分子生物学第四章剖析
分子生物学第四章
第一节 RNA转录的概述
2．真核生物的RNA聚合酶
真核生物的基因组比原核生物大， RNA 聚合酶也更为复杂。其相对分子质量 大都在5×105左右，有8~14个亚基，并含有 Zn2+。利用α-鹅膏蕈碱的抑制作用可将真核 生物RNA聚合酶为分三类。
第一节 RNA转录的概述
第一节 RNA转录的概述
真核生物RNA聚合酶I对α-鹅膏蕈碱不敏 感，负责转录45S rRNA前体，经转录后加工 产生5.8S rRNA、18S rRNA和28S rRNA，它 们与多种蛋白质组成的核糖体（核蛋白体）是 蛋白质合成的场所。真核生物的rRNA基因是 一类中度重复的基因，拷贝数都在数十至数百 个，人类rRNA基因约为300个拷贝。
第一节 RNA转录的概述
RNA聚合酶II转录所有mRNA前体和大多数 的核内小RNA（snRNA）。转录是遗传信息表达 的重要环节，真核生物DNA在核内转录生成 hnRNA（编码蛋白质的结构基因是在核浆中被转 录的。由于它的大小很不一致，故称核内不均一 RNA），然后加工成mRNA，并输送给细胞质的 蛋白质合成体系。hnRNA是各种RNA中寿命最短、 最不稳定的，需经常重新合成。在这个意义上说， RNA聚合酶II可认为是真核生物中最活跃的RNA 聚合酶。
第一节 RNA转录的概述
5．转录终止
当 RNA 链 延 伸 到 转 录 终 止 位 点 时 ， RNA 聚 合 酶 不 再 形 成 新 的 磷 酸 二 酯 键 ， RNA–DNA 杂 合 物 分 离 ， 转 录 泡 瓦 解 ， DNA 恢 复 成 双 链 状 态 ， 而 RNA 聚 合 酶 和 RNA 链都被从模板上释放出来，这就是转 录的终止。
第一节 RNA转录的概述 RNA聚合酶III转录tRNA、5S rRNA、 U6snRNA和不同的胞质小分子量RNA （scRNA）等小分子转录物。RNA聚合酶 III转录的产物都是相对小分子质量的RNA。 tRNA的大小都在100个核苷酸以下，5S rRNA的大小约为120个核苷酸。snRNA有 多种，由90-300个核苷酸组成，参与RNA 的剪接过程。
分子生物学重点剖析
分子生物学重点一．名词解释C值通常是指一种生物单倍体基因组DNA的总量，以每细胞内的皮克数表示1.C值反常现象：也称C值谬误，指C值（指一种生物单倍体基因组DNA的总量，以每细胞内的皮克（pg）数表示）往往与种系的进化复杂性不一致的现象，即基因组大小与遗传复杂性之间没有必然的联系，某些较低等的生物C值却很大。
如一些两栖类物种的C值甚至比哺乳动物还大。
2.RNA编辑：是某些RNA，特别是mRNA的一种加工方式，它导致DNA所编辑的遗传信息的改变，因为经过编辑的mRNA序列发生了不同于模板DNA的变化。
3.RNA剪接：从mRNA前体分子中切除被称为内含子的非编码区，并使基因中被称为外显子的编码区拼接形成成熟mRNA的过程就成为RNA的剪接4.内含子的变位剪切：在高等真核生物中，内含子通常是有序或者组成性地从mRNA前体中被剪接。
然而在个体发育或细胞分化的某个或某些特定阶段可以有选择性地穿越某些外显子或者某个剪接点进行RNA剪接，产生出组织或发育阶段特异性mRNA，称为RNA的变位剪接。
5.安慰性诱导物：指的是与转录调控过程中实际诱导物相似的一类高效诱导物，但不是该诱导酶的底物。
6.编码连：指双链DNA中与mRNA序列（出T/U替换外）和方向相同的那条链，又称有意义连。
7.操纵子：是指原核生物中由一个或多个相关基因以及转录翻译调控元件组成的基因表达单元。
8.插入序列：是最简单的转座子，是细菌的一小段可转座元件，它不含有任何宿主基因而被称为插入序列，它们是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分。
9.重叠基因：具有部分共用核苷酸序列的基因，即同一段DNA携带了两种或两种以上不同蛋白质的编码信息。
重叠的序列可以是调控基因，也可以是结构基因部分。
常见于病毒和噬菌体基因组中。
10.二组分调控系统：由于细胞膜上的传感蛋白（该蛋白通常有激酶活性）以及位于细胞质基质中的应答调节蛋白组成。
传感激酶常受到膜外环境信号刺激时被磷酸化，并将其磷酸基团转移到应答蛋白上，使该磷酸化的应答调节蛋白成为阻遏蛋白或者诱导蛋白，通过对操纵子的阻遏或激活作用调控下游基因表达11.反式作用因子：是指能够结合顺式作用元件上调控基因表达的蛋白质或者RNAs。
分子生物学第四章生物信息的传递下
实验5: 多聚三核苷酸为模板时也可能只合 成2种多肽：
5’…GUA GUA GUA GUA GUA…3’ 或5’…UAG UAG UAG UAG UAG…3’ 或5’…AGU AGU AGU AGU AGU…3’
3）氨基酸的“活化”与核糖体结合技 术
如果把氨基酸与ATP和肝脏细胞质共 培养，氨基酸就会被固定在某些热稳定且 可溶性RNA分子上。现将氨基酸活化后的 产物称为氨基酰-tRNA，并把催化该过程 的酶称为氨基酰合成酶。
3）氨基酸的“活化”与核糖体结合技 术
以人工合成的三核苷酸如UUU、UCU、 UGU等为模板，在含核糖体、AA-tRNA的反应 液中保温后通过硝酸纤维素滤膜，只有游离的 AA-tRNA因相对分子质量小而通过滤膜，而核糖 体或与核糖体结合的AA-tRNA则留在滤膜上，这 样可把已结合与未结合的AA-tRNA分开。
受体臂（acceptor arm）由配对的杆状结构和 3’端末配对的3-4个碱基所组成（CCA），最 后一个碱基—OH可以被氨酰化。
