实验三 等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点
蛋白质等电点测定实验报告
蛋白质等电点测定实验报告蛋白质等电点测定蛋白质等电点测定及性质实验一、目的：了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉能力的关系。
初步学会测定蛋白质等电点的基本方法，了解蛋白质的性质。
二、原理：固体颗粒在液体中为什么能够带电？当固体与液体接触时，固体可以从溶液中选择性吸附某种离子，也可以是固体分子本身发生电离作用而使离子进入溶液，以致使固液两相分别带有不同符号的电荷，由于电中性的要求，带电表面附近的液体中必有与固体表面电荷数量相等但符号相反的多余的反离子。
在界面上带电表面和反离子形成了双电层的结构。
在两种不同物质的界面上，正负电荷分别排列成的面层。
对于双电层的具体结构，一百多年来不同学者提出了不同的看法。
最早于1879年Helmholz提出平板型模型；1910年Gouy和1913年Chapman修正了平板型模型，提出了扩散双电层模型；后来Stern又提出了Stern模型。
根据O.斯特恩的观点，一部分反离子由于电性吸引或非电性的特性吸引作用（例如范德华力）而和表面紧密结合，构成吸附层（或称紧密层、斯特恩层）。
其余的离子则扩散地分布在溶液中，构成双电层的扩散层（或称滑移面）。
由于带电表面的吸引作用，在扩散层中反离子的浓度远大于同号离子。
离表面越远，过剩的反离子越少，直至在溶液内部反离子的浓度与同号离子相等。
紧密层：溶液中反离子及溶剂分子受到足够大的静电力，范德华力或特性吸附力，而紧密吸附在固体表面上。
其余反离子则构成扩散层。
滑动面：指固液两相发生相对移动的界面，是凹凸不平的曲面。
滑动面至溶液本体间的电势差称为ζ电势。
固体颗粒带电量的大小及测量方式？ζ电势只有在固液两相发生相对移动时才能呈现出来。
ζ电势的大小由Zeta电位表示，其数值的大小反映了胶粒带电的程度，其数值越高表明胶粒带电越多，扩散层越厚。
一般来说，以pH值为横坐标，Zeta电位为纵坐标作图，Zeta电位为零对应的pH值即为等电点。
对于蛋白质分子来说：蛋白质分子的大小在胶粒范围内，约1～100微米。
等电聚焦电泳测定血清蛋白质等电点
等电聚焦电泳测定血清蛋白质等电点【实验原理】等电聚焦电泳是利用具有pH梯度的两性电解质为载体，分离等电点(pI)不同的蛋白质等两性分子的电泳技术。
在IEF电泳系统中，具有一个从阳极到阴极，pH值逐渐增大的连续而稳定的pH梯度，处于此系统的各种蛋白质分子，将根据各自的pI值与所处位点的pH值的差别带上正电或负电。
当蛋白质分子向相反电极移动的过程中，其逐渐靠近与其DI相同的pH位点，直至到达pH=pI，净电荷为零而停止移动，从而达到聚焦。
因此，将pI不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一段时间后，各组分会分别聚焦在各自pI相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。
根据电泳装置的不同，IEF可分为管型IEF和平板型IEF，本实验介绍管犁PAGE—IEF．【试剂与器材】1．凝胶贮备液称取丙烯酰胺(Acr)20g，甲叉双丙烯酰胺(Bis)0．8g，蒸馏水溶解后定容至100mL，过滤，将未溶物滤去，盛于棕色瓶中，4℃冰箱保存。
2．1％(V/V)TEMED溶液。
3．5g/L过硫酸铵称取过硫酸铵0．5g，溶于蒸馏水100mL，冰箱存放，每周新配。
4．40％两性电解质载体。
5．0．5mmol/L磷酸溶液量取85％磷酸16mL，加蒸馏水定容至500mL。
6．0．5mmol/L NaOH溶液称取NaOH10g，加蒸馏水溶解并定容至500mL。
7．1g/L考马斯亮蓝固定染色液称取考马斯亮蓝R250 lg，溶于含甲醇200mL、乙酸100mL和蒸馏水700mL的混合液中，过滤后备用。
