高速逆流色谱法原理与应用ppt课件
高速逆流色谱法
HSCCC进样体积可达到柱体积的20%，广泛用于制备 性分离。
参数
固定相 机理
溶质与固定相作用
上样量 分离效率
操作 费用 危险性
HSCCC
色谱分离是依据被分离物在两相中分配系数的不同而 进行；
逆流色谱是利用物质在两相液体中分配系数的不同实 现分离；
分离也可以依据被分离物在一个含有沉淀剂的浓度梯 度变化的单一溶剂中的溶解度的不同而实现。
（前提：沉淀剂浓度梯度移动的速度远低于溶剂流速）
溶解度具有很小差异的物质，经过在柱中反复的沉淀 和溶解即可达到分离。
二、基本原理
现代逆流色谱仪器体系： 1. 流体静力学平衡体系
2. 流体动力学平衡体系（HSCCC体系） 仪器的两个特征：
a 有一个或多个缠绕有多层聚四氟乙烯管的线轴； b 没有旋转密封接头，有一个安装有两个旋转轴的齿轮传动装置，
能产生一个可变的离心力场。
通过公转、自转（同步 行星式运动）产生的二 维力场，保留两相中的 其中一相作为固定相；
广义定义： 1. 任何利用两相不混溶液体的色谱技术； 2. 其中一相以一种相对均匀的方式纵向分布在一根空管
或一系列的腔体中； —— 固定相 3. 同时另一相以一定的速度通过第一相并与之混合。
—— 流动相
减少了溶质分子与固体支撑体之间各种复杂的相互作 用；
不仅可以获得高纯度的分离组分；
同时具有较高的回收率和重现性。
离心沉淀色谱（centrifugal precipitation chromatography, CPC）是一种建立在类似于逆流色谱 的不用固体支撑体的开放性通道基础上的沉淀和溶 解色谱。
高速逆流色谱PPT课件
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2 溶剂体系选择的步骤
（1）预测要分离物质的极性，粗选一个溶剂体系；
（2）取少量样品于上下相各2毫升的溶剂体系中，用
TLC进行检验，可加入甲醇、乙醇、醋酸乙酯等来调 节
溶剂体系的极性，直到样品在上下相中的分配比K为
0.5~2为止；
（3）用HPLC测定K值；
（4）用分析型HSCCC进行预分离，再用制备型高速
氯仿-甲醇-水 木脂素和香豆素 正己烷-乙睛-醋酸乙酯-水
正己烷-甲醇-水
氯仿-甲. 醇-水
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四、应用
溶剂系统
两相溶剂系统：正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水（6：3： 2：5），在分液漏斗中充分混合，临用前将其分开。
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分离条件： 室温下，上相为固定相，下相为流动相，流速为 0.7ml/min； 洗脱方式：由首端向尾端洗脱； 主机：正转，流速为800r/min
高速逆流色谱
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一、概述 高速逆流色谱（High-Speed Countercurrent Chromatography,HSCCC）是一种连续高效的 液液分配色谱分离技术。该技术不需要固体支撑 体，主要依据物质在两相中分配系数的不同对物 质进行分离，相对其他常用色谱（如柱色谱、高 效液相色谱等）来说，具有无不可逆吸附和回收 率高的特点，特别适合于天然活性成分的分离。
柱温等
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检测器
紫外-可见光检测器
蒸发光散射检测器
质谱检测器等
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/v/b/18605037-1585286663.html /v/b/18615566-1585286663.html
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与其它色谱分离技术相比，高速逆流色谱具有
逆流色谱ppt课件
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手性分离和分析的重要性
★ 获取单一对映体化合物 ★ 对于涉及分子手性分析的领域要采用高对映 体选择性的分析方法