TφC臂是根据3个核苷酸命名的，其φ表示拟 尿嘧啶，是tRNA分子不常见的核苷酸。
反密码子臂是根据位于套索中央的三联Fra bibliotek密 码子命名的。
D臂是根据它含有二氢尿嘧啶（dihydrouracil） 命名的。
由于第二种读码方式产生的密码子UAG是 终止密码，不编码任何氨基酸，因此，只产生 GUA（Val）或AGU（Ser）。
实验6: 以随机多聚物指导多肽合成。
分子生物学：DNA复制
(CsCl gradient centrifuge)
N15
DNA
N14
Semi-Conservation Replication
Source:M. Meselson and F. W. Stahl, Sciences 44:675, 1958.
半半保保留留复复制制-小结
DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为 模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代 细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则 完全重新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。 这种复制方式称为半保留复制。
RNA引物的形成
DNA链合成及延长
复制的终止
• RNApol (RNA polymerase)
[Rif S ]
完成对先导链引物的合成
实现DNA复制的转录激活起始
起
• dnaG (primase) [Rif R]
始
完成对后随链引物的合成
较先导链的启动落后一个Okazaki片断
• 完成10±NtRNA引物合成后.
遗传物质的基本属性：基因的自我复制 基因的突变 控制性状的表达
DNA复制
亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下， 分别以每 条 单链DNA分子为模板，聚合与 自身碱基可以互补配对的游离的dNTP,合 成出两条与亲代DNA分子完全相同的子代 DNA分子的过程。 主 要 包 括 引 发 、 延 伸 、 终止三个阶段。
复制发动温度敏感突变型（慢停突变） 42℃不能发动DNA复制、但可完成DNA延伸
37 ℃, 5 ci / mM H3-T , 6min
37 ℃, 52 ci / mM H3-T , 6min
基因突变细胞分子生物学效应
第四章基因突变的细胞分子生物学效应细胞是机体正常生命活动的根本单位，也是机体疾病发生的病理生理根基。
人类疾病的发生，正是在各样内外环境致病要素作用下，造成机体组织细胞内正常代谢机能杂乱，以致发生细胞病变的综合表现。
基因是细胞内遗传信息的物质载体；蛋白质是基因功能的主要表达者。
亦即，细胞的全部生命活动现象，最后表达为蛋白质的各样构造特点和功能活动状况。
所以，在以遗传要素为主导要素或主要病因的疾病中，基因突变的直接细胞分子生物学效应，就是改变了由其所编码的多肽链的质量或数目，以致蛋白质的功能构造异样。
而细胞生理活动的异样及机体遗传性状的改变，那么是蛋白质功能构造异样的结果。
Physiological,Genetic,andDevelopmentalHomeostasis Alogicofdiseasemustbebasedonrelationshipsbetweenphysiological,genetic,and developmentalhomeostasisandonprevalentcultures.Susceptibility,madeupofacc umulatingeffectsofgenesandexperiences,becomesadiseasewhoseformdependsonth especificityofthegenesandexperiencesaswellasontheindividualityofontogeny. Theseelements,whichcanbeseentocomprehendWaddington ’sthreetime----theframespresent,thelifetime,andthebiologicalpast,inanarrangementthatallowsthephys iciantoanalyzeeachcaseaccordingtotheindividualarrayofconstituents,whichis tosay,totheindividualityofthecase,whichitselfshouldhelpinthechoiceoftreat ment.Isitnotalsoplausiblethatsoindividualananalysisofapatient’diseasemus tleadthedoctortoobservethespecificityofthepatientasaperson?第一节基因突变以致蛋白质功能异样基因突变对蛋白质所产生的影响可表此刻以下几个方面：①直接影响了有关功能蛋白质的生物合成；②以致蛋白质产生异样的功能效应；③以致组织细胞蛋白质表达种类的改变；④波及到蛋白质的分子细胞生物学效应与相应临床表型之间的关系。
华中农大分子分子生物学第4章课件
UAG UAG UAG UAA/UAG UAA/UAG UGA/UGG
AUG AGA UAA
UCU
AUG GGA UAA
AUG AGA UAA
CCU
UCU
