分子生物学课件 第四章
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现代分子生物学课件-第四章
tRNA上所运载的氨基酸必须靠近 位于核糖体大亚基上的多肽合成位 点，而tRNA上的反密码子必须与小 亚基上的mRNA相配对，所以分子中 两个不同的功能基团是最大限度分 离的。
4. 2. 2 tRNA的功能
转录过程是信息从一种核酸分子 （DNA）转移到另一种结构上极为相 似的核酸分子（RNA）的过程，信息 转移靠的是碱基配对。
C
酸
（Thr，T （Asn，N （Ser，
（Ile，I
）
）
S）
）
异亮氨
苏氨酸
赖氨酸
精氨酸
A
酸
（Thr，T （Lys，K （Arg，
（Ile，I
）
）
R）
）
甲硫氨
苏氨酸
赖氨酸
精氨酸
G
酸
（Thr，T （Lys，K （Arg，
（Met，
）
）
R）
M）
缬氨酸
丙氨酸 天冬氨酸 甘氨酸
U
（Val， （Ala，A （Asn，N （Gly，
亮氨酸
脯氨酸
谷氨酰胺 精氨酸
A
（Leu， （Pro，P （Gln，Q （Arg，
L）
）
）
R）
亮氨酸
脯氨酸
谷氨酰胺 精氨酸
G
（Leu， （Pro，P （Gln，Q （Arg，
L）
）
）
R）
异亮氨
苏氨酸 天冬酰胺 丝氨酸
U
酸
（Thr，T （Asn，N （Ser，
（Ile，I
）
）
S）
）
A
异亮氨
苏氨酸 天冬酰胺 丝氨酸
V）
）
）
G）
分子生物学第四章
第一节 RNA转录的概述
2．真核生物的RNA聚合酶
真核生物的基因组比原核生物大， RNA 聚合酶也更为复杂。其相对分子质量 大都在5×105左右，有8~14个亚基，并含有 Zn2+。利用α-鹅膏蕈碱的抑制作用可将真核 生物RNA聚合酶为分三类。
第一节 RNA转录的概述
第一节 RNA转录的概述
真核生物RNA聚合酶I对α-鹅膏蕈碱不敏 感，负责转录45S rRNA前体，经转录后加工 产生5.8S rRNA、18S rRNA和28S rRNA，它 们与多种蛋白质组成的核糖体（核蛋白体）是 蛋白质合成的场所。真核生物的rRNA基因是 一类中度重复的基因，拷贝数都在数十至数百 个，人类rRNA基因约为300个拷贝。
第一节 RNA转录的概述
RNA聚合酶II转录所有mRNA前体和大多数 的核内小RNA（snRNA）。转录是遗传信息表达 的重要环节，真核生物DNA在核内转录生成 hnRNA（编码蛋白质的结构基因是在核浆中被转 录的。由于它的大小很不一致，故称核内不均一 RNA），然后加工成mRNA，并输送给细胞质的 蛋白质合成体系。hnRNA是各种RNA中寿命最短、 最不稳定的，需经常重新合成。在这个意义上说， RNA聚合酶II可认为是真核生物中最活跃的RNA 聚合酶。
第一节 RNA转录的概述
5．转录终止
当 RNA 链 延 伸 到 转 录 终 止 位 点 时 ， RNA 聚 合 酶 不 再 形 成 新 的 磷 酸 二 酯 键 ， RNA–DNA 杂 合 物 分 离 ， 转 录 泡 瓦 解 ， DNA 恢 复 成 双 链 状 态 ， 而 RNA 聚 合 酶 和 RNA 链都被从模板上释放出来，这就是转 录的终止。
第一节 RNA转录的概述 RNA聚合酶III转录tRNA、5S rRNA、 U6snRNA和不同的胞质小分子量RNA （scRNA）等小分子转录物。RNA聚合酶 III转录的产物都是相对小分子质量的RNA。 tRNA的大小都在100个核苷酸以下，5S rRNA的大小约为120个核苷酸。snRNA有 多种，由90-300个核苷酸组成，参与RNA 的剪接过程。
分子生物学第四章生物信息的传递下
5’…UUC UUC UUC UUC UUC…3’ 或 5’…UCU UCU UCU UCU UCU…3’ 或 5'…CUU CUU CUU CUU CUU…3‘ 产生UUC（Phe）、UCU（Ser）或CUU（Leu）.
