(推荐)高效液相色谱法的分类及原理
高效液相色谱法的检测原理
高效液相色谱法的检测原理高效液相色谱法（HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC）是一种分离、检测和定量化分析化合物的高效分析技术。
它已成为现代分析化学中不可缺少的手段之一。
一、HPLC的基本原理HPLC的基本原理是利用化合物在固定相和流动相之间的分配行为，通过不同的相互作用力（如极性、亲疏水性、离子性等）使化合物在固定相中发生分离。
其中，固定相是一种具有特定化学性质的材料，常用的固定相有硅胶、高分子材料等；流动相则是一种能够溶解样品的溶剂或混合物，流动相中的溶剂性质和浓度对分离效果有很大的影响。
在HPLC中，样品被注入进入色谱柱中，随着流动相的不断流动，化合物会在固定相中发生一系列的吸附、解吸、扩散等步骤，从而实现分离。
在某些情况下，需要利用色谱柱上的化学反应来实现分离。
例如，利用离子交换色谱柱可以实现对带电化合物的分离，利用手性固定相可以实现对手性化合物的分离。
二、HPLC的检测方式HPLC的检测方式主要有以下几种：1. UV检测：利用紫外线在化合物中的吸收特性，通过测定样品在不同波长下的吸光度来定量分析化合物。
2. 荧光检测：利用荧光化合物在激发光下的荧光发射特性，通过测定样品在不同波长下的荧光强度来定量分析化合物。
荧光检测对于具有荧光基团的化合物非常敏感，可以检测到极低浓度的化合物。
3. 电化学检测：利用电极与样品之间的电化学反应，通过测定电极的电势变化来定量分析化合物。
电化学检测通常用于检测带电化合物，如离子、电解质等。
4. 质谱检测：利用质谱仪对样品进行分析，通过测定化合物的质量谱图来确定化合物的结构和分子量。
三、HPLC的应用领域HPLC广泛应用于药物分析、食品安全、环境监测、化学品生产等领域。
例如，药物分析中常用HPLC对药物成分进行分离和定量，食品安全中常用HPLC对食品中的添加剂、农药残留等进行检测，环境监测中常用HPLC对水体、土壤中的有害物质进行检测。
高效液相色谱简介及操作
HPLC和经典液相色谱法的比较
3.高效液相色谱法的分类
• 通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色谱法、分配色谱法、离子色 谱法和凝胶色谱法四大类。
4.如何阅读色谱图？？
tR：保留时间；tM：死时间； ：调整保留时间； W：峰宽
• 定性分析：在同一色谱系统中相同物质具 有相同的保留值 • 定量分析：组分含量与其响应值（峰高或 面积）成正比
2 色谱柱使用的注意事项
• 色谱柱在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动。 • 当分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存（一般 为甲醇）。 • 每天工作结束后用适当的溶剂来清洗柱。
3 其他注意事项
• 未经提取净化的蛋白样品、血样、生物样品绝对禁 止直接进样分析。 • 要注意流动相的脱气。 • 避免使用高粘度的溶剂作为流动相。 • 使用新鲜配制的流动相，特别是水溶剂或缓冲液建 议不超过两天，最好每天更换。
（5）色谱柱平衡后，打开检测器（开灯） （6）测定样品 （7）清洗仪器
色谱柱及流路清洗 进样阀清洗 进样针清洗
四、主要注意事项
1 泵使用的注意事项
•
• •
• •
防止任何固体微粒进入泵体（用0.22 um或0.45 um 的微孔滤膜过滤） 流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲盐的流 动相不应保留在泵内更不允许留在柱内。 泵工作时防止溶剂瓶内的流动相用完，否则空泵运 转一是会使大量空气进入柱内柱床崩塌、也会磨损柱塞、 密封圈，最终产生漏液。 输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力。 流动相应先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量 的稳定性和分析结果。
c. 荧光检测器 (FLD) 只适用于具有荧光的有机化合物（如多环芳烃、氨基 酸、胺类、维生素和某些蛋白质等）的测定。
高效液相色谱法的分离原理
高效液相色谱法的分离原理（原创版）目录一、高效液相色谱法的基本概念二、高效液相色谱法的分离原理1.流动相与固定相的相互作用2.溶质在两相间的分配3.平衡时的计算公式三、高效液相色谱法的应用领域四、高效液相色谱法的常见故障及其排除方法正文高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种以液体为流动相的色谱分析方法，广泛应用于医药卫生、食品安全、环境化学等各个领域。