手性分离的特殊性
在非手性环境中，对映体的物理化学性质（如熔点、 沸点、折射率、蒸气压、溶解度、红外、核磁谱和质 谱等）大都相同，这就造成对映体分离的困难。
手性添加剂法拆分苯基琥珀酸
O
OH OH O
(±)-PSA可采用光 活性的番木鳖碱或
(-)-脯氨酸拆分
15 mmol/Lβ-CD + 3% CH3CN + 0.05 %CF3COOH
0.30 mmol/L TM-β-CD +16%CH3CN +0.05%CF3COOH
Nova-pak C18色谱柱
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CH3
+3.82o , mp 25.8oC -3.82 o , mp 25.8oC
右旋乳酸 , d-或(+)-
左旋乳酸 , l-或(-)-
图1 乳酸分子的镜像关系
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沙利度胺（Thalidomide）
--------天使还是魔鬼？
俗名“反应停”，早期作为 怀孕妇女的止呕药使用
50年代末，在欧洲出现数千例短肢 畸胎新生儿，一度震惊全世界
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逆流色谱技术的特点
1．逆流色谱不用固态支撑体; 2．两相处于离心力场中，成液滴装、样品在
其表面分配； 3．无死体积，柱子体积大，制备量大； 4．分离过程不是淋洗或洗脱过程，而是对流
穿透过程。
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基本操作
• 溶剂系统的选择： • 样品溶解：等量的预先平衡的上下相； • 溶剂分离：如线圈为300ml,则实验一次要
高速逆流色谱在天然产物分离提取中的应用-PPT
作者 王凤美
原料 丹参水溶性成分 丹酚酸类物质
溶剂体系 正己烷-醋酸乙酯-水-甲苯 (1.5:5:5:1.5)
分离物质 丹酚酸 B
Tian G L 山茱萸
乙酸乙酯-正丁醇-水(5:1.8:6) 乙酸乙酯-乙醇-水(5:0.5:6)
没食子酸
黄健光
正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水(7:3:6:4) 邻苯二酚和对苯二酚
溶剂系统
正己烷-乙酸乙酯-乙腈-水（2：2:1:0.6:2） 乙酸乙酯-乙醇-水（15:1:15） 乙酸乙酯-水（1:1） 正丁醇-乙酸乙酯-水（2:8:5） 乙酸乙酯-水（1:1） 乙酸乙酯-乙醇-水（4:1:5） 石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（1:1:1.2:0.8） 和石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（1:1:1.4:0.6） 梯度洗脱
原料 吴茱萸 黄花乌头 附子 金果榄
绿茶
溶剂体系 正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水 (5∶5∶7∶5) 正己烷-乙酸乙酯-甲醇-0.2mol/L HCl (1∶3.5∶2∶4.5) 氯仿-甲醇-0.3mol/L 盐酸 (4:3:2) 氯仿-甲醇-0.2mol/L 盐酸 (2:1:1) 氯仿-甲醇-0.2mol/L 盐酸
Liu R M 秦皮
正丁醇-甲醇-0.5%乙酸(5:1.5:5)
秦皮素、七叶甙、秦 皮甙和七叶素
3、7 其她类化合物得分离提取
作者 佘佳红
原料 银杏叶
溶剂体系 氯仿-甲醇-水(4:3:2)
分离物质 白果内酯
Du Q Z
穿心莲
正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(1:4:2.5:2.5)
穿心莲内酯和新穿心 莲内酯
大家应该也有点累了，稍作休息
大家有疑问的，可以询问和交流
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a、仪器对保留值得影响(外因)
高速逆流色谱
400