8．酸性乙醇脱色液乙醇25份，蒸馏水25份，冰醋酸8份，混匀备用。
9．血清样本血清无须稀释，但最好透析去除离子。
10．电泳仪选用电子管或晶体管整流电源，电压0~600V，电流0~300mA。
11．电泳槽圆盘电泳槽及电泳玻管。
12．锥形瓶，250px长针头或腰椎穿刺针头，5mL或10mL注射器。
食品安全检测农药兽药残留土壤成分分析焦炭成分分析【操作步骤】1．凝胶制备取洁净干燥的电泳玻璃管2支，将管底用胶布封闭，垂直放置在电泳管架上。
测定蛋白质等电点：了解分析原理与实验方法的必备指南
测定蛋白质等电点：了解分析原理与实验方法的必备指南蛋白质是生物体内功能多样的重要分子，其性质与溶液中的pH值密切相关。
了解蛋白质的等电点对于理解其溶解性、稳定性和相互作用至关重要。
测定蛋白质的等电点可以帮助科学家们更好地理解蛋白质的特性，并在药物研发和生物工程等领域中发挥重要作用。
一、蛋白质等电点的原理。
蛋白质的电荷性质：蛋白质分子在不同pH值下带有正负电荷，这是由于其天然氨基酸残基上的带电基团。
等电点的定义：等电点是蛋白质溶液中净电荷为零的pH值，即带正电荷的氨基酸残基和带负电荷的氨基酸残基在该pH值下几乎相等。
二、测定蛋白质等电点的方法。
等电聚焦电泳（IEF）：利用电场将蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中分离，根据其在电场中迁移的速率确定等电点。
等电点电泳（IPG）：使用具有梯度pH值的聚丙烯酰胺凝胶，将蛋白质根据等电点在凝胶中定位。
pH梯度电泳：通过在凝胶中创建pH值梯度，使蛋白质在凝胶中以等电点静止。
三、蛋白质等电点分析的应用和局限性。
蛋白质溶解性和稳定性研究：等电点可以指导蛋白质的溶解条件和稳定性的优化。
蛋白质相互作用研究：等电点的差异可以用于研究蛋白质与其他分子的相互作用。
方法局限性：测定蛋白质等电点需要考虑样品纯度、离子强度和其他实验条件的影响。
测定蛋白质的等电点是研究蛋白质溶解性、稳定性和相互作用的重要手段。
了解蛋白质等电点的原理和常用方法对于科学家们理解蛋白质特性具有重要意义。
然而，我们也要认识到测定蛋白质等电点的方法存在一定的局限性，需要综合考虑实验条件和样品特性。
随着技术的不断发展，蛋白质等电点分析将为药物研发和生物工程等领域的进展提供更多的指导。
图1。
蛋白质等电点的测定
蛋白质等电点的测定蛋白质是生命体内构成最广泛的一类生物大分子，具有各种生物功能。
在生物体内，蛋白质具有正负电荷，并在不同PH值的溶液中表现出不同的电性质。
蛋白质在pH等于其等电点时，蛋白质的电荷处于中性状态，亦是纯蛋白质最稳定的情况，因此准确测定蛋白质等电点对于分离、纯化和鉴定蛋白质具有重要意义。
本文中将介绍三种测定蛋白质等电点的方法。
方法1. 等电点电泳法等电点电泳法是一种电泳分离方法，利用蛋白质在不同pH值下的电荷变化探测其等电点。
该方法的原理为将蛋白质经过电泳分离，直到电泳缓冲液pH等于蛋白质的等电点，此时蛋白质处于中性带中心。
与常规电泳仪不同的是，该仪器在酸性电极和碱性电极之间加入溶液，以确保酸碱缓冲系统能够维持所需的pH值。
等电点电泳法可以快速而准确地测定蛋白质等电点，但需要特殊仪器和耗时较长，且样品纯度较高。
方法2. 等电聚焦法等电聚焦法是一种电泳技术，利用在连续的pH梯度中，使具有等电点的蛋白质依次停止迁移，从而分离蛋白质。
该方法的原理是，利用蛋白质在不同pH值下的等电点特性，将样品置于pH梯度中，通过电压控制，使蛋白质在等电点处停止迁移，从而实现蛋白质分离。
等电聚焦法具有高分辨率和高分离效率，同时还可以同时分离出等电点相似但分子量不同的蛋白质，但样品量较小，需要特殊仪器和大量控制。
方法3. pH梯度管柱法pH梯度管柱法是一种可溶性蛋白质的标准测定方法，也是等电点法中最广泛应用的方法之一。
该方法的基本原理是，在含有不同pH值的缓冲液梯度的柱子上，蛋白质会在不同的pH值时呈现出不同的电荷状态。
在pH值等于其等电点时，蛋白质处于中性状态，停止迁移。
