鼠神经生长因子生物学活性测定法
大鼠神经生长因子(NGF)说明书(1)
释。
480ng/L
5 号标准品
150µl 的原倍标准品加入 150µl 标准品稀释液
240ng/L
4 号标准品
150µl 的 5 号标准品加入 150µl 标准品稀释液
120ng/L
3 号标准品
150µl 的 4 号标准品加入 150µl 标准品稀释液
60 ng/L
2 号标准品
150µl 的 3 号标准品加入 150µl 标准品稀释液
11 封板膜
2张
6 显色剂 B 液
6ml×1/瓶
12 密封袋
1个
标本要求
1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能
马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融
2．不能检测含 NaN3 的样品，因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤
1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀
生长因子（NGF），再与 HRP 标记的神经生长因子（NGF）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标 抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色，并 在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的神经生长因子（NGF）呈正相 值），通过标准曲线计算样品中大鼠神经生长因
30 ng/L
1 号标准品
150µl 的 2 号标准品加入 150µl 标准品稀释液
2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、
待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样 50µl，待测样品孔中先加样品稀释液 40µl， 然后再加待测样品 10µl（样品最终稀释度为 5 倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽 量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3. 温育：用封板膜封板后置 37℃温育 30 分钟。 4. 配液：将 30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30 倍稀释后备用 5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此 重复 5 次，拍干。 6. 加酶：每孔加入酶标试剂 50µl，空白孔除外。 7. 温育：操作同 3。 8. 洗涤：操作同 5。 9. 显色：每孔先加入显色剂 A50µl，再加入显色剂 B50µl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色 10 分钟. 10. 终止：每孔加终止液 50µl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 11. 测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。 测定应在加终止 液后 15 分钟以内进行。 操作程序总结：
10 鼠神经生长因子
注射用鼠神经生长因子Zhusheyong Shu Shenjing ShengzhangyinziMouse Nerve Growth Factor for Injection本品系由健康小鼠颌下腺提取的生物活性蛋白质。
经分离、纯化后加入适宜稳定剂后冻干制成，不含防腐剂。
1 基本要求生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。
2 制造2.1 小鼠颌下腺来源及采集2.1.1 采用体重为20克以上60-90日龄健康雄性小鼠，小鼠应符合清洁级动物相关要求（附录XXX）。
2.1.2 采用适宜方法处死小鼠，经局部消毒处理后摘取颌下腺，剔除其他组织后备用。
如需存放应冻存于-20℃以下，并规定保存时间。
2.2 原液2.2.1 提取采用适宜的方法将小鼠颌下腺破碎匀浆，离心取上清。
