神经通路示踪技术 尼式染色

其它固定剂： 酒精（alcohol） ： 使蛋白质脱水而致不可逆性的凝固变性。对组织有固定、硬化兼 脱水的作用 醋酸（acetic acid）： 对核蛋白有明显的沉淀作用，不能单独使用，常与酒精联合使用 苦味酸（picric acid）： 沉淀蛋白并溶解粘蛋白，使组织柔软。 铬酸（chromic acid） ： 强氧化剂，能沉淀所有蛋白。重铬酸钾是氧化剂，对蛋白和脂类 有固定作用，尤其是脂类。对核蛋白有溶解作用。 氯化汞（mercury chloride） ： 沉淀各种蛋白。但必须脱汞 锇酸（osmium tetroxide） ： 强氧化剂。蛋白的固定作用较好，不发生沉淀，组织几乎不收缩。 但渗透力弱。 丙酮（acetone）
⒊ Weigert 氏髓鞘染色法 有髓神经纤维的髓鞘主要组成成分是磷脂，如 以铬盐或铁钒媒染使之与苏木精结合，再藉分 色处理，就能着色清晰，并在中枢神经系统显 示其分布状态。髓鞘染色除可用于显示神经纤 维干、束外，更多用于中枢神经系统纤维束的 追踪。因为，尚未髓鞘完全的纤维束（如婴儿 皮质脊髓侧束），或髓化受到损害而产生溃变 的纤维束，在与正常已髓化的纤维对比之下可 以区别。用劳克坚牢蓝（Luxol fast blue）类 染料染色也可显示髓鞘，操作时也较容易。但 染色作用较慢，染色也较浅。
5．冷冻干燥切片(freezing drying sectioning)： 将新鲜组织放入经液氮预冷（-160℃）的异戊 烷中骤冷后，入真空内干燥，已干燥的组织块 进行真空包埋后切片。其特点是细胞在骤冷的 同时立即停止一切生物化学变化，可研究骤冷 时细胞内的物质变化状况。 6．超薄切片(ultrathin sectioning)：通过固定、 脱水、包埋、切片和染色等步骤。固定分预固 定和后固定。包埋剂多为环氧树脂。切片用醋 酸铀及枸橼酸铅进行电子染色，在电子显微镜 下观察。
3．荧光免疫细胞化学
荧光免疫细胞化学( immunofluorescent cytochemistry)的基本原理是用荧光染料作 为标记物，标记上己知的抗原或抗体，再 用标记上荧光素的抗体或抗原作探针，检 测细胞或组织内的相应抗原或抗体。当荧 光素结合的抗体与被检抗原或抗体结合， 便可用荧光显微镜检测到这此抗原或抗体 的定位。
2．免疫细胞化学方法 免疫细胞化学方法(Immunocytochemistry)是应用免疫 学原理，通过抗原与特异性标记抗体结合，从而显示 细胞内的抗原或抗体成分。这种方法可以定位或示踪 细胞内各种成分，包括各种蛋白质、多肽、部分类脂 质和多糖以及细胞膜表面的膜抗原和受体等等。由于 在组织细胞内进行的抗原抗体结合是不可见的，故需 要在抗体上结合一定的可见的标记物质。
神经组织的固定
（一）固定(fixation) 为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构，防止组 织自溶，必须对细胞和组织进行固定。固定的作用不 仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源性和内源 性酶活性。更重要的是最大限度的保存细胞和组织的 抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原防止抗原 弥散。 （二）固定剂(fixative) 醛类固定剂 双功能交联剂，使组织之间相互交联，保存抗原于原 位，其特点是对组织穿透性强，收缩性小。常用的醛 类固定剂有10%钙-福尔马林液，10%中性缓冲福尔马 林液，4%多聚甲醛(paraformaldehyde)磷酸缓冲液， 戊二醛(Glutaraldehyde)-甲醛液，Bouin’s液等