通过检测蛋白质在不同pH值下的吸收值，可以确定样品的等电点。
pH梯度管柱法的优点包括样品量较大，操作简单，数据可靠，但分辨率较低，需要特殊的柱子。
三种测定蛋白质等电点的方法各有侧重，实验操作难度大小也不同，一般来说，选择合适的测定方法应根据样品特点和实验条件。
等电点常用的检测方法
等电点常用的检测方法等电点是指溶液中离子总电荷为零时的pH值。
在生化学中，等电点的测定十分重要，可用于分离、检测和鉴定蛋白质等生物分子。
以下是关于等电点常用的10种检测方法的详细描述：1. 等电聚焦法等电聚焦法是一种基于电荷的分离技术，通过将带有不同电荷的生物分子置于电解质溶液中，利用电场分离它们。
该方法可以分离具有相似分子量和电荷的蛋白质，特别是针对等电点非常接近的蛋白质。
等电聚焦法结合其他技术，例如凝胶电泳、Western blot等，可用于确定蛋白质的丰度、结构和功能。
2. 弱离子交换层析法弱离子交换层析法是一种高效的蛋白质分离方法，该方法通过在弱酸或弱碱柱上吸附蛋白质，并根据其等电点的差异进行分离。
当蛋白质在强酸或强碱的pH值下具有相同的电荷时，会发生共存，并不会被分离。
弱离子交换层析法适用于寻找等电点相近的蛋白质分离。
3. 等电聚丙烯酰胺凝胶电泳法等电聚丙烯酰胺凝胶电泳法是将蛋白质样品置于凝胶上，然后通过改变凝胶pH的缓冲溶液来移动蛋白质并分离它们。
该方法利用凝胶pH等离子体电位变化来使蛋白质在凝胶中停止运动，从而将等离子体电位与蛋白质标记等电点pI相等。
由于该方法可以使用同一pH缓冲溶液进行多次聚焦，因此该方法的等电点分离效果比其他方法更加理想。
4. 细胞凝胶电泳法细胞凝胶电泳法是利用细胞的膜电位和pH等离子体电位差异分离细胞。
该方法可用于分离具有不同等电点的细胞，并且可以通过改变pH缓冲溶液的pH值来使分离更具特异性。
5. pH梯度制备法pH梯度制备法是一种制备带有不同pH的水溶液的方法，这些溶液可用于等电点分离、药物筛选、酶催化和蛋白质研究等领域。
该方法可以通过改变缓冲溶液的浓度和组成来控制pH梯度，以此选择性放大具有某些分子量或等电点的生物大分子。
6. 免疫层析法免疫层析法是以免疫反应为基础的方法，可以通过介导特异性抗体和抗原结合来分离目标生物分子。
该方法可以应用于从复杂混合物中纯化含有多种酶和受体的等离子体，其优点在于其针对性很高，可以选择性地分离几乎任何单一分子。
蛋白质两性性质及等电点的测定
蛋白质两性性质及等电点的测定蛋白质是生物体中极其重要的有机化合物，是构成生物体的基本组成部分之一。
蛋白质具有很多种类和功能，不同的蛋白质在生物体内发挥着不同的作用。
蛋白质的性质也因其结构而异，其中包括两性性质和等电点。
本文将介绍蛋白质的两性性质及等电点的测定。
一、蛋白质的两性性质蛋白质是由多肽链组成的，其分子中含有氨基酸残基。
这些氨基酸残基中的羧基（-COOH）和氨基（-NH2）可以参与酸碱反应，所以蛋白质具有两性性质，能够在不同的pH值下呈现不同的电离状态。
1. 在低pH值下，蛋白质中的羧基处于质子化状态，成为正电荷，而氨基则不受质子化，保持中性。
因此，在低pH值时，蛋白质呈正电荷状态，称为阳离子。
2. 在高pH值下，蛋白质中的氨基受到氢离子的质子化，成为正电荷，而羧基则不受质子化，保持中性。
因此，在高pH值时，蛋白质呈负电荷状态，称为阴离子。
3. 在等电点附近，蛋白质的质子化和去质子化同时发生，羧基和氨基的质子化程度相等，呈中性状态。
此时，蛋白质没有净电荷，称为等电点。
由于蛋白质的两性性质，可以影响其溶解性、折叠构象和相互作用等特性，对其功能和生物学作用具有重要影响。
二、蛋白质等电点的测定等电点是蛋白质具有中性状态的pH值。
测定蛋白质的等电点可以帮助我们了解其溶解性、电动力学性质和酸碱加工过程中的变化。
常用的测定等电点的方法有以下几种：1. pH梯度电泳法：这是一种常用且广泛应用的测定等电点的方法。
在一个pH梯度上进行电泳，当蛋白质离子迁移速率和电场力相等时，达到等电点。