实验5: 多聚三核苷酸为模板时也可能只合 成2种多肽：
5’…GUA GUA GUA GUA GUA…3’ 或5’…UAG UAG UAG UAG UAG…3’ 或5’…AGU AGU AGU AGU AGU…3’
3）氨基酸的“活化”与核糖体结合技 术
如果把氨基酸与ATP和肝脏细胞质共 培养，氨基酸就会被固定在某些热稳定且 可溶性RNA分子上。现将氨基酸活化后的 产物称为氨基酰-tRNA，并把催化该过程 的酶称为氨基酰合成酶。
3）氨基酸的“活化”与核糖体结合技 术
以人工合成的三核苷酸如UUU、UCU、 UGU等为模板，在含核糖体、AA-tRNA的反应 液中保温后通过硝酸纤维素滤膜，只有游离的 AA-tRNA因相对分子质量小而通过滤膜，而核糖 体或与核糖体结合的AA-tRNA则留在滤膜上，这 样可把已结合与未结合的AA-tRNA分开。
受体臂（acceptor arm）由配对的杆状结构和 3’端末配对的3-4个碱基所组成（CCA），最 后一个碱基—OH可以被氨酰化。
TφC臂是根据3个核苷酸命名的，其φ表示拟 尿嘧啶，是tRNA分子不常见的核苷酸。
反密码子臂是根据位于套索中央的三联Fra bibliotek密 码子命名的。
D臂是根据它含有二氢尿嘧啶（dihydrouracil） 命名的。
由于第二种读码方式产生的密码子UAG是 终止密码，不编码任何氨基酸，因此，只产生 GUA（Val）或AGU（Ser）。
实验6: 以随机多聚物指导多肽合成。
实验5: 多聚三核苷酸为模板时也可能只合 成2种多肽：
5’…GUA GUA GUA GUA GUA…3’ 或5’…UAG UAG UAG UAG UAG…3’ 或5’…AGU AGU AGU AGU AGU…3’
3）氨基酸的“活化”与核糖体结合技 术
如果把氨基酸与ATP和肝脏细胞质共 培养，氨基酸就会被固定在某些热稳定且 可溶性RNA分子上。现将氨基酸活化后的 产物称为氨基酰-tRNA，并把催化该过程 的酶称为氨基酰合成酶。
3）氨基酸的“活化”与核糖体结合技 术
以人工合成的三核苷酸如UUU、UCU、 UGU等为模板，在含核糖体、AA-tRNA的反应 液中保温后通过硝酸纤维素滤膜，只有游离的 AA-tRNA因相对分子质量小而通过滤膜，而核糖 体或与核糖体结合的AA-tRNA则留在滤膜上，这 样可把已结合与未结合的AA-tRNA分开。
受体臂（acceptor arm）由配对的杆状结构和 3’端末配对的3-4个碱基所组成（CCA），最 后一个碱基—OH可以被氨酰化。
TφC臂是根据3个核苷酸命名的，其φ表示拟 尿嘧啶，是tRNA分子不常见的核苷酸。
反密码子臂是根据位于套索中央的三联Fra bibliotek密 码子命名的。
D臂是根据它含有二氢尿嘧啶（dihydrouracil） 命名的。
由于第二种读码方式产生的密码子UAG是 终止密码，不编码任何氨基酸，因此，只产生 GUA（Val）或AGU（Ser）。
实验6: 以随机多聚物指导多肽合成。
分子生物学 第四章
AP内切核酸酶 产生单核苷酸切 口
DNA聚合酶 填补碱基
DNA连接酶
核苷酸切除与UvrAB修复系统
错配修复中子代DNA的识别
针对复制错误，所以发 生与子代DNA分子
一个问题：如何区分子 代DNA分子?