其分离原理主要基于溶质在固定相和流动相之间的分配，达到平衡时，服从于高效液相色谱计算公式。
在高效液相色谱法中，流动相与固定相之间应互不相溶，且具有明显的分界面。
当试样进入色谱柱后，溶质会在两相间进行分配。
在达到平衡时，溶质在固定相和流动相中的浓度会达到一定的比例关系。
通过计算公式，我们可以得到溶质在固定相和流动相中的浓度。
高效液相色谱法的应用领域十分广泛，包括但不限于医药卫生、食品安全、环境化学等各个领域。
在医药卫生领域，高效液相色谱法可以用于药物分析、药物研发和药品质量控制等；在食品安全领域，可以用于食品成分分析、添加剂检测和农药残留检测等；在环境化学领域，可以用于水质分析、土壤污染检测和空气污染监测等。
在使用高效液相色谱法过程中，可能会遇到一些常见故障，如流动相泄漏、检测器信号不稳定、色谱柱分离效果差等。
对于这些故障，我们可以采取相应的排除和解决方法。
例如，对于流动相泄漏，可以检查流动相输送管路是否破损、接头是否松动等；对于检测器信号不稳定，可以检查检测器是否受到外界干扰、信号线是否接触良好等；对于色谱柱分离效果差，可以检查色谱柱是否损坏、固定相是否流失等。
综上所述，高效液相色谱法是一种分离效果高、速度快、应用广泛的色谱分析方法。
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hplc高效液相色谱法
HPLC高效液相色谱法简介高效液相色谱法（HPLC）是一种利用液体作为流动相，通过高压输液系统，将样品中的各组分在固定相和流动相之间进行分配或吸附等作用而实现分离和检测的色谱技术。
HPLC具有分离效率高、灵敏度高、选择性强、分析速度快、样品适用范围广等优点，已成为化学、生物、医药、环境等领域中最重要的分析方法之一。
本文将简要介绍HPLC的基本原理、仪器组成、常用的色谱模式和应用领域，以期对HPLC感兴趣的读者有所帮助。
一、HPLC的基本原理HPLC的基本原理是利用样品中的各组分在固定相和流动相之间的不同亲和力，使其在色谱柱内以不同的速度移动，从而达到分离的目的。
固定相是填充在色谱柱内的颗粒状物质，可以是固体或涂于固体载体上的液体。
流动相是通过高压泵送入色谱柱的溶剂或溶剂混合物，可以是极性或非极性的。
样品是通过进样器注入流动相中，并随流动相进入色谱柱。
当样品中的各组分经过固定相时，会发生吸附、分配、离子交换、排阻等作用，导致它们在固定相中停留不同的时间。
这个时间称为保留时间（retention time），通常用tR表示。
保留时间是反映样品组分在色谱柱内分离程度的重要参数，不同的组分有不同的保留时间。
当样品组分从色谱柱出口流出时，会被检测器检测到，并产生一个信号。
这个信号随时间变化而变化，形成一个色谱峰（chromatographic peak）。
色谱峰的位置反映了样品组分的保留时间，色谱峰的面积或高度反映了样品组分的含量或浓度。
将检测器信号随时间变化而绘制出来，就得到了一条色谱图（chromatogram）。
色谱图上可以看到不同的色谱峰，每个峰对应一个样品组分。
通过比较保留时间和色谱峰面积或高度，就可以对样品进行定性和定量分析。
二、HPLC仪器组成HPLC仪器主要由以下几个部分组成：溶剂供给系统（solvent delivery system）：负责提供恒定压力和流速的流动相，并将溶剂混合成所需比例。
第二十章高效液相色谱(第五版)
（2）L2 = 30cm:
R1 2 L1 ( ) R2 L2
L2 30 R 2 R1 1.33 1.88 L1 15
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紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特 定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。
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光电二极管阵列检测器
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(二) 荧光检测器 fluorophotometric detector 特点： • 灵敏度高（高于紫外检测器）
• 只适用于能产生荧光或其衍生物能发
荧光的物质。
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(三) 蒸发光散色检测器 evaporative light scattering detector
流动相 （样品）
流动相蒸发除去
加热
组分形成气溶胶
强光