2.2.2 纯化采用经批准的方法进行纯化、病毒去除或灭活后即为鼠神经生长因子原液。
2.2.3 原液检定按3.1项进行。
2.3 半成品2.3.1 配制按成品规格配制，并加入适宜稳定剂。
2.3.2 半成品检定按3.2项进行。
2.4 成品2.4.1 分批应符合“生物制品分批规程”规定。
2.4.2 分装及冻干应符合“生物制品分装和冻干规程”及附录I A有关规定。
2.4.3 规格应为经批准的规格。
30μg(≥15000AU) /支18μg(≥9000AU) /支20μg(≥9000AU)/支2.4.4 包装应符合“生物制品包装规程“及附录I A有关规定。
2.5 病毒去除和灭活生产过程中应采用经批准的方法去除和灭活病毒。
如用灭活剂(如有机溶剂、去污剂)灭活病毒，则应规定对人安全的灭活剂残留量限值。
3 检定3.1 原液检定3.1.1 生物学活性依法测定（附录Ⅹxx）。
3.1.2 蛋白质含量依法测定（附录ⅥB第二法），应不低于0.1mg/ml。
3.1.3 比活性为生物学活性与蛋白质含量之比。
每1mg蛋白质应不低于5.0×105AU。
鼠神经生长因子原理
鼠神经生长因子原理鼠神经生长因子（NGF，Nerve Growth Factor）是一种神经营养因子，被认为对神经系统发育和维持有重要作用。
它最早是由利昂尼·阿维奇纳（Levi-Montalcini）和斯坦利·科恩（Cohen）在1952年共同发现，并获得了1986年的诺贝尔生理学或医学奖。
鼠神经生长因子的研究奠定了神经发育生物学的基础，也为后续的研究提供了重要的理论依据。
它的发现和研究对于理解神经系统的发育、再生以及一些与神经系统相关的疾病的治疗具有重要意义。
NGF的研究首先从一个观察开始。
利昂尼·阿维奇纳和斯坦利·科恩发现当离体培养的鼠胚胎神经节细胞被种在培养基中时，细胞会发生异常的增殖和分化。
他们提取了这种细胞培养基，并命名为鼠神经母细胞浸润素（nerve-mother-cell-制液，即鼠神经生长因子）。
这个发现在当时被认为是革命性的，因为在之前的研究中，人们认为神经元的发育是无需外界因素的。
进一步的研究揭示了鼠神经生长因子通过结合特异性受体在神经系统中发挥作用。
这个受体被称为酪氨酸激酶类型A（tyrosinekinase A receptor，TrkA）。
通过与TrkA受体结合，NGF可以触发一系列的细胞信号传递，促进神经元的生长和分化。
这说明了NGF在神经系统中的重要作用。
接下来的研究逐渐揭示了鼠神经生长因子的更多作用和机制。
研究人员发现NGF还可以促进神经元突起的生长和分支，促进突触形成和稳定，并调控神经元的存活和死亡。
它也被证明在神经损伤和神经退行性疾病的治疗中具有潜力。
事实上，一些研究已经尝试使用NGF 的外源性补充来治疗神经退行性疾病如阿尔茨海默病等，取得了一定的进展。
此外，NGF不仅对神经元有影响，它还和其他细胞类型相互作用，如胶质细胞、免疫细胞等。
它在神经系统免疫调节、炎症反应和伤口愈合中也起到重要的作用。
总之，鼠神经生长因子的研究为我们揭示了神经系统发育和维持的重要机制。
9生长激素生物活性的测定方法中国药品检验标准操作规范
生长激素生物活性的测定方法一、去垂体大白鼠体重法1 实验材料及用具1.1 天平精度0.01mg 供试品称量用精度1mg 试剂称量用精度0.1g 大鼠称重用1.2 实验用具手术板、注射器（1ml，精度0.01ml）、吸管、移液管、带塞玻璃小瓶、烧杯、玻璃棒、量筒、脱脂棉。
1.3 手术器械手术剪、直镊、眼科剪、眼科直镊、眼科弯剪、牙科钻、钻头、抽滤瓶、真空泵、牙科刮勺、止血钳。
1.4 试剂氯化钠、牛血清白蛋白、乌拉坦。
2 溶液配制2.1 生理盐水称取氯化钠适量，加水配成0.9%的溶液。
2.2 牛血清白蛋白的生理盐水溶液，称取牛血清白蛋白适量，加生理盐水配成0.1%的牛血清白蛋白的生理盐水溶液，简称溶媒。
2.3 乌拉坦溶液称取乌拉坦适量，加生理盐水配成25%的乌拉坦溶液。
2.4 标准品溶液2.4.1 实验当日，取生长激素标准品，放置至室温。
2.4.2 割开安瓶（注意勿使内容物损失）立即按标示效价精确加以定量溶媒将全部内容物洗出，使成1.0IU/ml的标准品溶液；亦可精密加入适量溶媒使溶解，混合均匀，精密吸取适量，用溶媒配制成1.0IU/ml的标准品溶液。
2.5 标准品稀释液2.5.1 按《中国药典》附录生长激素生物检定法的要求，选择标准品高（d S2）、低（d S1）2组剂量及剂距。