大肠杆菌中子代新生分 子尚未甲基化，从而可 以区分
甲基化位点： 5’-GATC-3’ A甲基化 5’-CCA/TGG-3’ C甲基化
Holliday模型的缺陷与 Meselson-Radding修正模式
Holliday模型的缺 陷：切口是如何出 现在两条分子的同 一位置的？
单分子切口 切口链侵入未打开
的双螺旋，形成D环 被取代链断开，形 成另一个分子上的 切口 修正：在两分子切 口形成过程中引入 交换的D环
Holliday模型修正后无法解释 基因转换
物理和化学诱变导致突变
化学： 1）碱基类似物替代标准碱基参 与复制 5-溴尿嘧啶和2-氨基嘌呤 2）脱氨 3）烷化 4）嵌入 溴化乙锭
物理： 1）紫外辐射 形成嘧啶二聚体 2）电离辐射 3）加热
突变可能不影响基因组
存在很多不影响基因组功能的突变 沉默突变：
1）突变在基因间非调控区域或基因间非编码区域， 对整体基因组功能无影响的突变。可发生在人类基因 组的98.5%。 2）编码区的突变不影响编码蛋白的氨基酸序列，同 义突变
重组的一般类型----同 源重组（一般性重组）
位点特异性重组（同源 区很短）
转座
同ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ重组
可发生于两条 同源DNA的任 意位点
真核生物中， 发生于减数分 裂时期
重组是由于异源双链体DNA间发 生断裂与重连
两条双链DNA分子间的重组关 键是单链的交换
DNA聚合酶 填补碱基
DNA连接酶
核苷酸切除与UvrAB修复系统
错配修复中子代DNA的识别
针对复制错误，所以发 生与子代DNA分子
一个问题：如何区分子 代DNA分子?
大肠杆菌中子代新生分 子尚未甲基化，从而可 以区分
甲基化位点： 5’-GATC-3’ A甲基化 5’-CCA/TGG-3’ C甲基化
Holliday模型的缺陷与 Meselson-Radding修正模式
Holliday模型的缺 陷：切口是如何出 现在两条分子的同 一位置的？
单分子切口 切口链侵入未打开
的双螺旋，形成D环 被取代链断开，形 成另一个分子上的 切口 修正：在两分子切 口形成过程中引入 交换的D环
Holliday模型修正后无法解释 基因转换
物理和化学诱变导致突变
化学： 1）碱基类似物替代标准碱基参 与复制 5-溴尿嘧啶和2-氨基嘌呤 2）脱氨 3）烷化 4）嵌入 溴化乙锭
物理： 1）紫外辐射 形成嘧啶二聚体 2）电离辐射 3）加热
突变可能不影响基因组
存在很多不影响基因组功能的突变 沉默突变：
1）突变在基因间非调控区域或基因间非编码区域， 对整体基因组功能无影响的突变。可发生在人类基因 组的98.5%。 2）编码区的突变不影响编码蛋白的氨基酸序列，同 义突变
重组的一般类型----同 源重组（一般性重组）
位点特异性重组（同源 区很短）
转座
同ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ重组
可发生于两条 同源DNA的任 意位点
真核生物中， 发生于减数分 裂时期
重组是由于异源双链体DNA间发 生断裂与重连
两条双链DNA分子间的重组关 键是单链的交换
分子生物学：DNA复制
(CsCl gradient centrifuge)
N15
DNA
N14
Semi-Conservation Replication
Source:M. Meselson and F. W. Stahl, Sciences 44:675, 1958.
半半保保留留复复制制-小结
DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为 模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代 细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则 完全重新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。 这种复制方式称为半保留复制。
RNA引物的形成
DNA链合成及延长
复制的终止
• RNApol (RNA polymerase)
[Rif S ]
完成对先导链引物的合成
实现DNA复制的转录激活起始
起
• dnaG (primase) [Rif R]
始
完成对后随链引物的合成
较先导链的启动落后一个Okazaki片断
• 完成10±NtRNA引物合成后.