特点： 测定散射光强 • 灵敏度低 I = k mb • 通用型：如糖类、 氨基酸等分析
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(四) 化学发光检测器
组分 + 发光试剂 激发态产物 光辐射
n1/2 -1 k2 R = —— (——) (——) 4 1+k2
：主要受溶剂种类的影响
k ：主要受溶剂配比的影响
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选择流动相时应注意的几个问题
（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累 积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 （2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏 柱子。如使固定液溶解流失； （3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉 淀并在柱中沉积。
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第二节 HPLC的固定相和流动相及其选择
一、化学键合固定相：目前应用最广、性能最佳的固定相；
a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广； c. 硅碳键型： ≡Si—C d. 硅氮键型： ≡Si—N
高效液相色谱法的原理
高效液相色谱法的原理高效液相色谱法（HPLC）是一种常用的分离和分析技术，它是在液相色谱法的基础上发展起来的，具有高效、灵敏、准确、快速等特点。
其原理是利用液相在固定填料上的分配作用，通过样品在流动相中的分配系数不同，实现对混合物中各成分的分离和检测。
HPLC的原理主要包括样品的进样、流动相的选择、填料的选择和柱温控制等几个方面。
首先是样品的进样。
样品通过进样装置进入流动相中，然后被输送到填料柱中进行分离。
在进样过程中，要求样品能够均匀、快速地进入流动相中，以保证分析结果的准确性。
其次是流动相的选择。
流动相是HPLC分离的关键，它可以是有机溶剂、水、缓冲液等。
不同的流动相对于不同的样品具有不同的适用性，因此在选择流动相时需要考虑样品的性质和分离的要求。
填料的选择也是HPLC分离的重要因素。
填料是HPLC柱中的固定相，它的种类和粒径大小直接影响到分离的效果。
常用的填料有C18、C8、SiO2等，它们具有不同的分离机理和适用范围，需要根据具体的分析要求进行选择。
此外，柱温的控制也对HPLC分离有着重要的影响。
柱温的升高可以提高分离效率和分辨率，减少分离时间，但也会增加柱的压力和流动相的挥发，因此在实际应用中需要综合考虑。
总的来说，HPLC的原理是通过样品在流动相和固定相之间的分配作用，实现对混合物中各成分的分离和检测。
在实际应用中，需要根据具体的分析要求选择合适的进样方式、流动相、填料和柱温控制，以达到最佳的分离效果。
通过对HPLC原理的深入了解，可以更好地应用HPLC技术进行分离和分析，为科研和生产提供准确、可靠的数据支持。
同时，不断探索和创新HPLC技术，将有助于提高其分离效率和应用范围，推动科学研究和工程技术的发展。
高效液相色谱法的原理及影响因素
高效液相色谱法的原理及影响因素高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC）是一种在液相中进行分离和分析的高效分析技术。
它具有高分辨率、高灵敏度、良好的线性范围和广泛的适用性。
以下是关于HPLC的原理和影响因素的详细介绍。
一、高效液相色谱的原理：高效液相色谱的原理基于物质在液态流动相中的分配和吸附特性，通过调节流动相的组成和性质，控制样品成分在固定相中的分离。
高效液相色谱的基本组成包括进样器、流动相系统、柱和检测器。
1.进样器：样品通过进样器引入色谱柱中。
进样器可以分为自动进样器和手动进样器两种类型。
2.流动相系统：流动相系统由溶剂混合器、溶剂泵和压力传递系统组成。
溶剂混合器用于混合不同溶剂的比例，以制备合适的流动相。
溶剂泵用于将流动相以一定的流速送入色谱柱中，常用的泵有恒压泵和梯度泵等。
3.柱：色谱柱是高效液相色谱的核心部件。
分离是通过样品成分在柱中的相互作用和分配系数的差异实现的。
色谱柱常见的填充物包括C18、C8和氨基硅胶等，不同填充物对于不同的样品具有不同的分离效果。
4.检测器：搭配不同的检测器可以对样品成分进行定性和定量分析。
常见的检测器包括紫外可见光谱检测器（UV）、荧光检测器（FLD）、电化学检测器和质谱检测器等。