Nissl染色程序： 切片入0.1%尼氏液中染色5至10分钟 蒸馏水洗去染液 70%酒精分色 1分钟 80%酒精 1-2分钟 90%酒精 1-2分钟 100%酒精 2分钟 100%酒精 2分钟 二甲苯 2分钟 二甲苯 2分钟 中性树胶封片
⒉ 苏木精伊红染色法( hematoxyiln eosin， HE ) 本法是组织学最常用的染色方法，它可显示组 织内各种细胞结构，HE染色在神经生物学研 究中亦常采用，苏木精是阳离子染料，可将细 胞核内的嗜碱性物染成蓝紫色，伊红是阴离子 染料，可将细胞质和胶原纤维等染成粉红色。

1%的伊红室温染色2-5分钟； 水洗； 70%的酒精分色30—60秒； 80%的酒精脱水1分钟； 90%的酒精脱水1分钟； 100%的酒精脱水2钟； 100%的酒精脱水2钟； 二甲苯Ⅰ透明5分钟； 二甲苯Ⅱ透明5分钟； 中性树胶封片。 结果： 1． 细胞质染成红色 2． 细胞核染成蓝色
神经组织的一般染色方法
⒈ 尼氏法（Nissl staining） 尼氏体（Nissl body）也被称作“嗜色小体” 或“虎斑小体”，其主要成份是核糖核酸 （RNA）和蛋白质组成。在各种类型神经元中， 尼氏体的形状、大小与分布均不相同。由于含 有RNA，故易为某些碱性苯胺染料所染色（如 甲苯胺蓝，焦油紫类，硫堇，天青，派洛宁， 中性红以及培花青等）。本法除可显示正常神 经元形态，特别是其内含的尼氏体情况外，还 可显示当神经元受到损害，引致的尼氏体消失， 即染色质溶解（chromatolysis），可供病理或 临床诊断和实验研究参考。
⒊ 恒冷箱切片法(cryostat sectioning) 本法是在冰冻切片技术基础上发展起来的切片 技术，其特点是将己固定或未经固定的组织块 冷冻处理后，在低温恒冷箱中进行切片，由于 切片机装在恒冷箱内，整个切片过程在低温环 境下进行，故能更好地保存组织内各种活性物 质，并可切出较薄切片，此法特别适用于细胞 化学及免疫细胞化学研究。 ⒋ 振动切片法(vibration sectioning) 本法是用特殊的振动切片机进行切片，振动切 片机的特点是其刀片进行横向切割运动， 故可 切割新鲜未经冰冻，末经固定的组织，切片厚 度可达10µm。常用于免疫细胞化学、免疫电 镜及电生理学脑厚片技术。
免疫组织化学染色 SP法 1）脱蜡、水化；（石蜡切片，冰冻切片免此步骤） 2）PBS洗2～3次各5分钟； 3）3%H2O2（甲醇）滴加在切片上，室温静置20分钟； 4）PBS洗2～3次各5分钟； 5）抗原修复；（石蜡切片，冰冻切片免免此步骤） 6）PBS洗2～3次各5分钟； 7）滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。 8）滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。 9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟。 10）PBS洗3次各5分钟； 11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室温静置，或37℃1小时； 12）II抗中可加入0.05%的tween-20。 13）PBS洗3次各5分钟； 14）Ⅲ抗30分钟； 15）PBS洗3次各5分钟； 16）DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度； 17）PBS或自来水冲洗10分钟； 18）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化； 19）自来水冲洗10～15分钟； 20）脱水、透明、封片、镜检。