遗传物质的基本属性：基因的自我复制 基因的突变 控制性状的表达
DNA复制
亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下， 分别以每 条 单链DNA分子为模板，聚合与 自身碱基可以互补配对的游离的dNTP,合 成出两条与亲代DNA分子完全相同的子代 DNA分子的过程。 主 要 包 括 引 发 、 延 伸 、 终止三个阶段。
复制发动温度敏感突变型（慢停突变） 42℃不能发动DNA复制、但可完成DNA延伸
37 ℃, 5 ci / mM H3-T , 6min
37 ℃, 52 ci / mM H3-T , 6min
分子生物学基础PPT第四章
第二节 启动子与转录的起始
3．真核生物启动子对转录的影响 TATA区和其他两个UPE区的作用有所不同（图4-5）。 前者的主要作用是使转录精确地起始，如果除去TATA区或 进行碱基突变，转录产物下降的相对值不如CAAT区或GC区 突变后明显，但发现所获得的RNA产物起始点不固定。研 究SV40晚期基因启动子发现上游激活区的存在与否，对该 启动子的生物活性有着根本性的影响。若将该基因5′上 游–21－–47核苷酸序列切除，基因完全不表达（图4-6）。
分子生物学基础
遗传信息的转录—从 第四章 遗传信息的转录 从DNA到RNA 到
第一节 RNA转录的概述
一、RNA转录的特点 RNA转录的特点 在DNA指导下RNA的合成称为转录。RNA链的转 录起始于DNA模板的一个特定起点，并在特定的终 点终止，此转录区域称为转录单位。一个转录单 位可以是一个基因或多个基因。基因的转录是一 种有选择性的过程，随着细胞的不同生长发育阶 段和细胞内外条件的改变将转录不同的基因。转 录起始主要由DNA分子上的启动子（promoter）控 制，而控制终止的部位称为终止子（teminator）。 典型的转录单位结构如图4-1。
第四节
转录后加工
图4-12 真核生物mRNA5′–端帽结构
第四节
2．3′–端加尾
转录后加工
真核生物成熟的mRNA 3′–端通常都有100~200个腺苷 酸残基，构成多聚腺苷酸（polyA）的尾巴。通过研究发 现，DNA序列中没有多聚T的序列，由此说明了3′尾巴 polyA是在转录后加上的。研究发现，它还是多聚腺苷酸 化的信号，该序列AAUAAA，因为切除该保守序列，3′–端 则不能进行切除，也不能形成polyA尾巴。3′–端polyA尾 的形成见图4-13。
华中农大分子分子生物学第4章课件
UAG UAG UAG UAA/UAG UAA/UAG UGA/UGG
AUG AGA UAA
UCU
AUG GGA UAA
AUG AGA UAA
CCU
UCU
Arg
Gly
Gly
14-18
Contents
---- tRNA
14-7
rRNAs
70S 50S 23S=2904b
3'
5'
14-15 tRNA L
tRNA
1mRNA 2
tRNA 3'CCA-tRNA mRNA--
3' 5'
CCAOH
5'
CCG
I
3'
GGC
tRNAmRNA
tRNA
1tRNAtRNA
mRNAtRNA tRNAtRNAtRNAP111
P111P120 AUG Met AA-tRNAMet-tRNAMet AUG , AA-tRNA fMet-tRNAfMet
40S
elF-3
met
Met Met-tRNAMet-elF-2 -GTP
ATP
mRNA
elF4E, elF4G, elF4A,
elF4B,PAB
ADP+Pi
60S
eIF-2BeIF-3 eIF-6
40S
60S
Met
elF-5
Met
elF GDP+Pi
()
AA-tRNA (elongation factor, EF)
