菊花组织培养

愈伤组织的过程。
再分化 ：脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，
又可以重新分化成根或芽等器官的过程。
愈伤组织 ：细胞排列疏松、无规则、高度液
泡化的无定形的薄壁细胞。
（二）植物组织培养的基本过程
切取 形成层
移栽
无菌 接种 培养室
脱分化
诱导愈伤组织 的形成
再化
试管苗的形成
（三）植物组织培养的理论基础---细胞全能性
4．温度、光照、pH的影响
温度： 大多数植物组织培养控制在23～27℃， 低于15℃时植物组织会表现生长停止； 高于35℃时对植物生长不利。 菊花的组织培养控制在18～22℃。 光照：菊花每日用日光灯照射12h。 pH： 不同植物对培养基最适pH的要求不 同，大多数控制在5～6.5。 菊花的组织培养控制在5.8左右。
乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁 酸（IBA）等。
作用：2，4－D有利于愈伤组织的生长； IAA、NAA、IBA有利于器官分化。
细胞分裂素类： 激动素（KT）、6－苄基嘌呤（ 6－
BA）、玉米素（ZT）等。 作用：促进细胞的分裂与分化，其中KT能 明显促进芽的分化而抑制根的形成。
赤霉素类： 赤霉酸（GA3）等
1、植物组织培养所利用的植物材料体积小、 抗性差，对培养条件的要求较高：
2、用于植物组织培养的培养基同样适合于某些 微生物的生长,微生物产生的代谢废物会毒害培养 的对象；培养物一旦受到微生物的污染，就会导 致实验前功尽弃；
因此要进行严格的无菌操作。
（二）外植体消毒
1、选材： 菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝 2、消毒 ①流水冲洗 菊花茎段用流水冲洗后可少许洗衣粉，用软刷轻 轻刷洗，刷洗后在 流水 下冲洗20min左右 体积分数 ② 酒精处理 为70％的 用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入 酒精 中摇 动2－3次，持续6－7s，立即将外植体取出，在无菌水 中清洗
细胞分化是 否意味着细胞 中遗传物质的 改变？
遗传物质没有改变， 不同组织的细胞共同 来源于受精卵，经有 丝分裂产生。
3、细胞分化的实质
基因 在个体发育过程中，不同细胞中 遗传信息的执行情况不同即基因 的选择性表达的过程
A B C D E
A B C D E
AC B DE
A B C D E
A B C D E
③消毒液处理
取出后用 无菌吸水纸 吸干外植体表面的水分，放入 中1 －2min，取出后在 无菌水中至少清洗3次， 质量分数为 0.1％的氯化汞溶液 漂净消毒液
（三）接种
1、接种前用体积分数70%酒精擦拭工作台，点燃酒 精灯，所有操作在酒精灯旁边进行，每次使用器 械后都要灼烧灭菌 2、将装有培养基的锥形瓶整齐的排列在酒精灯左侧 ，将消过毒的菊花茎段在无菌培养皿中切成小段 （0.5-1cm） 3、左手持锥形瓶，右手拉开捆扎锥形瓶的绳子，并 将封口膜攥于右手手心，以避免封口膜接触瓶口 的一面被污染。左手持瓶，使瓶口旋转通过火焰 。 4、右手用镊子夹取菊花茎段，插入培养基中，不要 倒插，每瓶6-8块外植体，接种后，将封口膜重新 扎好。
结果分析与评价
2、配制培养基 ①（配制培养液 ） ②（ 调PH ） ③（培养基的分装 ） 分装到锥形瓶中，每瓶分装50ml或100ml 由于菊花的茎段的组织培养比较容易， 因此不必添加植物激素 3、灭菌
分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽灭菌
在植物组织培养的过程中， 为什么要进行一系列的消毒、灭菌， 并且要求无菌操作？
人工种子
三、影响植物组织培养的因素
1、材料的种类、年龄及保存时间长短等 2、营养 3、植物激素 4、PH、温度、光照等条件
1、植物材料的选择
---直接关系实验的成败
①不同植物的组织培养难度不同 eg：烟草和胡萝卜的组织培养较为容易 枸杞愈伤组织的芽诱导比较难 菊花的组织培养一般选择未开花植株的茎 上部新萌生的侧枝
四、实验操作
制备MS固 体培养基
配制各种母液 配制培养基 灭菌
外植体消毒
接种
冲洗—酒精—无菌水冲洗— 氯化汞—无菌水冲洗至少三 次之上
培
养
栽
培
移
栽
（一）制备MS固体培养基
MS培养基包括20多种营养成分，实验室一般使用4℃ 保存配制好的培养基母液来制备
1、配制各种母液
①无机物中大量元素浓缩10倍，微量元素浓缩100 倍，常温保存 ②激素类、维生素类以及用量较小的有机物一般可 按1mg/ml的质量浓度单独配制成母液 ③用母液配制培养基时，需要根据各种母液的浓缩 倍数，计算用量
高度分化的动物体细胞的细胞 核有发育成完整个体的潜能
植物组织培养技术
动物的克隆技术
已经分化的细胞（核），仍然具有 发育成完整个体的潜能。 细胞全能性
思考
为什么已经分化的细胞具有全能性呢？
高度分化的细胞含有保持物种发育 所需要的全套基因
（四)植物组织培养的应用：