6．免疫电镜技术
免疫电镜技术（immunoelectron microscope technique）是免疫细胞化学与电子显微技术结合 的产物，用以在超微结构水平进行免疫细胞化学 研究。 此技术的关键问题是标记物质必须是能满足电镜 显微技术要求的电子致密物质，目前常用的为 HRP、细胞色素C，近年来随着胶体金、纳米金 技术的发展，更广泛的被采用作为免疫电镜的标 记物。

步骤: 二甲苯脱蜡去石蜡5分钟; 二甲苯脱蜡去石蜡5分钟; 二甲苯脱蜡去石蜡5分钟 100%的酒精去二甲苯5分钟; 100%的酒精去二甲苯5分钟 90%的酒精水化2分钟; 80%的酒精水化1分钟; 70%的酒精水化1分钟 用蒸馏水洗; (以上步骤统称为脱蜡至水) 0．5%的苏木精染色，室温5—10分钟； 水洗； 1%的盐酸酒精分色30—60秒； 水洗； pregnation ） 镀银法又名浸银法，是用硝酸银镀染神经元，一个多 世纪以来，镀银法为神经形态学的发展作出了重大贡 献，此法于上一世纪七十年代由意大利解剖学家Golgi 创建，故称为Golgi氏法。到目前Golgi原法己有许多改 良法，经Cox改良的Golgi-Cox法，可以较好地显示神 经元胞体、突起各部形态，是多年来较受欢迎的方法 之一。
（3）显示脂类的脂溶性染料法 显示脂类通常用易溶 于脂类的染料，使之溶于组织或细胞内的脂滴内而显 色. 常用的这类染料有: 苏丹III (Sudan III)，苏丹IV (Sudan IV)，苏丹黑B (Sudan black B)，油红O (oil red O)等。 （4）显示酶的酶细胞化学方法 酶显示法是显示酶的 活性而不是酶的本身，细胞内含有多种酶，每一种酶 都可催化一定的化学反应。酶显示法的基本原理是具 有酶活性的组织切片或涂片，在含有酶作用底物和捕 获反应产物的捕捉剂的孵育液中，经一定pH及一定温 度的孵育，底物被酶催化分解后形成的初级反应产物 被捕捉剂捕捉，并在原位沉淀，形成有色的最终产物。
神经细胞化学性质显示方法
1．组织化学方法 （1）显示脱氧核糖核酸的孚尔根反应法(Feugen reaction) 利用schiff试剂显示细胞内DNA的经典方法， 其基本原理是组织经盐酸水解后打开DNA分子中脱氧 核糖和嘌呤碱之间的连接键，使其释放出脱氧核糖核 酸中的醛基，醛基与schiff试剂中的亚硫酸品红结合， 而在核内呈红色反应沉淀物。 （2）显示多糖的过碘酸-schiff反应法(Periodic acid Schiff reaction)简称PAS法，是显示组织或细胞内多 糖和粘多糖成分的常用方法，其原理是通过碘酸的氧 化作用，打开糖分子内1，2-乙二醇中的碳-碳键或糖 中的的氨基，烃氨基衍生物，形成2-醛基，这些醛基 与schiff试剂中的亚硫酸品红反应，形成紫红色化合物。
（三）固定方法
1.浸入法 将组织浸泡在固定液内。 2.灌注法 此法适用于动物实验研究。
常用的切片方法
常用的有石蜡切片法、冰冻切片法、恒冷箱切片法、 振动切片法. ⒈ 石蜡切片(paraffin sectioning) 本法是将已固定的组织块常规脱水处理后，放入熔化 的石蜡中浸蜡，将组织包埋在石蜡中制成蜡块，再用 石蜡切片机切片(一般片厚5-10µm)，然后将切片贴于 载玻片上。本法适用于一般染色方法。 ⒉ 冰冻切片(freezing sectioning) 本法是将已固定或未经固定的组织块经保护处理后， 用液态二氧化碳或半导体致冷装置迅速致冷冻结变硬， 然后在冰冻切片机上切片。本法可不必经脱水包埋处 理，甚至可不经固定处理，故对组织细胞内的脂类成 分及酶的活性影响较少，而且方法简单，制片速度快， 缺点是难以切出10µm以下的薄切片。