Arg
Gly
Gly
14-18
Contents
---- tRNA
14-7
rRNAs
70S 50S 23S=2904b
3'
5'
14-15 tRNA L
tRNA
1mRNA 2
tRNA 3'CCA-tRNA mRNA--
3' 5'
CCAOH
5'
CCG
I
3'
GGC
tRNAmRNA
tRNA
1tRNAtRNA
mRNAtRNA tRNAtRNAtRNAP111
P111P120 AUG Met AA-tRNAMet-tRNAMet AUG , AA-tRNA fMet-tRNAfMet
40S
elF-3
met
Met Met-tRNAMet-elF-2 -GTP
ATP
mRNA
elF4E, elF4G, elF4A,
elF4B,PAB
ADP+Pi
60S
eIF-2BeIF-3 eIF-6
40S
60S
Met
elF-5
Met
elF GDP+Pi
()
AA-tRNA (elongation factor, EF)
3
4
20 (�)
mRNA 5 AUCGACCUGAGC
3
42=16
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运输功能
如载体蛋白，血红蛋白等 ，在生物体内运输各种物 质。
免疫功能
如抗体蛋白，参与生物体 的免疫应答。
18
蛋白质的功能与调控
调节功能
如激素，生长因子等，调节生物 体的生长发育和代谢过程。
2024/2/29
储存功能
如植物种子中的贮藏蛋白，动物体 内的肌红蛋白等，储存能量和营养 物质。
个性化医疗
根据患者的基因信息，制定个 性化的治疗方案。
药物基因组学
预测患者对药物的反应和副作 用，指导合理用药。
30
基因治疗的原理与应用
基因治疗的原理
通过导入正常基因或修复缺陷基因， 从而治疗由基因突变引起的疾病。
遗传性疾病的治疗
如视网膜色素变性、腺苷脱氨酶缺乏 症等。
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癌症治疗
利用基因编辑技术，修复或敲除癌症 相关基因，抑制肿瘤生长。
基因表达调控的层次
基因表达调控可分为转录前调控、转录水平调控、转录后调控和翻 译水平调控等多个层次。
基因表达调控的意义
基因表达调控对于生物体的生长发育、代谢、免疫应答等生理过程具 有重要意义，同时也是疾病发生发展的重要因素。
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22
原核生物的基因表达调控
1 2 3
原核生物基因表达调控的特点
26
DNA损伤的修复机制
直接修复
针对某些简单的DNA损伤，如碱 基错配，可通过特定的酶直接进行 修复。
碱基切除修复
通过识别并切除受损碱基，再合成 新的DNA片段进行修复。
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核苷酸切除修复
针对较严重的DNA损伤，如嘧啶 二聚体，通过切除一段包含受损部
分子生物学第四章--基因工程常用工具酶
同裂酶：识别位点相同，酶的来源不同。
同尾酶：识别位点不同，切出片段有相同末端序列。
B．以切出片段末端性质不同可分，粘性末端和平末端。
粘性末端：（Cohesive Ends）两个突出末端可退火互补— — DNA是分子重组的基础
15
同裂酶
又称异源同工酶。指来源不同，但具有相同的识别 序列。 在切割DNA时，其切割点可以是相同的，产生平 头末端，称为同识同切； 切割点也可以是不同的，产生3ˊ或5ˊ粘性末端， 称为同识异切。
第四章 基因工程常用工具酶
1
Manipulating Genes
- Transferring Genes
Restriction Ligation Extract DNA
Transformation
Selection
Culturing
2
重组DNA实验中常见的主要工具酶
3
我们的基本目的是：把外源基因与载体 连接在一起形成重组DNA分子，最少需要以 下两类工具酶：
23
如果用一种限制酶，切割两种不同的DNA时，
产生相同的末端，混合后“退火”，这两种不同的
DNA分子彼此可以连接，形成重组DNA分子。
24
限制性内切酶的剪切方式
25
Yu Zheng, et al. Using shotgun sequence data to find active restriction enzyme genes. Nucleic Acids Res., 2009, 37: e1. Whole genome shotgun sequence analysis has become the standard method for beginning to determine a genome sequence. The preparation of the shotgun sequence clones is, in fact, a biological experiment. It determines which segments of the genome can be cloned into Escherichia coli and which cannot. By analyzing the complete set of sequences from such an experiment, it is possible to identify genes lethal to E. coli.