可以通过在梯度上观察蛋白质带的形成和移动情况来确定等电点。
2. 等电聚焦电泳法：这是一种利用电场作用下蛋白质在凝胶上垂直移动的方法，根据蛋白质在凝胶中的移动速率和电场力相等时的pH值来测定等电点。
3. 等电点电位计法：该方法利用等电点时蛋白质没有净电荷的特性，使用电位计测量蛋白质在不同pH值下的电位变化，找出没有净电荷时的pH值，即为等电点。
蛋白质的等电点测定及性质实验
蛋白质的等电点测定及性质实验一、实验目的初步学会测定蛋白质等电点的基本方法，并了解蛋白质的性质。
二、实验原理蛋白质分子是两性电解质，当调节溶液的酸碱度，使蛋白质分子上所带的正负电荷相等时，在电场中，该蛋白质分子既不向正极移动，也不向负极移动，这时溶液的pH值，就是该蛋白质的等电点（pI）。
不同蛋白质，等电点不同。
在等电点时，蛋白质溶解度最小，容易沉淀析出。
因此，可以借助在不同pH溶液中的某蛋白质的溶解度来测定该蛋白质的等电点。
在蛋白质溶液中加入一定浓度的中性盐，蛋白质即从溶液中沉淀析出，这种作用称为盐析。
盐析法常用的盐类有硫酸铵、硫酸钠等。
蛋白质的盐析作用是可逆过程。
由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解。
而重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。
三、试剂和器材⑴高筋面粉、低筋面粉。
⑵ 1mol/L醋酸。
（每组自配0.1mol/L醋酸、0.01mol/L醋酸）⑶ 0.5%酪蛋白溶液。
称取2.5克酪蛋白，放入烧杯中，加入40℃的蒸馏水，再加入50毫升1N 氢氧化钠溶液，微热搅拌直到蛋白质完全溶解为止。
将溶解好的蛋白溶液转到500毫升容量瓶中，并用少量蒸馏水洗净烧杯，一并倒入容量瓶。
在容量瓶中再加入1N醋酸溶液50毫升，摇匀，再加蒸馏水定容至500毫升，得到略显混浊的、在0.1N NaAc溶液中的酪蛋白溶液。
⑷鸡蛋白溶液。
将80mL鸡蛋清与800mL蒸馏水混合均匀后，用洁净的多层湿纱布垫在漏斗上过滤，滤液即为鸡蛋白溶液（不能有不溶性物悬浮）。
要现配现用，最好使用经过煮沸并封在容器中隔绝空气冷却的蒸馏水。
⑸质量分数为5%的CuSO4溶液。
（每排3组合配）⑹ (NH4)2SO4饱和溶液。
（确保有固体析出）⑺天平、水浴锅、移液管、试管等。
四、操作步骤1、蛋白质的等电点测定⑴取5支同种规格的试管，编号，按表1顺序精确加入各种试剂，特别注意0.5%酪蛋白溶液最后加入，然后逐一振荡试管，使试管混合均匀。
实验三等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点
实验三等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点一、实验目的了解等电聚焦的原理。
通过蛋白质等电点的测定，掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直管式等电聚焦电泳技术。
二、实验原理等电聚焦（Isoelectric focusing，简称IEF）是六十年代中期出现的新技术。
近年来等电聚焦技术有了新的进展，已迅速发展成为一门成熟的近代生化实验技术。
目前等电聚焦技术已可以分辨等电点（pI）只差0.001pH单位的生物分子。
由于其分辨力高，重复性好，样品容量大，操作简便迅速，在生物化学、分子生物学及临床医学研究中得到广泛的应用。
蛋白质分子是典型的两性电解质分子。
它在大于其等电点的pH环境中解离成带负电荷的阴离子，向电场的正极泳动，在小于其等电点的pH环境中解离成带正由荷的阳离子，向电场的负极泳动。
这种泳动只有在等于其等电点的pH环境中，即蛋白质所带的净电荷为零时才能停止。