3
4
20 (�)
mRNA 5 AUCGACCUGAGC
3
42=16
现代分子生物学第四章ppt课件
密码子与反密码子的相互作用
tRNA的反密码子在核 糖体内是经过碱基的反 向 配 对 与 mRNA 上 的 密 码子相互作用的。
Codon 5’ A C G 3’ Anticodon 3’ U G C 5’ is usually written as codon ACG/anticodon CGU, ACG and CGU
遗传密码： mRNA上每3个核苷酸翻译成多肽链上 的一个氨基酸，这3个核苷酸就称为一 个密码子〔三联子密码〕。
4. 1. 1 三联子密码及其破译
由于mRNA中只需4种核苷酸，蛋白质中有20 种氨基酸：
以一种核苷酸代表一种氨基酸是不能够的。
假设以两种核苷酸作为一个氨基酸的密码〔二 联子〕，能代表42=16种氨基酸。
假设以3个核苷酸代表一个氨基酸，有43=64种 密码子，满足了编码20种氨基酸的需求。
从遗传学的角度证明三联子密码的想象 是正确的
Crick等人发现T4噬菌体rII位点上两个基因的 正确表达与它能否侵染大肠杆菌有关，用吖啶 类试剂〔诱导核苷酸插入或从DNA链上丧失〕 处置使T4噬菌体DNA发生移码突变 〔frameshift mutation〕，噬菌体就丧失感染 才干。
mRNA上的密码子与tRNA上 的反密码子配对表示图
a. 密码子与tRNA反密码 子臂上相应序列配对
b. 当反密码子第一位是I时， 密码子第三位可以是A、U或C。
tRNA上的反密码子与mRNA上密码子的配对与“摆动〞分析
1．3'〕X-Y-C 〔5'〕
酪氨酸
3
缬氨酸
密码子个数 6 2 1 2 4 6 4 1 2 4
除了Arg以外，编码某一特定氨基酸的密码子个数 与该氨基酸在蛋白质中的出现频率相吻合
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DNA Polymerase
E.coli. DNA聚合酶 聚合酶I 聚合酶 E.coli. DNA聚合酶 大片段 聚合酶I大片段 聚合酶 （Klenow fragment） ） T4噬菌体 噬菌体DNA聚合酶 噬菌体 聚合酶 T7噬菌体 噬菌体DNA聚合酶 噬菌体 聚合酶 耐高温DNA聚合酶： 聚合酶： 耐高温 聚合酶 Taq DNA聚合酶 聚合酶
增和表达的DNA,它们一般是通过改造质粒、噬菌体或病毒 它们一般是通过改造质粒、 增和表达的 它们一般是通过改造质粒 等构建而成的。 等构建而成的。
质粒
噬菌体
种 类
病毒 组 合 载 体
能在宿主细胞中独立复制; 能在宿主细胞中独立复制 具有多种限制酶的单一切点（ 具有多种限制酶的单一切点（ 多克隆 位点）以便外源DNA插入； 插入； 位点）以便外源 插入
具备条件
必 要 条 件
具有筛选标记,以区别阳性与阴性重组 具有筛选标记 以区别阳性与阴性重组 分子; 分子; 分子较小，便于体外基因操作， 分子较小， 便于体外基因操作，同时 载体DNA与宿主 与宿主DNA便于分离； 便于分离； 载体 与宿主 便于分离
表达载体: 表达载体: 具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子、 具有与宿主细胞相适应的启动子、 增强子、 加尾信号等基因表达元件。 加尾信号等基因表达元件。
氯霉素扩增－氯霉素可抑制染
色体DNA复制 色体DNA复制，但质粒复制不受影 DNA复制， 可增加拷贝数。 响，可增加拷贝数。
克隆载体pUC19质粒图谱 克隆载体pUC19质粒图谱 pUC19
克隆载体pBR322质粒图谱 克隆载体pBR322质粒图谱 pBR322
质粒 用于原核宿主的载体 噬菌体 ?
