细胞同围或附于细胞膜表面的亮绿色小点。
）商品：
Roche 货号：10799050001 品名 BM-Cycline 每包装(37.5mg) 可用于2 X 2.5升培养基。
三、扩展内容
1、造成支原体高污染率的原因为：
▪支原体size 0.1-0.8 um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 um）
▪支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化
▪缺乏简单、快速且可靠的检测方式
▪细胞流通间缺乏品管，造成实验室间的相互污染
▪研究或操作人员忽略污染问题
2、支原体污染了来源：
▪已受污染的细胞
▪操作人员的疏失
▪已受污染的培养基、血清
▪操作环境不良、实验器具不洁等
由于支原体为人体口腔中之正常菌丛，实验室之操作人员的污染亦可能为污染源，须十
分注意。
而万一细胞已受支原体污染时，最佳的处理原则为将细胞高压灭菌后丢弃，以免污染其它洁净的细胞株。
3、支原体的检测方法：
检测方法：1、相差显微镜检测；2、低张处理地衣红染色观察；3、 DNA荧光染色法；4、电镜检测；5、 3-H胸腺嘧啶掺入法；6、聚合酶链反映法；7、免疫学方法；8、支原体的培养。
还查到一种快速检测支原体感染的方法——瓜氨酸检测法，当细胞培养被支原体污染时,培养基中精氨酸量明显下降,同时有瓜氨酸出现;当支原体被消除后,瓜氨酸即消失。
用HPLC检测细胞培养中瓜氨酸的含量。
4、去除支原体的方法
抗生素法：BM-cyclin（Roche），MRA（mycoplasma removal agent， ICN），Ciprofloxcin （Bayer），Enrofloxacin（Bayer）
共培养法：与巨噬细胞共培养。
重新克隆法：抗生素处理后，将细胞稀释后传代，每周换2次含抗生素的新鲜培养液，4-5周后，重复克隆2次。
过滤法：0.22µm孔径滤膜正压过滤，去除效果不好。
5、预防与控制方面可从以下各点加强注意：
设备方面：
1、使用已作支原体测试后的细胞株
2、于另一隔离之区域操作未知是否有支原体污染之细胞
3、使用不添加抗生素的培养基培养细胞
检测方面：定期以标准的支原体检测方法检测细胞、培养基、血清、ddH2O有否被支原体污染。
实验操作人员之无菌观念与无菌操作技术之要求。