第十四章基因重组和基因工程
第七版生物化学_第14章基因工程
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DNA
连接酶 3´
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拼 接
片 段
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重
重
组
组
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体
体
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3´ 内切酶
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(ruvC)
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5´ 3´
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DNA
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连接酶
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53´´
5´
E.coli同源重组分子机制：
需数十种酶参与，其中最关键的是：RecA蛋白、 RecBCD复合物及RuvC蛋白。 RecA蛋白是由rec基因编码的，可结合单链DNA， 形成RecA—ssDNA复合物。 RecA蛋白具有多个DNA 结合位点，因此线性RecA—ssDNA复合物可以通过插 入同源的DNA双螺旋的大沟，形成三链DNA中间物， 并通过旋转逐渐取代双螺旋DNA中的一条链，与互补 链配对，将同源链置换出来，产生新的双链DNA分子， 从而完成DNA重组。
通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细 胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转 化作用 (transformation)。
例如：当细菌破裂溶解（溶菌）时，其裂解 的DNA片断可被另一细菌作为外源DNA摄取，并 重组整合进自己的基因组，随细菌基因一起复制、 转录、翻译，使受体菌获得新的遗传表型。
目录
2.倒位重组及后果： 以hix为特异重组位点，在倒位酶作用下，两个hix 之间的H片段进行特异位点重组(倒位)。其结果是 H2和rH1基因不表达，因为没有了启动子。但远方 的H1基因因没有阻遏蛋白的抑制而得以表达。所以， 倒位重组的后果是表达H1鞭毛蛋白而不表达H2鞭毛 蛋白。因此，沙门氏菌的位相是由于它的两种鞭毛 蛋白质H1和H2的交迭表达。在某一时期，菌体表达 其中的一种，但从不表达两种。
基因重组和基因工程
5´
3´
5´ 3´
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5´ 拼 接
重
组
体
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3´ 内切酶
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(ruvC)
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5´ 3´
片 5´ 段 3´ 重 组 体 53´´
3´ 5´
DNA
连接酶
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3´ 5´
二、细菌的基因转移与重组
（一）接合作用
当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接 触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移 至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合 作用(conjugation)。
（三）转导作用
当病毒从被感染的（供体）细胞释放出 来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在 供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基 因重组即为转导作用(transduction)。
例 λ噬菌体的生活史
溶菌生长途径 (lysis pathway)
溶源菌生长途径 (lysogenic pathway)
①两个同源染色体DNA排列整齐
5´
3´
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5´
3´
5´
5´
3´
②一个DNA的一条链断裂、并与另一个 DNA对应的链连接，形成Holliday中间体
③通过分支移动产生异源双链DNA
5´
3´
5´
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5´ 内切酶 3´
3´ 5´
5´
3´
(recBCD)
3´ 5´
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3´
5´
3´
5´ 分支迁移 3´
3´
5´ (recA) 3´
催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针
在3´羟基末端进行同质多聚物加尾
切除末端磷酸基
第十四章基因重组与基因工程.pptx
DNA利用菌体的酶系统，复制自身及 外壳蛋白，组装成大量新 噬菌体，并 将细菌涨破。
• 溶原 和裂 解可 以相 互转 变。
整合
转导
• 溶原菌中 DNA可以原样地切离出来， 也可以把邻近的宿主DNA在切离时带走 一部分。后者称转导。
酶有不止一个切口，需经过改造。 • 一个切口：插入型载体。 • 二个切口：置换型载体。
噬菌体载体
目的基因的来源
• 直接从染色体DNA中分离：原核生物 • 人工合成：简单的多肽 • 从NA后建库。
穿梭质粒
酵母
动 植 物 病 毒 、 组织培养细胞 昆虫载体 DNA 直 接 导 入 生 殖 细 胞
DNA重组体的筛选与鉴定
• 根据重组载体的表型进行筛选： 如质粒的抗药性、营养素的依赖型
• DNA限制酶切图谱分析： 提取经粗选后的宿主DNA，用限制性内 切酶切割后与原来载体比较。
• 利用核酸杂交和放射自显影进行鉴定： 用目的基因作探针监测宿主DNA是否重 组体。
分 切 接 转 筛
载体和目的基因
• 载体：vector 在宿主细胞内可独立复制的完整DNA分 子。但必须利用宿主的酶系统，才能有 进一步的基因表达能力。
• 常用的载体有： 质粒、 噬菌体 、 M13 噬菌体 逆转录病毒DNA、昆虫病毒DNA
• 载体与宿主共培育可大量生成，经纯化 后可用于基因工程。
转化
细菌的转化
转化
• 病毒癌基因 感染宿主细 胞后，可整 合到宿主染 色体上，从 而使宿主细 胞癌变。
细胞的转化
转染：噬菌体感染宿主菌后，核酸进入菌体 内的过程。