流速: 2.0 ml 转速：800 rpm 样品量：150 mg 粗提物 机型：TBE-300A 固定相保留： 60% Ⅰ：花椒毒素 95.0％ 7.6 mg Ⅱ: 异茴芹素 99.6％ 7.6 mg Ⅲ: 佛手苷内酯 99.7％ 9.7 mg Ⅳ: 欧前胡素 100％ 60.5 mg Ⅴ: 蛇床子素 100％ 50.6 mg Ⅵ:未知化合物 98.1％ 10.2 mg min-1
实例3 白花败酱异戊烯基黄酮的分离
溶剂系统: 正己烷-乙酸乙酯－甲醇-水 (5:6:6:6) 流动相：下相 流速: 1.0-2.0 ml min-1 转速：850 rpm 样品量：400 mg 粗提物 固定相保留： 65% 分离温度: 25°C 机型：TBE-300A Ⅰ: orotinin （牡荆苷）99.2％ 38.2 mg Ⅱ: orotinin-5-methyl ether 98.5％ 19.8 mg Ⅲ: licoagroachalcone B 97.6％ 21.5 mg Journal of Chromatography A,1102(2006)44-50
两相溶剂体积选择
• 色谱理论,样品分离的必要条件是合适的分配系数。溶剂 体系的选择对于HSCCC十分关键,通常来说,两相溶剂体系 应满足以下要求: • (1)为保证固定相保留值合适(不低于50% ) ,溶剂体系的分 层时间要小于30 s。 • (2)目标样品的分配系数K接近于1,容量因子应大于1. 5。 • (3)上下两相的体积大致相等,以免浪费溶剂。 • (4)尽量采用挥发性溶剂,以方便后续处理,易于物质纯化。 • Ito博士根据在螺旋管中行星运动的溶剂流体力学特性将溶 剂分为疏水性、中等疏水性和亲水性体系 。
Absorbance(mAU)
高速逆流色谱法ppt课件
溶剂应该进行分层实验，实验结果决定流速和洗 脱方式
样品要溶解于流动相或固定相之中
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五、高速逆流色谱的应用
天然药物的分离和分析 氨基酸、激素、嘌呤、抗生素等分离分析 蛋白质、细胞至微生物的分离等
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黄连生物碱的分离
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2.《高速逆流色谱分离技术与应用》曹学丽，化学工业 出版社，2009年
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二、分离原理
连续液液萃取过程，固定相和流动相均为液体 问题是：如何在流动相流动时使固定相不动？
两种基本模式 ➢ 流体静力学平衡系统
• 洗脱速度太慢，一般需要两天或更长时间。
➢ 流体动力学平衡系统
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完整版PPT课件5 Nhomakorabea 三、仪器结构
高速逆流色完整版谱PPT的课件仪器流程
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柱：长的软管(如聚四氟乙烯管)绕制成
载体：无
固定相：液体。用某一种有机／水两相溶剂体系或双水 和溶剂体系的上层或下层作为色谱过程的固定相，用离 心力场来支撑住柱内的液态相。
流动相：若用溶剂体系中的另一层作为流动相，带着混 合样品由泵的压力推入分离管柱，样品就会穿过两个液 相对流的整个管柱空间。
第9章 高速逆流色谱法
High Speed Countercurrent Chromatography HSCCC
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一、概述
Ito，70年代提出，80年代提出CCC，一种液液 色谱分离技术
逆流分配→液滴逆流色谱→高速逆流色谱
高速逆流色谱仪原理特点及应用
高速逆流色谱仪原理特点及应用气路管路、进样器、注射器的清洗清洗气路连接管时，应首先将该管的两端接头拆下，再将该段管线从色谱仪中取出，这时应先把管外壁灰尘擦洗干净，以免清洗完管内壁时再产生污染。
清洗管路内壁时应先用无水乙醇气路管路、进样器、注射器的清洗清洗气路连接管时，应首先将该管的两端接头拆下，再将该段管线从色谱仪中取出，这时应先把管外壁灰尘擦洗干净，以免清洗完管内壁时再产生污染。
清洗管路内壁时应先用无水乙醇进行疏通处置，这可除去管路内大部分颗粒状堵塞物及易被乙醇溶解的有机物和水分。
