第二章.动物组织和细胞的培养(4)

Tissue culture flasks
• T-flasks • Petri dishes
(三Байду номын сангаас微载体培养 （microcarrier culture)
• 1967年，Van Wezel开发了 微载体系统培养贴壁细胞。 微载体是直径为60-250μm 的微珠。 • 最初使用的材料为二乙基氨 基乙基－交联葡聚糖A－50
（6）分离细胞
• 脱离微载体的细胞培养液放人容 器， • 离心沉淀微载体（400r／min，2 分钟）收集细胞。 • 还可用过滤方法，采用直径 100μm孔径的尼龙网、不锈钢网 等可将细胞与微载体分离开。
（7）传代培养
• 微载体上分离下来的细胞可进一步做微 载体传代培养。 • 可在细胞脱离微载体后，转接细胞，加 人一些新的微载体以增大培养体积。 • 另一种放大培养方法：也可在微载体长 满细胞后直接加人微载体,更换培养基。
第二节 动物细胞培养
一 动物细胞培养类型
(一)细胞原代培养
1.取材分离
• 取出组织块放入小烧杯中，用尖嘴剪刀将组织 块剪碎成1mm3大小，加入Hanks液（平衡盐水 BSS） ，冲洗数次。
•
取材分离
2.组织消化：
• 是用酶法将剪碎的组织块分散成 细胞团或单细胞。
• 将剪碎的组织块放人三角烧瓶中，
• 通常是在培养液中加人一定量的 磷酸缓冲液（PBS），保持培养液 的pH值相对稳定。 • 或用羟乙基呱嗪乙烷磺酸（HEPES） 氢离子缓冲液。
3、溶氧水平
• 细胞生长离不开氧气的供应，培 养初期细胞数量少，可以控制较 低水平的溶氧量。 • 随着细胞数量的增多，营养物质 的消耗，加大溶氧量。
• 对大多数动物细胞来说，培养过 程中对氧的消耗速率范围是：
3.细胞计数
• 细胞悬液制成后，需要计数
悬液中细胞的浓度，通常以
细胞个数／ml表示。检查方
法如下：
• 1 ）在干净的离心管中加人数滴 细胞悬液，再加人6.4％台盼蓝 （ trypan blue）1 滴，混匀后静 置2～3分钟； • 2 ）将计数板（如图）平放在显 微镜台上，在盖片边缘加人l～2 滴染色的细胞悬液，使之完全充 满计数板与盖片间的空间，勿留 气泡，勿使盖片漂浮；
• 渗透压：高渗透压不仅影响细胞分 批培养中抗体产量，还影响细胞生 长速度、对数生长期的长短、细胞 死亡的速度。 • 在培养基中加入诸如甘氨酸、甜菜 碱、或脯氨酸等渗透压保护剂在一 定程度上能减轻高渗透压对细胞的 生长抑制作用。
• 当原代培养成功后，细胞分裂增 殖扩展连片，占满器皿表面。 • 这时需要对其分离重新培养，这 一操作过程称之为传代。 • 有 80 ％～ 90% 或刚刚全部汇合的 细胞，是传代的理想时期。
具体方法如下：
1)吸出培养瓶内旧培养液； 2）加人胰蛋白酶和EDTA混合液盖满瓶 底对细胞进行消化； 3 ）吸出消化液，加人 Hanks 液，洗去 残留的消化液。 4）加入培养液，用吸管轻轻吹打瓶壁， 使细胞脱落制成悬液，计数后记录 其浓度； 5）重新接种培养
培养中的搅拌转速：
• 提供均相培养环境 • 防止微载体集聚 • 促进汽液交换 • 30-120r/min
（4）培养观察
• 显微镜直接观察微载体上细胞生长 • 将微载体上的细胞消化下来计数并 计算其浓度: • 取1ml均匀的培养细胞样品，待微载 体沉淀后吸去上清液，加PBS液清洗。
• 加胰蛋白酶37℃消化15min，吸 出消化液后加到培养液中，过滤 分离微载体，离心弃上清夜，保 留细胞沉淀； • 加美蓝染液2ml，血球计数器计 数，计算细胞浓度。
加人30～50倍体积的0.25％浓度 胰蛋白酶；
• 消化： 37 ℃水浴内消化 30 ～ 60 分 钟。 • 过滤：如果大部分细胞已经分散， 终止消化，以不锈钢筛过滤 (100μm）滤除未被消化的组织块。 • 离心：8000rpm/min离心5分钟， 弃上清液,沉淀为细胞。 • 漂洗；Hanks液漂洗两次，每次 2～3分钟，加人营养液 。
• 3）显微镜下记录计数板四角 四个大格中的细胞总数，原 则是 : 染蓝的细胞不数（死 细胞），无色的细胞计数 （活细胞），一团细胞按一 个细胞计数。
• 计数时要注意： • 如果细胞团数超过10％，说明 消化过程进行的不充分； • 如果细胞数少于20-50个说明 稀释的不当.