1、培育无病毒植株 2、大规模培养愈伤组织（提取紫草素，治疗 烫伤和割伤的药物以及染料和化妆品的原料） 3、人工种子（解决有些作物品种繁殖能力差， 结子困难或发芽率低等问题） 4、基因工程中亦需用到植物组织培养的方法 （受体细胞为植物细胞）
正常苗
污染苗
污染途径
1、外植体带菌
2、培养基及接种 器具灭菌不彻底
3、接种操作时带入
4、环境不清洁
（五）移栽
1、打开封口膜
移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养瓶的 封口膜，让试管苗在培养间生长几日。一般放置在 20～25℃的遮荫环境中，适应5～7d。试管苗不萎蔫， 有新生长的趋势，便可移栽。
答：微量元素和大量元素提供植物细胞生活所必需 的无机盐；蔗糖提供碳源，同时能够维持细胞的渗 透压；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体 植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的 特殊营养需求。
微生物培养基以有机营养为主。与微生物的培养 不同，MS培养基则需提供大量无机营养，无机盐混 合物包括植物生长必须的大量元素和微量元素两大 类。
在无菌和人工控制条件下，将 离体的植物（ 器官、组织、细胞 ） 培养在人工配置的培养基上，给 予适宜的培养条件，诱导其脱分 化产生愈伤组织再分化形成丛芽 ，最终形成 完整的植株 。
又称：植物离体培养
关键词：
外植体、脱分化、再分化、愈伤组织
外植体 ：用于离体培养的植物器官或组织片段。 脱分化（或去分化）： 由高度分化的植物组织或细胞产生
在个体发育中，由一个或一种 细胞增殖产生的后代，在形态、 结构和生理功能上发生稳定性差 异的过程。
2、细胞分化的特点
4、普遍性
细胞分化发生在整个生命进程中。1、持久性 黑色素细胞在体外培养30多代后仍能合 成黑色素；离体培养的上皮细胞，始终保持 为上皮细胞，而不会变成其他类型的细胞。 2、稳定性 造血干细胞 原红细胞 早幼红细 胞 中幼红细胞 晚幼红细胞 成 熟红细胞 死亡 3、不可逆性
蔗糖既是碳源也是调节渗透压的物质；维生素能 促进细胞分裂和诱导器官分化；甘氨酸是蛋白质 的组成成分，也是有机氮源。
D、植物激素：(生长素、细胞分裂素、 )赤霉素等
MS固体培养基成分及比例
萧县郝集中学
讨论：你能说出各种营养物质的作用吗？同 专题2中微生物培养基的配方相比，MS培养基 的配方有哪些明显的不同？
作用：促进不定芽和幼株伸长。
激素的使用顺序、使用量及比例影响植物细胞
的发育方向：
使用顺序 先使用细胞分裂素后使用生长素 同时使用 使用比例 实验结果 细胞既分裂、也分化 分化频率高 实验结果 先使用生长素，后使用细胞分裂素 有利于细胞分裂，但不利分化
生长素
生长素 生长素
> <
细胞分裂素
细胞分裂素
3、植物激素的影响
常用植物激素：生长素、细胞分裂素和赤霉 素 生长素、细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分 化和再分化的关键性激素 在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用 呈加强的趋势 激素的使用顺序、使用的量及比例影响植物 细胞的发育方向
生长素类： 2，4－二氯苯氧乙酸（2，4－D）、吲哚
课题一 菊花的组织培养
学习目标：
掌握植物细胞的全能性，明确植物细胞体 现全能性的条件。 了解植物组织培养技术在生产中的应用。 熟悉植物组织培养的基本过程。 了解影响植物组织培养的各种因素。 掌握植物组织培养的基本技术。
一、知识回顾
1、细胞分化的概念
有丝分裂
受精卵
细 胞 分 化
红细胞
血红蛋白基因开启
合成血红蛋白 ( 肌动蛋白基因关闭 不合成肌动蛋白) 血红蛋白基因关闭 合成肌动蛋白 ( 肌动蛋白基因开启 不合成血红蛋白)
肌细胞
4、细胞分化的结果
细胞产生了不同种类的蛋白质 即出现了不同的结构和功能
二、基础知识
胚状体
离 体
愈伤组织
1958，美国，斯图 尔德
植物组织培养
（一）植物组织培养概念
2、清洗转移
用流水清洗根部的培养基，将幼苗移植到消过毒 的蛭石或珍珠岩等环境下生活一段时间
3、移栽
幼苗长壮后，移栽到土壤中
珍珠岩 ,珍珠岩是一种火山喷发 的酸性熔岩，经急剧冷却而成 的玻璃质岩石，有弧形或圆形 裂隙，如珍珠的结构，所以被 命名为珍珠岩 。
蛭石是一种天然、无毒的矿物质， 在高温作用下会膨胀的矿物。它 是一种比较少见的矿物，属于硅 酸盐。
5、接种注意事项
①每接种一块外植体前，镊子需放入体积分数为70 ％的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精灯火焰上烧 一遍，冷却后再接种 ②外植体在培养基中要分布均匀，放置外植体数量根 据锥形瓶的大小确定，一般胡萝卜3－4块，菊的茎 或叶6－8块，也不要太少，以充分利用培养基中的 营养成分和光照条件 ③插入时应注意方向： （ 形态学上端朝上，形态学下端朝下 ）不要倒插。茎 段、茎尖基部插入培养基利于吸收水分和养分