五、高效液相色谱的影响因素：高效液相色谱的分离和分析结果受多种因素的影响，包括以下几个方面：1.流动相组成：流动相的组成直接影响样品成分在固定相上的分配系数，进而影响分离效果。
流动相的成分要根据样品的性质和需要进行选择。
常用的流动相包括纯溶剂、溶剂混合物和缓冲液等。
2.流动相性质：流动相的性质包括溶液的pH值、离子强度、流速和温度等。
其中，溶液的pH值和离子强度的变化可以影响分析物的离子态，进而影响分离效果。
流速的选择要根据分析物的种类和浓度进行调整。
温度的增加可以提高分子的扩散速度，加快分离过程。
3.色谱柱：色谱柱的类型、填充物和尺寸等也对分离效果有重要影响。
高效液相色谱法的分类及原理
高效液相色谱法的分类及其分离原理高效液相色谱法分为：液-固色谱法、液-液色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法。
1.液-固色谱法（液-固吸附色谱法）固定相是固体吸附剂，它是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分配的。
①液-固色谱法的作用机制吸附剂：一些多孔的固体颗粒物质，其表面常存在分散的吸附中心点。
流动相中的溶质分子X（液相）被流动相S带入色谱柱后，在随载液流动的过程中，发生如下交换反应：X（液相）+nS（吸附）<==>X（吸附）+nS（液相）其作用机制是溶质分子X（液相）和溶剂分子S（液相）对吸附剂活性表面的竞争吸附。
吸附反应的平衡常数K为：K值较小：溶剂分子吸附力很强，被吸附的溶质分子很少，先流出色谱柱。
K值较大：表示该组分分子的吸附能力较强，后流出色谱柱。
发生在吸附剂表面上的吸附-解吸平衡，就是液-固色谱分离的基础。
②液-固色谱法的吸附剂和流动相常用的液-固色谱吸附剂：薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛、聚酰胺等。
一般规律：对于固定相而言，非极性分子与极性吸附剂（如硅胶、氧化铜）之间的作用力很弱，分配比k较小，保留时间较短；但极性分子与极性吸附剂之间的作用力很强，分配比k大，保留时间长。
对流动相的基本要求：试样要能够溶于流动相中流动相粘度较小流动相不能影响试样的检测常用的流动相：甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等。
③液-固色谱法的应用常用于分离极性不同的化合物、含有不同类型或不；数量官能团的有机化合物，以及有机化合物的不同的异构体；但液-固色谱法不宜用于分离同系物，因为液-固色谱对不同相对分子质量的同系物选择性不高。
2.液-液色谱法（液-液分配色谱法）将液体固定液涂渍在担体上作为固定相。
①液-液色谱法的作用机制溶质在两相间进行分配时，在固定液中溶解度较小的组分较难进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定液中溶解度较大的组分容易进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达到分离的目的。
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高效液相色谱法的分类及其分离原理
高效液相色谱法分为：液-固色谱法、液-液色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法。
1.液-固色谱法（液-固吸附色谱法）
固定相是固体吸附剂，它是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分配的。
①液-固色谱法的作用机制
吸附剂：一些多孔的固体颗粒物质，其表面常存在分散的吸附中心点。
流动相中的溶质分子X（液相）被流动相S带入色谱柱后，在随载液流动的过程中，发生如下交换反应：
X（液相）+nS（吸附）<==>X（吸附）+nS（液相）
其作用机制是溶质分子X（液相）和溶剂分子S（液相）对吸附剂活性表面的竞争吸附。
吸附反应的平衡常数K为：
K值较小：溶剂分子吸附力很强，被吸附的溶质分子很少，先流出色谱柱。
K值较大：表示该组分分子的吸附能力较强，后流出色谱柱。
发生在吸附剂表面上的吸附-解吸平衡，就是液-固色谱分离的基础。
②液-固色谱法的吸附剂和流动相
常用的液-固色谱吸附剂：薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛、聚酰胺等。
一般规律：对于固定相而言，非极性分子与极性吸附剂（如硅胶、氧化铜）之间的作用力很弱，分配比k较小，保留时间较短；但极性分子与极性吸附剂之间的作用力很强，分配比k大，保留时间长。
对流动相的基本要求：
试样要能够溶于流动相中
流动相粘度较小