在此疏通步骤中，如发觉管路不通，可用洗耳球加压吹洗，加压后仍无效可考虑用细钢丝捅针疏通管路。
如此法还不能使管线畅通，可使用酒精灯加热管路使堵塞物在高温下炭化而实现疏通的目的。
用无水乙醇清洗完气路管路后，应考虑管路内壁是否有不易被乙醇溶解的污染物。
如没有，可加热该管线并用干燥气体对其吹扫，将管线装回原气路待用。
假如由分析样品过程判定气路内壁可能还有其它不易被乙醇溶解的污染物，可针对实在物质溶解特性选择其它清洗液。
选择清洗液的顺序应先使用高沸点溶剂、而后再使用低沸点溶剂浸泡和清洗。
可供选择的清洗液有萘烷、N、N—二甲基酰胺、甲醇、蒸馏水、丙酮、乙醚、氟里昂、石油醚、乙醇等。
对进样器（包含汽化室）的清洗应以疏通为先导。
通常在进样器中的堵塞物是进样隔垫的碎片，样品中被炭化了的高沸点物，对这些固态杂质可用不锈钢捅针疏通，然后再用乙醇或丙酮冲洗。
为了使清洗更彻底，可选用2：1：4的H2SO4/HNO3/H2O混合溶液先对进样器清洗，然后再用蒸馏水，最后再用丙酮或乙醇清洗。
清洗完后烘干，装上仪器通载气半小时，加热到120℃待几小时后即可正常工作。
在拆装进样器时需注意不要碰断加热器引线或使引线碰到外壳；测温元件也应在装回进样器之后，按原先测温点装回。
通常测温元件和进样器加热体是紧密接触的，如距离过大将会造成过高的汽化温度。
注射器使用前可先用丙酮清洗，以免玷污样品，但可以还是用待注射样品对注射器自身做一二次清洗。
高速逆流色谱
高速逆流色谱（high-speed countercurrent chromatography ，HSCCC ）是20 世纪80 年代发展起来的一种连续高效的液—液分配色谱分离技术，它不用任何固态的支撑物或载体。
它利用两相溶剂体系在高速旋转的螺旋管内建立起一种特殊的单向性流体动力学平衡，当其中一相作为固定相，另一相作为流动相，在连续洗脱的过程中能保留大量固定相。
由于不需要固体支撑体，物质的分离依据其在两相中分配系数的不同而实现，因而避免了因不可逆吸附而引起的样品损失、失活、变性等，不仅使样品能够全部回收，回收的样品更能反映其本来的特性，特别适合于天然生物活性成分的分离。
而且由于被分离物质与液态固定相之间能够充分接触，使得样品的制备量大大提高，是一种理想的制备分离手段。
它相对于传统的固—液柱色谱技术，具有适用范围广、操作灵活、高效、快速、制备量大、费用低等优点。
目前HSCCC 技术正在发展成为一种备受关注的新型分离纯化技术，已经广泛应用于生物医药、天然产物、食品和化妆品等领域，特别在天然产物行业中已被认为是一种有效的新型分离技术；适合于中小分子类物质的分离纯化。
我国是继美国、日本之后最早开展逆流色谱应用的国家，俄罗斯、法国、英国、瑞士等国也都开展了此项研究。
美国FDA 及世界卫生组织（WHO ）都引用此项技术作为抗生素成分的分离检定，90 年代以来，高速逆流色谱被广泛地应用于天然药物成分的分离制备和分析检定中。
逆流色谱原理：1.逆流色谱是20世纪50年代源于多极萃取技术（非连续性）但是多极萃取设备庞大复杂、易碎、溶剂体系容易乳化，溶剂耗量大，分离时间长。
2.20世纪70年代，出现了液滴逆流色谱（DCCC）特点：（1）流体静力学原理（Hydrostatic equilibrium system，HSES）（2）分离时间过长、连接处容易出现渗漏等3.20世纪70年代出现了离心分配色谱仪（Centrifugal partition chromatography，CPC）特点：（1）基于流体静力学原理（Hydrostatic equilibrium system，HSES），利用公转产生的单一力场（2）连接处较多而且容易出现渗漏，清洗维护复杂4．20世纪80年开始出现了现在的高速逆流色谱，可称为最先进的逆流色谱特点：（1）基于流体动力学原理（Hydrodynamic equilibrium system，HDES）（2）通过公转、自转（同步行星式运动）产生的二维力场，保留两相中的其中一相作为固定相（3）通过高速旋转提高两相溶剂的萃取频率，1000rpm旋转时可达到17次/s频率的萃取过程。
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由于不需要固体支撑体，物质的分离依据其在两相
中分配系数不同而实现，避免了因不可逆吸附而引