如果在一个有pH梯度的环境中，对各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，则在电场作用下，不管这些蛋白质分子的原始分布如何，各种蛋白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH梯度中相对应的位置处进行聚焦，经过一定时间的电泳以后，不同等电点的蛋白质分子便分别聚焦于不同的位置。
这种按等电点的大小，生物分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为就称为“等电聚焦”。
等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的pH梯度，使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦，从而达到分离、测定和鉴定的目的。
两性电解质载体，实际上是许多异构和同系物的混合物，它们是一系列多羧基多氨基脂肪族化合物，分子量在300~1000之间。
常用的进口两性电解质为瑞典Pharmacia-LKB公司生产的Ampholine 和Pharmalyte，价格昂贵。
国产的有中国军事医学科学院放射医学研究所和上海生化所生产的两性电解质，价格便宜，质量尚佳。
两性电解质在直流电场的作用下，能形成一个从正极到负极的pH值逐渐升高的平滑连续的pH梯度。
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实验三等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点一、实验目的了解等电聚焦的原理。
通过蛋白质等电点的测定，掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直管式等电聚焦电泳技术。
二、实验原理等电聚焦（Isoelectric focusing，简称IEF）是六十年代中期出现的新技术。
近年来等电聚焦技术有了新的进展，已迅速发展成为一门成熟的近代生化实验技术。
目前等电聚焦技术已可以分辨等电点（pI）只差0.001pH单位的生物分子。
由于其分辨力高，重复性好，样品容量大，操作简便迅速，在生物化学、分子生物学及临床医学研究中得到广泛的应用。
蛋白质分子是典型的两性电解质分子。
它在大于其等电点的pH环境中解离成带负电荷的阴离子，向电场的正极泳动，在小于其等电点的pH环境中解离成带正由荷的阳离子，向电场的负极泳动。
这种泳动只有在等于其等电点的pH环境中，即蛋白质所带的净电荷为零时才能停止。
如果在一个有pH梯度的环境中，对各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，则在电场作用下，不管这些蛋白质分子的原始分布如何，各种蛋白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH梯度中相对应的位置处进行聚焦，经过一定时间的电泳以后，不同等电点的蛋白质分子便分别聚焦于不同的位置。
这种按等电点的大小，生物分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为就称为“等电聚焦”。
等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的pH梯度，使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦，从而达到分离、测定和鉴定的目的。
两性电解质载体，实际上是许多异构和同系物的混合物，它们是一系列多羧基多氨基脂肪族化合物，分子量在300~1000之间。
常用的进口两性电解质为瑞典Pharmacia-LKB公司生产的Ampholine 和Pharmalyte，价格昂贵。
国产的有中国军事医学科学院放射医学研究所和上海生化所生产的两性电解质，价格便宜，质量尚佳。
两性电解质在直流电场的作用下，能形成一个从正极到负极的pH值逐渐升高的平滑连续的pH梯度。
若不同的pH值的两性电解质的含量与pI值的分布越均匀，则pH梯度的线性就越好。