整合
• 整合： 噬菌体感染大肠杆菌的第一步 噬菌体粘附于细胞壁上，将自身的 DNA注入菌体中。 此 DNA可与细菌染 色体重组，成为细菌染色体的一部分。
第十三、十四章 基因重组与基因工程 -
二、切－限制性内切酶（restriction endonuclease）的应用
定义：是一类能识别和切割双链DNA分子
中特定碱基顺序的核酸水解酶。
分类
I 型：复合功能酶－内切、甲基化、
ATP酶和DNA解旋；
III型：内切、甲基化 II 型：识别和切割双链DNA的特异顺序
三、接－外源基因与载体的连接
基因的改造 “显微工程”
三件必备“工具”
第一节 重组DNA技术相关概念及意义
一、有关DNA克隆的相关概念
克隆（clone）:
通过无性繁殖过程
所产生的与亲代完全相同的子代群
体。获取着一群体的过程称为克隆 化（cloning）。
重组DNA技术(recombinant DNA
technology) ： 是按人类的意愿，在体外
第十四章 基因重组与基因工程
Genetic engineering enables scientists to produce clones of cells or organisms that contain the same genes.
自然进化
人 工 育 种
畜力车
基因工程基因工程基因组(genomiclibrary)：将
某种生物细胞的基因组DNA切割成一定 大小的片段后，分别与合适的载体重组 并导入宿主细胞内克隆保存。这种保存 在宿主细胞内的整个library)：将分离
纯化获得某种真核细胞中的全部mRNA， 并将mRNA逆转录成cDNA，如此获得的 cDNA通过重组、克隆方法保存在宿主细 胞中。这种保存在-gal筛选
杂交（核酸分子杂
交、菌落原位杂交）
序列分析
生物化学试题及答案(14
生物化学试题及答案〔14〕第十四章基因重组与基因工程[测试题]一、名词解释：1.基因工程〔geneticengineering〕。
2.接合作用(conjugation)。
3.转化作用(transforation)。
4.转导作用(transduction)。
5.转座(transposition)。
6.转座子(transposons)。
7.同源重组(homologousrecombination)。
8.全然重组(generalrecombination)。
9.DNA克隆〔DNAcloning〕。
10.复制子(replicon)。
11.限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)。
12.回文结构〔palindrome〕。
13.配伍末端〔compatibleend〕。
14.目的DNA〔targetDNA〕。
15.互补DNA(complementaryDNA；cDNA)。
16.克隆载体(cloningvector)。
17.表达载体(expressionvector)。
18.质粒(plasmid)。
19.α—互补(alphacomplementation)。
20.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)。
21.标志补救(markerrescue)。
22.转染〔transfection〕。
23.基因组DNA〔genomicDNA〕。
24.感受态细胞〔competentcell〕。
25.聚合酶链反响(polymerasechainreaction)。
26.cDNA文库(cDNAlibrary)。
27.保守性转座(conservativetransposition)。
28.复制性转座(duplicativetransposition)。
29.溶菌生长途径(lysispathway)。
30.溶源生长途径(lysogenicpathway)。
二、填空题：31.自然界的常见基因转移方式有____、____、____、____。
生物化学第十四章-基因重组和基因工程
第十四章基因重组和基因工程一、自然界的基因转移和重组：基因重组(gene recombination)是指DNA片段在细胞内、细胞间，甚至在不同物种之间进行交换，交换后的片段仍然具有复制和表达的功能。
1．接合作用：当细胞与细胞相互接触时，DNA分子即从一个细胞向另一个细胞转移，这种遗传物质的转移方式称为接合作用（conjugation）。
2．转化和转染：由外来DNA引起生物体遗传性状改变的过程称为转化(transformation)。
噬菌体常常可感染细菌并将其DNA注入细菌体内，也可引起细菌遗传性状的改变。
通过感染方式将外来DNA引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染(transfection)。
转染是转化的一种特殊形式。
3．整合和转导:外来DNA侵入宿主细胞，并与宿主细胞DNA进行重组，成为宿主细胞DNA的一部分，这一过程称为整合。
整合在宿主细胞染色体DNA中的外来DNA，可以被切离出来，同时也可带走一部分的宿主DNA，这一过程称为转导(transduction)。
来源于宿主DNA的基因称为转导基因。
4．转座：转座又称为转位（transposition），是指DNA的片段或基因从基因组的一个位置转移到另一个位置的现象。
这些能够在基因组中自由游动的DNA片段包括插入序列和转座子两种类型。
⑴插入序列：典型的插入序列（insertion sequence，IS）是长750-1500bp的DNA片段，由两个分离的反向重复序列和一个转座酶基因。
当转座酶基因表达时，即可引起该序列的转座。
其转座方式主要有保守性转座和复制性转座。
⑵转座子：转座子(transposons)是可从一个染色体位点转移到另一个位点的分散的重复序列，含两个反向重复序列、一个转座酶基因和其他基因（如抗生素抗性基因）。
免疫球蛋白重链基因由一组可变区基因（VH）和一组恒定区基因（CH）构成，通过这些基因的选择性转座和重组，就可以转录表达出各种各样的免疫球蛋白重链，以对付不同的抗原。
中国医科大学-生物化学-14 基因重组与基因工程
Holliday模型中，同源重组主要4个关键步骤
①两个同源染色体DNA排列整齐 ②一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA
对应的链连接，形成Holliday中间体 ③通过分支移动产生异源双链DNA ④Holliday中间体切开并修复，形成两个双链
重组体DNA，分别为： 片段重组体(patch recombinant)
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3´ DNA 5´
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Holiday中间体
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内切酶 (ruvC)
5´ 3´
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Hale Waihona Puke 3´5´5´ 3´
5´ 3´ 5´ 3´
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DNA连接酶