2.5.2 计算2组剂量稀释液浓度及大鼠6天内皮下注射的总毫升数，一般高浓度稀释液可配成每1ml中含0.10~0.25IU（随季节、动物品系和来源不同），低浓度稀释液可配成每1ml中含0.025~0.06IU，高、低两浓度比值r=1:0.25，每鼠皮下注射每天0.5ml/次，连续6天，每组至少8只，例如：高浓度稀释液d S2=0.1IU/ml×0.5ml/（天．鼠）×6天×8鼠/组=2.4IU/组，即0.1IU/ml高浓度稀释液24ml低浓度稀释液d S1=0.025IU/ml×0.5ml/（天．鼠）×6天×8鼠/组=0.6IU/组，即0.025IU/ml低浓度稀释液24ml2.5.3 精密量取1.0IU/ml标准品溶液适量，置50ml烧杯中，加入溶媒适量成标准品d S2稀释液（如0.1IU/ml）。
鼠神经生长因子生物学活性测定法
附录Ⅹxx 鼠神经生长因子生物学活性测定法 第一法 鸡胚背根神经节培养法 试剂 （1）鼠尾胶 大鼠鼠尾用 75%酒精消毒后，分离出尾腱，剪碎，浸泡于 0.1%
100U(每步稀释不超过 10 倍)。在 96 孔细胞培养板中，做 3 倍系列稀释，共 8 个稀释度，每 个稀释度做 2 孔，每孔分别留 100μl 标准品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件 下进行。 测定法 TF-1 细胞株用完全培养液于 37℃、 5％二氧化碳条件下培养， 控制细胞浓度为 每 1ml 含 1.0× 105~5.0× 105 个细胞，传代后 24 小时用于生物学活性测定。将试验所用溶液预 温至 37℃。取足量 TF-1 细胞培养物，离心收集 TF-1 细胞，用基础培养液洗涤 3 次，然后 重悬于基础培养液配成每 1ml 含 6.0× 104 个细胞的细胞悬液，置于 37℃、5％二氧化碳条件 下备用。在加有标准品溶液和供试品溶液的 96 孔细胞培养板中每孔加入细胞悬液 100μl， 于 37℃、5％二氧化碳条件下培养 66～72 小时。每孔加入 MTS 溶液 20μl，于 37℃、5％二 氧化碳条件下培养 3 小时。以上操作在无菌条件下进行。放入酶标仪，以 550nm 为参比波 长，在波长 490nm 处测定吸光度，记录测定结果。 试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，并按下式计算结果： 供试品生物学活性（U/ml）=Pr×
Ds Es Dr Er
式中 Pr 为标准品生物学活性，U/ml； Ds 为供试品预稀释倍数； Dr 为标准品预稀释倍数； Es 为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数； Er 为标准品半效量的稀释倍数。
《中国药典》2015年版生物制品质控要点
通用性技术要求—凡例General notices
（十章31条修订为十章34条）
章节
内容
2015版增修订
总 则：
6项（1-6），药典结构、内容、使用 标准体系中明确生物制品通则（原通则）和通则（原附录），并在生物制品通
原则的一般说明
则与各论之间增加总论的相关描述
正文（各论）
2项（7-8），各论内容、体例框架
生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程修订一对生产用细胞基质总的要求一细胞系株历史资料二细胞培养操作要求三细胞库四细胞检定五生产细胞培养二连续传代细胞系的特殊要求verochons0细胞等三人二倍体细胞株的特殊要求mrc52bskmb17等五原代细胞的要求一动物组织来源和其他材料二原代细胞培养物的检查phk六检定用细胞的要求一细胞资料二细胞检定附录1逆转录酶活性检查法附录2成瘤性检查法附录3致瘤性检查法17一供血浆者的选择一供血浆者体格检查二供血浆者血液检验三有下列情况者不能供血浆四有下列情况者暂不供血浆五供血浆者接受免疫接种后采集血浆的规定二血浆的采集一单采血浆站要求二采集血浆器材的要求三采集血浆的频度及限量三血浆检验一单人份血浆二合并血浆六特异性免疫血浆制备及其供血浆者免疫要求一血浆二供血浆者三供血浆者免疫18生物物免疫血浆 人血浆
未修订：
生物制品分批规程 生物制品包装规程
生物制品通则： 生物制品分批规程--无修订
1. 批号审定的组织管理
2. 批号（批、亚批）确定的原则：同一批号的制 品,应来源一致、质量均一,按规定要求抽样检验 后,能对整批制品作出评定。
3. 生物制品批号和亚批号编制的具体规则；
9203 药品微生物实验室质量管理指导原则