λ噬菌体经过改造去除中间 噬菌体经过改造去除中间 非必需部分可以插入大片 分子（ 段DNA它原因呢？
切除非必需的中央区 λ噬菌体 噬菌体 增减某些限制性酶切位点 插入适当的筛选标记基因 λ噬菌体载体 噬菌体载体
• 置换型载体：适于克隆5-20kb的外 置换型载体：适于克隆 的外 源基因片段识别 部 位序 列 一 般为4、 或 个核苷 般为 、 5或 6个核苷 酸序列； 酸序列； ② 呈双重轴对称。 呈双重轴对称。 EcoR I
性质
切断识别部位或其附近特定部 生两种末 端 位后 ， 产 生两种末端 ， 即 平齐末端和粘性末端（ 突 平齐末端和粘性末端（5’突 出端和3’突出端）。 出端和 突出端） 突出端 Pst I
拷贝/细胞，例如 载体可达700个/细胞 拷贝 细胞，例如pUC载体可达 细胞 载体可达 个 细胞
严紧型－受受体染色体 受受体染色体DNA复制控制，拷 复制控制， 复制控制
贝数低， 几个拷贝 细胞，例如pSC101 几个拷贝/细胞 贝数低，1-几个拷贝 细胞，例如
分类
可转移型 不可转移型* 不可转移型* 兼容型 非兼容型* 非兼容型* 天然型 人工型* 人工型*
CTGC↓AG GA↑CGTC
5’突 突 出
3’突 突 出
特殊的限制酶
同裂酶isoschizomer 同裂酶
指来源不同，但有相同识别序列的限制性内切酶。 指来源不同，但有相同识别序列的限制性内切酶。
同尾酶isocaudamer 同尾酶
指识别序列不同，但切割 指识别序列不同，但切割DNA后可以产生相同粘端 后可以产生相同粘端 的限制性内切酶。 的限制性内切酶。
有
有
ATP
NAD+
粘性末端连接
载体和插入片段具有相同的粘性末端 载体和插入片段具有相同的粘性末端 容易连接成环状的重组DNA DNA分子 容易连接成环状的重组DNA分子 可在连接前， 可在连接前，用碱 可能出现问题： 可能出现问题： • 载体自身环化，造成假阳性背景克隆； 性 磷 酸 酶 将 载 体 载体自身环化，造成假阳性背景克隆； DNA 5’ 端 去 磷 酸 • 插入片段可双向插入； 插入片段可双向插入 双向插入； 化，这样只有载体 • 插入片段可多拷贝插入。 插入片段可多拷贝插入 多拷贝插入。 和插入片段之间才 能发生连接； 能发生连接； DNA片段两端为 片段两端为非同源的粘性末端 当DNA片段两端为非同源的粘性末端 可实现定向克隆，连接效率高， 可实现定向克隆，连接效率高，简捷
常用克隆载体
质粒 λ噬菌体 Cosmid 真核病毒 YAC, BAC
1、什么是质粒? 什么是质粒? 2、质粒作为基因工程载体的原因? 质粒作为基因工程载体的原因? 3、质粒的分类?基因工程使用的质粒的特点? 质粒的分类?基因工程使用的质粒的特点?
松弛型* 独立复制，拷贝数高, 松弛型*－独立复制，拷贝数高 10-200个 个
修饰酶
Reverse Transcriptase 细菌碱性磷酸酶BAP 细菌碱性磷酸酶 牛小肠碱性磷酸酶CIP 牛小肠碱性磷酸酶
Alkalinephosphatase
T4 Polymerase Kinase
载 体
载体(vector)是能够携带外源DNA进入宿主细胞进行扩 载体(vector)是能够携带外源 进入宿主细胞进行扩
利 用 磷 酸 酶 防 止 载 体 DNA 的 重 新 环 化
质粒载体的定向克隆
。
基因工程常用工具酶 限制性内切酶
作
用
识别DNA特定序列，切割DNA链 特定序列，切割 识别 特定序列 链
DNA聚合酶 或大片段 1、切口平移制作标记 聚合酶I或大片段 、切口平移制作标记DNA探针；2、合成 探针； 、合成cDNA第二 聚合酶 探针 第二 Klenow fragment 条链；3、填补双链 凹端； 、 条链； 、填补双链DNA3’凹端；4、DNA序列分析 凹端 序列分析 DNA连接酶 连接酶 Taq DNA聚合酶 聚合酶 逆转录酶 T4多核苷酸激酶 多核苷酸激酶 末端转移酶 S1核酸酶、绿豆核酸 核酸酶、 核酸酶 酶 DNA端酶 端酶I 端酶 RNA酶A 酶 磷酸酶 连接两个DNA分子或片断 分子或片断 连接两个 聚合酶链式反应（ 聚合酶链式反应（PCR） ） 合成cDNA第一条链 合成cDNA第一条链 催化多核苷酸5’羟基末端磷酸化， 催化多核苷酸 羟基末端磷酸化，制备末端标记探针 羟基末端磷酸化 在3’ 末端加入同质多聚物尾 降解单链DNA或RNA，使双链DNA突出段变为平端 降解单链 或 ，使双链 突出段变为平端 降解DNA，在双链DNA上产生随机缺口 ，在双链 降解 上产生随机缺口 降解除RNA 降解除 切除核酸末端磷酸基