Ⅰ类酶由三种不同的亚基组成，需要Mg2+、 S-腺苷酸甲硫氨酸(SAM)和ATP为辅助因子。这 类酶识别部位复杂，特异性差，通常在识别部位 周围400～7000bp范围内切割DNA。
Ⅲ类酶由二种亚基组成，需要Mg2+、ATP为辅 助因子，DNA切割发生在识别部位周围25～27bp 范围内。
Ⅱ类酶由一种亚基构成，切割DNA仅需要 Mg2+作为辅助因子，DNA切割就发生在特异识 别部位范围内。Ⅱ类酶切割DNA的特异性强， 被分子生物学家广泛研究，通常所指的限制性内 切酶，即指此类酶而言。
例 （一）λ噬菌体DNA的整合
λ噬菌体的整合酶识别噬菌体DNA和宿主 染色体的特异靶位点发生选择性整合；反转 录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病 毒 cDNA 的 长 末 端 重 复 序 列 (long terminal repeat, LTR)。
医学分子生物学——基因重组与基因工程
医学分子生物学名词解释——基因重组与基因工程1、同源重组：发生在同源序列间的重组，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。
又称基本重组。
2、转化作用：通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用。
3、转导作用：当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用。
4结合作用：当细胞或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用。
5位点特异重组：是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。
6转座：由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座。
7、DNA克隆：应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质DNA与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA。
8、基因载体：为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
10、载体：克隆载体为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。
9、表达载体：为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。
10、同尾酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。
15、配伍末端：有些限制性内切酶虽然识别序列完全相同，但切割DNA后产生相同类型的粘性末端，称为配伍末端，可进行相互连接。
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第十四章基因重组和基因工程Genetic Recombination and Genetic Engineering一、DNA的重组(DNA recombination)：DNA重组的类型：接合(conjugation)、转化(transformation)和转导(transduction)的基本概念；特异位点重组(site-specigic recombination)和转座重组(transposition)。
2学时二、重组DNA技术：DNA克隆(DNA cloning)、工具酶、目的基因(target DNA)、基因载体(cloning vector)；重组DNA技术基本原理及操作步骤。
3学时三、简介重组DNA技术与医学的关系。
1学时总学时：6学时一、DNA的重组（DNA Recombination）DNA重组的类型：同源重组(homologous recombination)、接合(conjugation)、转化(transformation)、转导(transduction)特异位点重组(site-specigic recombination)和转座重组(transposition)。
（一）同源重组发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination)，又称基本重组。
是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。
Homologous recombination（同源重组）: Recombination between two DNA molecules of similar sequence, occurring in all cells.以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的Holliday模型。
Holliday 模型中，同源重组主要4个关键步骤：1．两个同源染色体DNA排列整齐2．一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday 中间体3．通过分支移动产生异源双链DNA4．Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：片段重组体(patch recombinant)：切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。
拼接重组体(splice recombinant)：切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。
（二）细菌的基因转移与重组1．接合作用：当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用(conjugation)。
2．转化作用：通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用 (transformation)。
Transformation: Introduction of an exogenous DNA into a cell, causing the cell to acquire a new phenotype.3．转导作用：当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用(transduction)。
Transduction: The transfer of genetic information from one cell to another by means of a viral vector.（三）位点特异重组位点特异重组(site-specific recombination) 是由整合酶催化，在两个DNA 序列的特异位点间发生的整合。
Site-specific recombination: A type of genetic recombination that occurs only at specific sequences.（四）转座重组：由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座(transposition)。