8005 指示剂与指示液
大鼠(Rat)神经生长因子(NGF)-NEWA
本试剂盒只能用于科学研究，不得用于医学诊断大鼠大鼠（（Rat Rat））神经生长因子（神经生长因子（NGF NGF NGF））ELISA 检测试剂盒使用说明书检测原理试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。
往预先包被神经生长因子（NGF）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。
用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的神经生长因子（NGF）呈正相关。
用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。
样品收集、处理及保存方法1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2.血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。
3000转离心30分钟取上清。
3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4.组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。
3000转离心10分钟取上清。
5.保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
自备物品1.酶标仪（450nm）2.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL3.37℃恒温箱操作注意事项1.试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。
从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。
2.实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。
3.浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白；按照说明书操作时样本已经稀释5倍，最终结果乘以5才是样本实际浓度。
严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。
4.所有液体组分使用前充分摇匀。
试剂盒组成名称96孔配置48孔配置备注微孔酶标板12孔×8条12孔×4条无标准品0.3mL*6管0.3mL*6管无样本稀释液6mL3mL无检测抗体-HRP10mL5mL无20×洗涤缓冲液25mL15mL按说明书进行稀释底物A6mL3mL无底物B6mL3mL无终止液6mL3mL无封板膜2张2张无说明书1份1份无自封袋1个1个无注：标准品（S0-S5）浓度依次为：0、25、50、100、200、400pg/mL试剂的准备20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。
大鼠神经营养因子3(NT3)说明书
大鼠神经营养因子3(NT3)说明书大鼠神经营养因子3(NT3)说明书一、产品简介大鼠神经营养因子3(NT3)是一种神经元特异性生长因子，具有促进神经细胞生长和发育的作用。
本说明书旨在提供有关大鼠神经营养因子3的详细信息，包括产品性质、适用范围、使用方法、储存条件和注意事项等。
二、产品性质1. 化学性质：大鼠神经营养因子3是一种多肽生物活性物质，由176个氨基酸残基组成。
2. 分子量：约为19.7kDa。
3. 纯度：大鼠神经营养因子3经过高效液相层析纯化，纯度高于95%。
4. 活性：经过酶活性测定，大鼠神经营养因子3活性为XXX U/mg （以某一标准试剂为参照）。
三、适用范围大鼠神经营养因子3可广泛应用于神经科学研究、组织工程学以及药物研发等领域。
主要功能包括但不限于：1. 促进神经元的生长和发育。
2. 改善神经元连接和突触传递效率。
3. 减轻神经退行性疾病患者的症状，并促进其神经再生。
四、使用方法1. 取适量的大鼠神经营养因子3溶液，按照具体实验要求进行稀释。
2. 使用前应先充分溶解，建议使用生理盐水、细胞培养基等缓冲液稀释。
3. 尽量避免反复冻融，以保持产品的活性。