流动相不能影响试样的检测
常用的流动相：甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等。
③液-固色谱法的应用
常用于分离极性不同的化合物、含有不同类型或不；数量官能团的有机化合物，以及有机化合物的不同的异构体；但液-固色谱法不宜用于分离同系物，因为液-固色谱对不同相对分子质量的同系物选择性不高。
2.液-液色谱法（液-液分配色谱法）
将液体固定液涂渍在担体上作为固定相。
①液-液色谱法的作用机制
溶质在两相间进行分配时，在固定液中溶解度较小的组分较难进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定液中溶解度较大的组分容易进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达到分离的目的。
液-液色谱法与液-液萃取法的基本原理相同，均服从分配定律：K=C固/C液
K值大的组分，保留时间长，后流出色谱柱。
②正相色谱和反相色谱
正相分配色谱用极性物质作固定相，非极性溶剂（如苯、正己烷等）作流动相。
反相分配色谱用非极性物质作固定相，极性溶剂（如水、甲醇、己腈等）作流动相。
一般地，正相色谱是固定液的极性大于流动相的极性，而反相色谱是固定相的极性小于流动相的极性。
正相色谱适宜于分离极性化合物，反相色谱则适宜于分离非极性或弱极性化合物。
③液-液色谱法的固定相
常用的固定液为有机液体，如极性的β，β′氧二丙腈（ODPN），非极性的十八烷（ODS）和异二十烷（SQ）等。
缺点：涂渍固定液容易被流动相冲掉。
采用化学键合固定相则可以避免上述缺点。
使固定浓与担体之间形成化学键，例如在硅胶表面利用硅烷化反应：形成Si-O-Si-C 型键，把固定液的分子结合到担体表面上。
优点：
化学键合固定相无液坑，液层薄，传质速度快，无固定液的流失。
固定液上可以结合不同的官能团，改善分离效能。
固定液不会溶于流动相，有利于进行梯度洗提。
④液-液色谱法的应用
液-液色谱法既能分离极性化合物，又能分离非极性化合物，如烷烃、烯烃、芳烃、稠环、染料、留族等化合物。
化合物中取代基的数目或性质不同，或化合物的相对分子质量不同，均可以用液-液色谱进行分离。
3.离子交换色谱法
原理：离子交换色谱法是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的被测离子进行可逆交换，由于被测离子在交换剂上具有不同的亲和力（作用力）而被分离。
①离子交换色谱法的作用机制
聚合物的分子骨架上连接着活性基团，如：-SO3-，-N（CH3）3+等。
为了保持离子交换树脂的电中性，活性基团上带有电荷数相同但正、负号相反的离子X，称为反离子。
活性基团上的反离子可以与流动相中具有相同电荷的被测离子发生交换：
离子交换色谱的分配过程是交换与洗脱过程。
交换达到平衡时：
K值越大，保留时间越长。
②溶剂和固定相
两种类型：多孔性树脂与薄壳型树脂。
多孔性树脂：极小的球型离子交换树脂，能分离复杂样品，进样量较大；缺点是机械强度不高，不能耐受压力。
薄壳型离子交换树脂：在玻璃微球上涂以薄层的离子交换树脂，这种树脂柱效高，当流动相成分发生变化时，不会膨胀或压缩；缺点是但柱子容量小，进样量不宜太多。
③离子交换色谱法的应用
主要用来分离离子或可离解的化合物，凡是在流动相中能够电离的物质都可以用离子交换色谱法进行分离。
广泛地应用于：无机离子、有机化合物和生物物质(如氨基酸、核酸、蛋白质等)的分离。
4.凝肤色谱法（空间排阻色谱法）
凝胶是一种多孔性的高分子聚合体，表面布满孔隙，能被流动相浸润，吸附性很小。
凝胶色谱法的分离机制是根据分子的体积大小和形状不同而达到分离目的。
①凝胶色谱法的作用机制
体积大于凝胶孔隙的分子，由于不能进入孔隙而被排阻，直接从表面流过，先流出色谱柱；小分子可以渗入大大小小的凝胶孔隙中而完全不受排阻，然后又从孔隙中出来随载液流动，后流出色谱柱；中等体积的分子可以渗入较大的孔隙中，但受到较小孔隙的排阻，介乎上述两种情况之间。
凝胶色谱法是一种按分子尺寸大小的顺序进行分离的一种色谱分析方法。
②凝胶色谱法的固定相
软质凝胶、半硬质凝胶和硬质凝胶三种。
③凝胶色谱法的应用特点
保留时间是分子尺寸的函数，适宜于分离相对分子质量大的化合物，相对分子质量在400～8×105的任何类型的化合物。
保留时间短，色谱峰窄，容易检测。
固定相与溶质分子间的作用力极弱，趁于零，柱的寿命长。
不能分辨分子大小相近的化合物，分子量相差需在10%以上时才能得到分离。
（注：专业文档是经验性极强的领域，无法思考和涵盖全面，素材和资料部分来自网络，供参考。
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