Transposition: The movement of a gene or set of genes from one site in the genome to another.1．插入序列转座：插入序列(insertion sequences, IS)组成：二个分离的反向重复(inverted repeats, IR)序列，特有的正向重复序列。
发生形式：保守性转座(conservative transposition)复制性转座(duplicative transposition)2．转座子转座：转座子(transposons) ——可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。
Transposon (transposable element): A segment of DNA that can move from one position in the genome to another.转座子组成：反向重复序列；转座酶编码基因；抗生素抗性等有用的基因。
二、重组DNA技术（Recombination Technique）（一） DNA克隆：克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。
用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA)。
DNA cloning: Recombinant DNA technique in which specific cDNAs or fragments of genomic DNA are inserted into a cloning vector, which then is incorporated into cultured host cells (e.g., E. coli cells) and maintained during growth of the host cells; also called gene cloning.生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等基因工程(genetic engineering) —实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。
目的：①分离获得某一感兴趣的基因或DNA② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）（二）工具酶：限制性核酸内切酶； DNA聚合酶Ⅰ；逆转录酶；T4DNA连接酶；碱性磷酸酶；末端转移酶；Taq DNA聚合酶。
1．限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。
分类：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）。
作用：与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。
命名：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。
Ⅱ类酶识别序列特点—回文结构(palindrome)。
切口：平端切口、粘端切口同功异源酶：来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。
同尾酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。
这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。
（三）目的基因1．cDNA (complementary DNA)2．基因组DNA (genomic DNA)（四）基因载体定义-为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
常用载体--质粒DNA；噬菌体DNA；病毒DNA。
克隆载体(cloning vector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。
Cloning vector: An autonomously replicating genetic element used to carry a cDNA or fragment of genomic DNA into a host cell for the purpose of gene cloning. Commonly used vectors are bacterial plasmids and modified bacteriophage genomes.表达载体(expression vector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。
Expression vector: A modified plasmid or virus that carries a gene or cDNA into a suitable host cell and there directs synthesis of the encoded protein. Some expression vectors are designed for screening DNA libraries for a gene of interest; others, for producing large amounts ofa protein from its cloned gene.1. 质粒 (plasmid)：能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。
2. 噬菌体(phage)：3. 粘性质粒(cosmid)：4．其他：酵母人工染色体(yeast artificial chromosome, YAC)；细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC)；动物病毒DNA改造的载体：如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒。
（五）重组DNA技术基本原理目的基因的获取，克隆载体的选择和构建，外源基因与载体的连接，DNA导入受体菌，重组体的筛选，克隆基因的表达。
1．目的基因的获取：（1）. 化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。
（2）.基因组DNA文库(genomic DNA library)（3）. cDNA文库(cDNA library)（4）. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)2．克隆载体的选择和构建：3．外源基因与载体的连接：1.）粘性末端连接方式：(1)同一限制酶切位点连接；(2)不同限制酶切位点连接：配伍末端连接；非配伍末端连接。