(二)传代培养
• 例1:应用微囊化方法培养杂交瘤细胞
时，微囊膜孔径大小控制截留 8 × 10 4 D 以内的分子量，免疫球蛋白 IgG（杂交瘤细胞产生的单抗）的分 子量为1.5×105D。 • 当细胞生长稳定，达到 6 × 107 cells ／ml 培 养 液 时 ， 抗 体 的 产 量 可 高 达 1.5mg／ml。
• 制备动物细胞微囊所用的材料，主 要是海藻酸（ALG）和多聚赖氨酸 （PLL）. • 海藻酸和多聚赖氨酸分子量的大小 及其溶液的浓度；细胞与海藻酸钠 混合的时间；溶液的pH，温度等都 会影响微囊膜直径的大小.
微囊制作
1 ）分离好的细胞悬浮在 1.0 ％～ 1.2 ％的海藻酸钠液 中，细胞终浓度达到 1×107cells／ml； 2）细胞悬浮液经微囊发生 器制成微滴，将微滴加人 1.3%CaCl2溶液后成凝胶球， 10 分钟后，去除上清收集 胶球; 3 ）加人 0.05 ％的聚赖氨酸， 微球胶体颗粒表面包裹一 层膜.
• 细胞对低温的耐受力强于高温， 有人做过实验： • 放在45℃温度下，1小时死亡； • 放在 41 ～ 42 ℃下， 10 ～ 24 小时细 胞退化或死亡； • 放在在 25 ～ 35 ℃时，细胞缓慢生 长， • 放在4℃下几小时后再放人37℃下 培养，细胞仍能生长。
2、培养液的pH值
• 大多数动物细胞都适合在 pH7.2～pH7.4范围内生长. • 原代培养细胞对pH值要求较严， 传代培养细胞对pH值要求较宽。 • 细胞对偏酸环境的耐受性要强 于偏碱环境。
• （1）细胞培养环境 • 氨离子：动物细胞体外培养中氨离 子的积累是抑制细胞生长的主要因 素之一。 • 乳酸：它是细胞糖代谢的产物。高 乳酸浓度必将抑制细胞生长。
• 二氧化碳：随着细胞培养规模 和培养密度的增大，二氧化碳 积聚会对细胞产生毒性作用或 者改变细胞代谢水平。 • 甲基乙二醛：主要是丙糖磷酸 去除磷酸基后的代谢产物，也 是脂类、和氨基酸代谢的产物， 对于细胞有潜在的损伤作用。
（5）消化
• 传代培养或收获细胞均需使细胞脱 离微载体，通常采用酶消化法。
消化步骤： • 停止搅动，待微载体沉淀后，去净培养液， 用含0.25％EDTA的PBS（pH6.7），按50～ l00ml／g微载体量清洗微载体，弃EDTA-PBs。 • 加人胰蛋白酶一EDTA，37℃搅动消化15min • 加人含10%血清的培养液，终止消化作用。
(四)微囊化培养 （microcapsule culture）
• 微囊是用一种人造的半透膜 制成的多孔微球体，小分子 物质可以自由透过，而各种 酶、辅酶、离子交换剂、活 性炭及蛋白等大分子物质包 裹在其中不能逸出；
• 细胞生长在各自的 微小环境里受到一 定的保护。 • 减少了搅拌对细胞 产生的剪切力 • 由于环境的改善， 细胞得到很好的生 长，代谢产物浓度 增加，纯度提高。
（2）浸泡水化及消毒
• 在玻璃容器中加人适量的微载体， 加入磷酸缓冲液（PBS）浸泡3小 时以上，轻轻搅动。 • 搅动速度50～70rpm／min为好。 • 高压蒸汽灭菌，
（3）接种
• 根据细胞类型决定接种浓度， 例如，人成纤维细胞的适宜接 种浓度为10 cells／微载体； 非洲绿猴肾细胞（vero）为5 cells／微载体。 • 接种要达到一定浓度，但过高 也不利。
• 后经改进，用带不同基团的葡 聚糖（dextran）交联成几种 大分子，以利于细胞的贴壁及 生长。 • 目前使用的dextran I、Ⅱ、 Ⅲ三种型号都属于交联葡聚糖 为基质的微载体，每种微载体 所带基团各不相同。
微载体培养细胞的具体步骤
1）选择合适的微载体类型 ●先用少量三种微载体做细胞培 养试验，一定时间内计算细胞 贴壁数量，比较细胞用量、微 载体用量，以此选出适当的微 载体。
• 例 2: 将分离的胰岛细胞培养
1～3天后，按1.75×103 cells／ml浓度悬在1.5‰海 藻酸钠溶液中制成微囊，按 4×103个微囊／只老鼠，腹 腔植人培养一段时间后，老
鼠血糖下降,保持了一年。
二、影响动物细胞体外培养的环境 因素
1、培养温度 • 哺乳类细胞的最适培温度 37 ℃，鸡 细胞在 39 ～ 42 ℃，昆虫类细胞 25 ～ 28℃，冷水鱼细胞23℃，温水鱼 26℃。
12 • 4.5×10ˉ ～4.8×10 12 ˉ
g／
（cell●h）。
4、培养液渗透压
•
培养液的渗透压是指用以阻止细胞 水分子通过半透膜进人培养液的压力， 其大小与其浓度成正比。 • 原代培养的细胞一般对渗透压的波动 较敏感，而细胞株和细胞系则耐受性 较大。 • 培养液需要一定的渗透压。
三 动物细胞培养的关键技术