起的样品失活、损失、变性等，不仅能使样品全部
回收，更能反映其本来的特性，特别适合于天然生 物活性成分的分离。
具有适用范围广、操作灵活、高效、快速、制备量
大、费用低等优点。
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溶质与固定相作用
上样量 分离效率
操作 费用 危险性
HSCCC
HPLC
液体
固体
液-液分配（简单） 分配、吸附、离子交换、 体积排阻等（复杂）
与液体固定相的整个体 在固定相与固体支撑体
积相接触
的界面相互作用高中等来自低高容易
复杂
便宜
昂贵
高速运转产生机械故障
安全
HSCCC与HPLC是互补的分离技术
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结构组成
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二、基本原理
现代逆流色谱仪器体系： 1. 流体静力学平衡体系
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2. 流体动力学平衡体系（HSCCC体系） 仪器的两个特征：
a 有一个或多个缠绕有多层聚四氟乙烯管的线轴； b 没有旋转密封接头，有一个安装有两个旋转轴的齿轮传动装置，
能产生一个可变的离心力场。
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通过公转、自转（同步 行星式运动）产生的二 维力场，保留两相中的 其中一相作为固定相；
分离时，在螺旋管内首先注入其中的一相(固定相)， 然后从合适的一端泵入移动相，让它载着样品在螺旋 管中无限次的分配。仪器转速越快，固定相保留越多， 分离效果越好，且大大地提高了分离速度，故称高速 逆流色谱。
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高速逆流色谱与高效液相色谱比较
HPLC和HSCCC的固定相体积不同 理论塔板数的工 作范围不同；
到目前为止，逆流色谱的最高分离效率低于5000理 论塔板数。
HSCCC中溶质可以进入并接触到液态固定相的整个体 积；HPLC中，溶质不能进入到固体支撑体内部，仅 涂渍在表面的有机层的液-固界面 HPLC有过载现象；
HSCCC进样体积可达到柱体积的20%，广泛用于制备 性分离。
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参数
固定相 机理
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应用领域与拓展
双水相逆流色谱在蛋白质分离纯化中的应用 离心沉淀色谱在蛋白质等分离中的应用 逆流色谱在手性分离中的应用 逆流色谱在天然药物工业中的应用
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总结
HSCCC利用两相溶剂体系在高速旋转的螺旋管内建立 起一种特殊的单向性流体动力学平衡，其中一相作 为固定相，另一相作为流动相，在连续洗脱过程中 能保留大量固定相。
离心力场的强度和方向 都可以变化；
倾析和混合交替出现， 两相液体在螺旋管柱中 总是处在接触状态，没 有死体积存在；
流体动力学CCC中压力小，
固定相保留值大。
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高速逆流色谱正是利用了两相的这种单向性分布特征， 在高的螺旋管转动速下，如果从尾端送入首端相， 它将穿过尾端相而移向首端，同样，如果从首端相送 入尾相，它将穿过首端相而移向螺旋管的尾端。
高速逆流色谱法
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高速逆流色谱概述 基本原理 技术特点 仪器结构
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高速逆流色谱（HSCCC）
High-speed countercurrent chromatography 建立在一种特殊的流体动力学平衡基础上，利用螺旋
管的高速行星式运动产生的不对称离心力场，实现两 相溶剂体系的充分保留和有效混合及分配，从而实现 物质在两相溶剂中高效分离。