对Ampholine两性电解质的要求是缓冲能力强，有良好的导电性，分子量要小，不干扰被分析的样品等。
在聚焦过程中和聚焦结束取消了外加电场后，如保持pH梯度的稳定是极为重要的。
为了防止扩散，稳定pH梯度，就必须加入一种抗对流和扩散的支持介质，最常用的这种支持介质就是聚丙烯酰胺凝胶。
当进行聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳时，凝胶柱内即产生pH梯度，当蛋白质样品电泳到凝胶柱内某一部位，而此部位的pH值正好等于该蛋白质的等电点时，该蛋白质即聚焦形成一条区带，只要测出此区带所处部位的pH值，即为其等电点。
电泳时间越长，蛋白质聚焦的区带就越集中，越狭窄，因而提高了分辨率。
这是等电聚焦的一大优点，不像一般的其他电泳，电泳时间过长则区带扩散。
所以等电聚焦电泳法不仅可以测定等电点，而且能将不同等电点的混合的生物大分子进行分184离和鉴定。
早期的等电聚焦电泳是垂直管式的，其特点是体系是封闭的，不与空气接触，可防止样品氧化。
近年来，又发展了超薄层水平板式等电聚焦电泳。
此法的优点是加样数量多，节省两性电解质，电泳后固定、染色、干燥都十分迅速简便，其最大优点是防止了电极液的电渗作用而引起正负两极pH梯度的漂变。
测定pH梯度的方法有四种：1. 将胶条切成小块，用水浸泡后，用精密pH试纸或进口的细长pH复合电极测定pH值，然后作图。
2. 用表面pH微电极直接测定胶条各部分的pH值，然后作图。
3. 用一套已知不同的pI值的蛋白质作为标准，测定pH梯度的标准曲线。
4. 将胶条于－70℃冰冻后切成1mm的薄片，加入0.5ml 0.01M KCl，用微电极测其pH。
三、仪器和用具1. 电泳仪2. 垂直管式园盘电泳槽一套3. 注射器与针头4. 移液管：10ml、5ml、2ml、1ml、0.1ml5. 小烧杯若干6. 培养皿一套7. 直尺8. 小刀9. 精密pH试纸和带细长复合pH电极的pH计10. 塑料薄膜和橡皮筋四、试剂1. 丙烯酰胺2. 甲叉双丙烯酰胺3. 两性电解质Ampholine（40%，pH3.5~9.5）4. 过硫酸胺（催化剂）5. TEMED（四甲基乙二胺）（加速剂）6. 磷酸7. NaOH8. 三氯乙酸（TCA）五、溶液配制1. 丙烯酰胺贮液（30%丙烯酰胺，交联度2.6%）：，30g丙烯酰胺和0.8g甲叉双丙烯酰胺溶于H2O，定容至100ml，滤去不溶物后存于棕色瓶，4℃可保存数月。
（全班公用）（另一配方为29.1g 丙烯酰胺和0.9g 甲叉双丙烯酰胺溶于H2O，定容至100ml，交联度为3.0%）。
2. 两性电解质Amphline（40%）的加入量为：50 l /ml 胶液。
3. 过硫酸胺：配成1mg/ml的浓度，当天配制，配100ml全班公用。
胶液中的加入185186 量为0.5mg/ml 胶液。
4. TEMED ：胶液中的加入量为1μl/ml 胶液。
5. 蛋白质样品：选用两种等电点相差较大的蛋白质，每根垂直管中每种蛋白质的加样量控制在<100μg 。
蛋白质样品配制成各为5mg/ml 的浓度。
配2.5ml 全班公用。
6. 固定液：10%的三氯乙酸，每组配50ml 。
7. 阳极电极液：0.1M H 3PO 43.4ml 浓磷酸（85%）加H 2O 至500ml ，每个电泳槽用500ml 。
8. 阴极电极液：0.5M NaOH2g NaOH 加H 2O 溶解至500ml ，每个电泳槽用500ml 。
六、操作步骤1. 配胶过硫酸铵是胶聚合的催化剂，因此最后加入，加毕，立即摇匀，因胶很快就会聚合，必须立即装管。
通常化学聚合的胶液，需在过硫酸铵加入前进行减压抽气处理，本实验将此抽气步骤省略并不影响实验结果。
2. 装管每个学生装两支管，每组装四支。