+ 检
工具酶
修饰酶 连接酶 限制性内切酶
DNA聚合酶 聚合酶 DNA Polymerase 逆转录酶 Reverse Transcriptase 碱性磷酸酶 Alkalinephosphatase T4多核苷酸酶 多核苷酸酶 T4 Polymerase Kinase
限制性内切酶 活性定义
限制酶的一个活性单位（ ） 限制酶的一个活性单位（1U），原则 上是在50µl的反应液中，37℃的温 的反应液中， ℃ 上是在 的反应液中 度条件下，经过1小时反应，将 1µgDNA完全分解所需要的酶量。 完全分解所需要的酶量。 完全分解所需要的酶量
双元载体系统
克隆载体：以繁殖DNA为目的的载体， DNA为目的的载体 克隆载体：以繁殖DNA为目的的载体，通常
分类
分子较小，自我复制能力强，拷贝数高。 分子较小，自我复ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ能力强，拷贝数高。如 pBR322、pUC、M13等 pBR322、pUC、M13等。
表达载体： 表达载体：以获得基因表达产物为目的的载
体，通常要具有强启动子、结构稳定、拷贝数 通常要具有强启动子、结构稳定、 高和能在宿主细胞中高效表达等特点。 高和能在宿主细胞中高效表达等特点。
第四章 分子生物学的研究方法
一、重组DNA技术 重组DNA DNA技术
1973年 以DNA重组实验成功为标志 年 重组实验成功为标志 遗传物质是DNA 遗传物质是 DNA双螺旋结构 双螺旋结构 遗传信息传递方式 工具酶 载体 转录酶
理论上三大发现 现代分子生物学 技术上三大发明
跨越天然物种屏障 定向创造新物种
λ噬菌体载体 噬菌体载体
• 插入型载体：允许插入5-7kb的外 插入建 λgt 噬菌体载体。 噬菌体载体。
科斯质粒 (Cosmid)
粘粒、 粘粒、柯斯质粒 是指含有λ噬菌体粘性末端的杂种质粒，由 λDNA的COS区(约20-数百 数百bp)与质粒重组而 的 区 约 数百 与质粒重组而 成，在宿主细胞中可作为正常噬菌体进行复 但不表达任何噬菌体的功能。 制，但不表达任何噬菌体的功能。可以克隆 40-50Kb的外源 的外源DNA片段。 片段。 的外源 片段
Ti质粒的功能组件： 质粒的功能组件： 质粒的功能组件
T-DNA
T-DNA特点： DNA特点： 特点 • 可自发转移，并整合进植物基因组； 可自发转移，并整合进植物基因组； • 导致冠瘿瘤形成，控制冠瘿碱合成； 导致冠瘿瘤形成，控制冠瘿碱合成； • 长度 长度12-24Kb。 。
共整合载体系统
由Ti质粒衍生出的载体系统 质粒衍生出的载体系统
Ti 质粒
---天然载体系统 ---天然载体系统
土壤脓杆菌—植物病原菌— 质粒感染 质粒感染— 土壤脓杆菌—植物病原菌—Ti质粒感染—冠瘿瘤
基因导入
天然载体系统：土壤脓杆菌（ 质粒 质粒） 天然载体系统：土壤脓杆菌（Ti质粒） 发根脓杆菌（ 质粒 质粒） 发根脓杆菌（Ri质粒） 人工导入技术：基因枪、高压、激光、 人工导入技术：基因枪、高压、激光、 人工介导等
穿梭载体：带有两种复制原点，在原核细胞 穿梭载体：带有两种复制原点，
和真核细胞中都能繁殖的载体， 和真核细胞中都能繁殖的载体，通常用于真 核基因的克隆。 核基因的克隆。
克隆载体的特性
• • • • 复制起始： 复制起始：在受体细胞中独立复制 多克隆位点： 多克隆位点：含多个限制性核酸内切酶单一切点 多选择标记：抗药性， 多选择标记：抗药性，其他遗传标记 分子量小：能容纳的外源DNA DNA片段尽可能大 分子量小：能容纳的外源DNA片段尽可能大