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(书写DNA序列时，仅写非模板序列，可不注明极性方向)
DNA 5’---ATGAGTA----3’ Non-template (sense strand) 3’---TACTCAT----5’ template (antisense strand)
a) promoter 由两个重要部分组成 ● -70 ~ -40 CAP—cAMP binding site
基因表达调控的正控制位点 CAP: cAMP Acceptor Protein
(环化AMP受体蛋白) ● -35 ~ -10 RNApol. binding site
分子生物学第四章剖析
Promoter region identified by DNAase method
RNA 5’----四章剖析
● 某一基因只以一条单链DNA 为模板进行转录（不对称转录） ● RNA的转录包括promotion, elongation, termination 三步骤
● 从启动子（promoter）到终止子（terminator）称为 转录单位 （transcriptional unit）
● 原核生物中的转录单位多为 polycistron in operon 真核生物中的转录单位多为monocistron, No operon
● 转录原点记为+1，其上游记为负值，下游记为正值
-10 upstream
+1 start point
分子生物学第四章剖析
+10 downstream
Discovery of messenger RNA
after incubation and break up E. coli add N14C12 ribosome as Ck
分子生物学第四章剖析
density gradient results
P32 T2 RNA S 35 T2 protein
bottom
top
bottom
top
分子生物学B第r四en章n剖e析r, Jacob & Meselson (1961)
T2 phage
E. coli
Host RNA stopped T2 RNA starting
分子生物学第四章剖析
Brenner, Jacob & Meselson (1961) T2 phage
N15C13
Heavy ribosome in E. coli
Shift to N14C12
label RNA with P32 or protein with S35
1955 Brachet
synthesis of protein depend on the RNA
1955 Goldstein & Plaut RNA synthesized in nucleus and protein synthesized in cytoplasm
1956. Elliot Volkin & Lawrence Astrachan
terminator of Prokaryotes 4.7 Pre-RNA processing in Eukaryotes
分子生物学第四章剖析
4.1 基本概念
分子生物学第四章剖析
● 基因表达的第一步 ● 以D. S. DNA中的一条单链作为转录的模板 ● 在依赖DNA的RNA聚合酶的作用下 ● 按A U，C G 配对的原则，合成RNA分子 ● 模板单链 DNA的极性方向为3’ → 5’, 而非模板单链
The music (polypeptide) depends on the tape (mRNA), not the player (ribosome)
分子生物学第四章剖析
4.2 RNA Transcription promotion in prokaryotes
分子生物学第四章剖析
4.2.1 Promoter 的结构与功能 ( Prok. E. coli )
足以携带一个基因的遗传信息，指导T2蛋白质的合成
至少暂时连接在核糖体上
核糖体无特异性
分子生物学第四B章r剖en析ner, Jacob & Meselson (1961)
Jacob. Monod
nonspecialized ribosomes that translate unstable RNAs called messengers (messenger RNA, mRNA) messengers are independent RNAs bring genetic information from the genes to ribosomes
基因的表达
Gene expression
分子生物学第四章剖析
第4章 RNA转录
(RNA transcription)
分子生物学第四章剖析
4.1 基本概念 4.2 原核生物RNA转录启动子 4.3 真核生物RNA转录启动子 4.4 Transcription Elongation 4.5 Transcription termination 4.6 Anti-termination in Rho-dependent
N15C13
+
N15C13
+
N14C12 ribosome as CK
T2侵染E. coli后
核糖体上负载的RNA的碱基比与T2相似，而与E. coli相差甚远
E. coli 停止合成RNA & protein
T2利用寄主细胞的转录元件和核糖体合成RNA & protein
核糖体上负载的RNA
是以T2DNA为模板转录的（其碱基组成反映了DNA的核苷酸序列）
RNA polymerase (no NTP) DNase digestion DNA
dissolve
+
分子生物学第四章剖析
DNA sequencing
Promoter region including
Sextama Box ; -35 site RNApol. loosely binding site RNApol. recognition site (R site) TTGAC (Sextama Box)
Pribnow Box ; -10 site RNApol. firmly binding site (B site) TATAAT (pribnow Box)