第五章 沉淀分离分析

（5-1） （5-2）
式中：S — 蛋白质的溶解度（g/L） I — 离子强度 mi — i离子的摩尔浓度（mol/L） Zi — i离子所带的电荷数（即离子的价数） β — 盐析常数，与盐的种类无关 KS — 盐析常数，与温度和pH无关
• 关于β值： （ 1 ） β 值与盐的种类无关，在式（ 5-1 ）中， 令I=0，则： β=lg S0 （5-3）
5.2 盐析法
一般说来，所有固性溶质都可以在溶液中加 入中性盐而沉淀析出，这一过程称为盐析。盐 析法具有如下特点： （ 1 ） 成本低，不需要什么特别昂贵的设备； （2）操作简单、安全； （3）对许多生物活性物质具有稳定作用； （ 4 ） 存在产品与杂质的共沉作用，因而它 只能作为初步纯化。
5.2.1 基本原理
蛋白质溶液少量中性盐 增加蛋白质分子与水分子的相 互作用→蛋白质溶解度↑
5.2.1.1盐析原理
（3）盐析作用（Salting-out)：
加入大量中性盐
水分子离开蛋白质 蛋白质溶液→亲水基团被中性盐包围 暴露疏水区域 →疏水基团的相互作用→蛋白质相互聚集（溶解度下降）
• 蛋白质在高盐浓度下发生盐析，这是因为当中性盐浓度增加至一 定程度时，蛋白质表面电荷被大量中和（亲水基团被大量中性盐 离子所包围），水分子离开蛋白质的周围，暴露出疏水区域，疏
亲水基团 水合作用 形成水化膜 分子间彼此隔开 稳定的亲水溶液 水分子
5.2.1.1盐析原理
（2）盐溶作用(Salt-in)： • 蛋白质在低盐浓度下发生盐溶，这是因为当向 蛋白质溶液中加入少量中性盐时，中性盐离子 对蛋白质分子表面亲水基团（及水活度）的影 响，增强了蛋白质分子与水分子的相互作用力， 从而使蛋白质的溶解度增大。
5.1 概述
• 沉淀分离的应用 沉淀分离具有成本低、收率高、浓缩倍数大 和操作简单等优点，因而广泛应用于氨基酸、 酶制剂、抗菌素等生物工业中。 对于某些不需纯度要求的生物产品（如工业 用酶制剂），沉淀分离是一种常用提取方法。 但对于某些纯度要求很高的生物产品，在沉 淀分离中，浓缩作用常大于纯化作用，因而沉 淀分离通常作为初步分离的一种方法。
路线一A
第五章 沉淀分离
5.1 概述 5.2 盐析法 5.3 有机溶剂沉淀法 5.4 非离子多聚物沉淀法 5.5 其他沉淀法
5.1 概述
• 沉淀的概念 沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相 的过程。在生物工业、有机化工工业、 无机化工工业及实验室分析中，沉淀都 是分离与纯化中最常用的方法之一。 沉淀： 溶质→固相
S0表示在纯溶剂中（即I=0）蛋白质的溶解度，由此可见β是一个 与盐的种类无关的常数。β值的大小主要决定于蛋白质的性质。
（2）β值不可能直接测定
β 值是假定离子强度 I=0 时，用外推法求出的。事实上由于盐溶 作用的存在，I=0时的溶解度比低盐溶液要低。
（3）β值随温度和pH而变
•
关于KS——主要取决于蛋白质和盐的种类， 而与温度和pH无关。 （1）KS与蛋白质种类的关系
水区域间的相互作用，使蛋白质分子相互聚集而沉淀。
↓
lgS （溶解度） β
盐溶
盐析
I （离子强Байду номын сангаас）
图5-1 溶液离子强度与蛋白质浓度的关系
5.2.1.2 Cohn方程式
• 蛋白质盐析时，蛋白质的溶解度与盐浓度的关系可由 Cohn经验公式来表示：
lg S K s I
其中：
1 2 I mi Z i 2
5.1 概述
• 沉淀剂的选择 沉淀剂的作用是降低溶质的溶解度使之析 出，除考虑沉淀效果外还需考虑下列因素： （1）沉淀剂对目的产物的结构与活性是否有破 坏作用； （2）沉淀剂是否容易除去（离子交换、蒸发、 萃取等）； （3）沉淀剂是否有毒性。
5.1 概述
• 沉淀的分类：沉淀法有许多种，根据所用沉淀 剂的不同，生物工业中常用的沉淀方法有如下 几种： ①盐析法：多用于蛋白质和酶的分离纯化。 ②有机溶剂法：多用于生物小分子、多糖及核 酸类产品的分离与纯化，有时也用于蛋白质和 酶的沉淀。 ③等电点沉淀法：用于氨基酸、蛋白质等两性 物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其它 方法结合使用。
5.2.1.1盐析原理
• 蛋白分子的表面同时含有带电荷的亲水基团和 不带电荷的疏水基团。 • 蛋白质的溶解度差别——取决于蛋白质分子中 极性基团与非极性基团的比例和这些基团的排 列位置。
5.2.1.1盐析原理
（1）水合作用： • 在水溶液中，蛋白质分子中的亲水基团吸聚着 许多水分子，这种作用称为水合作用。这些水 分子在蛋白质分子的表面形成一层水化膜。 • 由于水膜的存在，各蛋白质分子间彼此隔开， 使蛋白质分子在水中呈溶解状态。
5.1 概述
• 沉淀的作用有二： 一是浓缩，通过沉淀目的产物由液相 变成固相，浓缩倍数可达几十倍至数百 倍； 二是纯化，通过沉淀固液分相后，除 去留在液相（如果目的产物是固相）或 沉积在固相中（目的产物留在液相）的 杂质。
沉淀法操作步骤 ： ①首先加入沉淀剂； ②沉淀剂的陈化，促进粒子生长； ③离心或过滤，收集沉淀物。 加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯 度、收率和沉淀物的形状都有很大影响。
5.1 概述
④非离子型聚合物沉淀法：用于生物大分子， 是发展很快的一种方法。 ⑤生成盐类复合物沉淀法：用于多种化合物 （其中主要是酸性或碱性化合物），其中小分 子物质的沉淀应用较多。 ⑥选择变性沉淀法：热变性或酸碱变性沉淀 法，常用于除去某些不耐热及在一定pH值下易 变性的杂蛋白。但应以在实验条件下所分离物 质的活性不受影响为前提。
生物分离过程的一般流程
原料液 原料液 细胞分离 ( 细胞分离 ( 离心，过滤 离心，过滤 )) 细胞－胞内产物 细胞－胞内产物 路线一B 包含体 溶解(加盐酸胍、脲 加盐酸胍、脲 ) 复性 细胞破碎 碎片分离 碎片分离 粗分离( 盐析、萃取、超过滤等 盐析、萃取、超过滤等 ) 纯化( 层析、电泳 层析、电泳 ) 脱盐( 凝胶过滤、超过滤 凝胶过滤、超过滤 ) 浓缩( 超过滤 超过滤) 精制( 结晶、干燥 结晶、干燥 ) 路线一 路线二 清液－胞外产物