先用肥皂洗手，然后将圆盘电泳槽的玻璃管洗净，底端用塑料薄膜和橡皮筋封口，垂直放在试管架上，用移液管将配好的胶液移入管内，（每根玻璃管的容量约为1.5~1.8ml ）,液面加至距管口1mm 处，用注射器轻轻加入少许%100⨯⨯=胶液总体积贮液加入量丙烯酰胺贮液浓度胶浓度T %100⨯+=b a bC 甲叉双丙烯酰胺的量胶液中丙烯酰胺的量的量胶液中甲叉双丙烯酰胺交联度%6.2%1008.0308.0=⨯+=C 交联度187H 2O ，进行水封，以消除弯月面使胶柱顶端平坦。
胶管垂直聚合约30分钟，聚合完成时可观察到水封下的折光面。
3. 装槽和电泳用滤纸条吸去胶管上端的水封，除去下端的薄膜，水封端向上，将胶管垂直插入圆盘电泳槽内，调节好各管的高度，记下管号。
每支管约1/3在上槽，2/3在下槽。
上槽加入500ml 0.1M H 3PO 4，下槽加入500ml 0.1M NaOH ，淹没各管口和电极，用注射器或滴管吸去管口的气泡。
上槽接正极，下槽接负极，开启电泳仪，恒压160V ，聚焦2至3小时，至电流近于零不再降低时，停止电泳。
4. 剥胶取下胶管，用H 2O 将胶管和两端洗2次，用注射器沿管壁轻轻插入针头，在转动胶管和内插针头的同时分别向胶管两端注入H 2O 少许，胶条即自行滑出，若不滑出可用洗耳球轻轻挤出。
胶条置于小培养皿内，记住正极端为“头”，负极端为“尾”，若分不清时，可用pH 试纸鉴定，酸性端为正，碱性端为负。
5. 固定取2支胶条置于一个小培养皿内，倒入10%三氯乙酸溶液至没过胶条，进行固定，约半小时后，即可看到胶条内蛋白质的白色沉淀带。
固定完毕，倒出固定液，用直尺量出胶条长度“L 2”和正极端到蛋白质白色沉淀带中心（即聚焦部位）的长度“L ’”。
固定后的胶条可在康强860紫外/可见分光光度计上用280nm 或238nm 波长作凝胶扫描，然后用扫描图作相应的测量和计算。
6. 测定pH 梯度将放在另一个培养皿内未固定的胶条，用直尺量出待测pH 胶条的长度“L 1”。
按照由正极至负极的顺序，用镊子和小刀依次将胶条切成10mm 长的小段，分别置于小试管中，加入1ml H 2O ，浸泡半小时以上或过夜，用仔细校正后的带细长pH 复合电极的pH 计测出每管浸出液的pH 值。
七、数据处理1. 以胶条长度（mm ）为横座标，pH 值为纵座标作图，得到一条pH 梯度曲线。
所测每管的pH 值为10mm 胶条的pH 的混合平均值。
作图时将此pH 值取为10mm 小段中心即5mm 处的pH 值。
2. 用下式计算蛋白质聚焦部位至胶条正极端的实际长度L ：上式中： L’——量出蛋白质的白色沉淀带中心至胶条正极端的长度。
L 1——测pH 的胶条的长度 L 2——固定后胶条的长度3. 根据计算出的L ，由pH 梯度曲线上查出相应的pH 值，即为该蛋白质的等电点。
4. 画出固定后所测胶条的示意图。
八、附注21'L L L L ⨯=1.对两性电解质的要求两性电解质是等电聚焦的关键试剂，所以对两性电解质的质和量都要特别注意。
两性电解质含量以2%～3%较适合，能形成好的pH梯度。
由于载体两性电解质是由多乙烯多胺与丙烯酸进行加成反应生成的混合物，防止时间过长会分菌，分解变质，不能使用。
2.指教注意的问题（1）丙烯酰胺最好是重结晶的。
（2）过硫酸铵一定要新配制。
（3）所有水要用双蒸水。
（4）制胶时，玻璃板和模板必须水平放置。
（5）模板要平直光滑，不然灌胶时易溅漏。
3、防止烧胶（1）平板等点聚焦电泳的胶很薄（0.6mm），当问柳在8mA时，电压可上升到550V以上，由于阴极飘移，造成局部电流过大，胶承受不了而被烧断。
（2）防止烧胶的办法：注意观察，稳流8mA，电压上升到550V时，立即关电源。
用恒功率电泳仪，控制输出功率在指定范围。
在一定功率范围内，改进冷却条件，使因电流产生的热量及时散去。
（3）如果胶被烧了，可在烧断的位置换上一条宽的电极条压过断缝或在电源电极条内侧加一电极条，以此补救。
4.搅拌制作注意事项固定液可使蛋白质变性，不再扩散，故一定要多换一次；在电泳后取胶、固定、染色直至制干胶板都必须仔细，防止胶被损坏。
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