五、储存条件1. 大鼠神经营养因子3应存放在-20℃以下避光、干燥的环境中。
2. 如需长期保存，建议将产品分装后置于-80℃的超低温冰箱中。
3. 避免反复冻融，每次使用后应立即回冻。
六、注意事项1. 本产品仅供科学研究使用，不用于临床诊断和治疗。
2. 使用本产品前请详细阅读相关文献，并参考相关实验方法及操作说明。
3. 避免将产品接触人体皮肤、摄入或吸入，如不慎接触，请立即用大量清水冲洗，并求医咨询。
4. 本产品为实验室专用品，严禁用于其他非法目的。
以上为大鼠神经营养因子3(NT3)的说明书内容，如有其他问题，请咨询相关生产商或供应商。
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样品终点稀释倍数 工作参考品终点稀释倍数
（5）TF-1 细胞 TF-1 细胞株用完全培养基于 37℃、5%二氧化碳培养箱中培养，控制细 胞浓度为每 1ml 含 1.0×105～5.0×105 个细胞，传代后 24 小时用于 NGF 生物学活性测定。 标准品溶液的制备 取鼠神经生长因子生物学活性测定的国家标准品， 按说明书复溶后， 用基础培养液稀释至每 1ml 含 100U(每步稀释不超过 10 倍)。在 96 孔细胞培养板中，做 3 倍系列稀释，共 8 个稀释度，每个稀释度做 2 孔，每孔分别留 100μl 标准品溶液，弃去孔中 多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。 供试品溶液的制备 将供试品按标示量复溶后，用基础培养液稀释至每 1ml 约含
附录Ⅹxx 鼠神经生长因子生物学活性测定法 第一法 鸡胚背根神经节培养法 试剂 （1）鼠尾胶 大鼠鼠尾用 75%酒精消毒后，分离出尾腱，剪碎，浸泡于 0.1%
冰醋酸溶液中溶解 48 小时，4℃、4000 转/分钟离心 30 分钟，取上清液，经 121℃、15 分 钟灭菌，-20℃保存。 （2） DMEM 培养液 取市售 DMEM 培养液， 加入终浓度为 100Iu/m1 青霉素、 100Iu/m1 链霉素和 2mmol/L L-谷氨酰胺，混匀。 （3）基础培养液 量取胎牛血清（FBS）10ml，加 DMEM 培养液 90ml，4℃保存。 标准品溶液和供试品溶液的制备 取注射用鼠神经生长因子生物学活性测定的国家标 准品，用 DMEM 培养液做 3 倍系列稀释，共 5~6 个稀释度。取已过滤除菌的供试品做相同 稀释。 测定法 取 7~9 天的鸡胚，无菌条件下取出背根神经节，分置于涂有鼠尾胶的培养瓶 中，贴壁 1~2 小时后，加入不同稀释度的标准品溶液和供试品溶液，并设阴性对照瓶，于 37℃、含 5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养 24 小时，用倒置显微镜观察神经节轴突生长情 况，以引起++++生长的最高稀释度为判定终点，用下式计算样品的生物学活性单位。 样品的活性单位(AU/ml)＝工作参考品活性× 【附注】神经节轴突生长判定标准 “#” 神经节生长过量抑制； “++++”：神经节突起长满四周，又长又密，呈树杈状； “+++”：神经节突起长满 2/3 周，呈树杈状； “++”：神经节突起长满 1/2 周； “+”：神经节突起只有几根； “－”：无突起生长。 第二法 TF-1 细胞/MTS 比色法 本法系依据人红细胞白血病细胞 （简称 TF-1 细胞） 的生长状况因鼠神经生长因子 （NGF） 生物学活性的不同而不同，以此检测 NGF 的生物学活性。 试剂 （1）RPMI 1640 培养液 取市售 RPMI 1640 培养液，加入终浓度为 100Iu/m1 青霉素和 100Iu/m1 链霉素。 （2） 基础培养液 量取胎牛血清 （FBS） 100ml， 加入 RPMI 1640 培养液 900ml 中。 4℃ 保存。 （3）完全培养液 基础培养液添加鼠神经生长因子至终浓度为每 1ml 含 12U。 （4）MTS 溶液 取市售的 MTS 于 4℃融化，1.2ml/支分装到 EP 管中， ，并避光保存于 -20℃。
100U(每步稀释不超过 10 倍)。在 96 孔细胞培养板中，做 3 倍系列稀释，共 8 个稀释度，每 个稀释度做 2 孔，每孔分别留 100μl 标准品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件 下进行。 测定法 TF-1 细胞株用完全培养液于 37℃、 5％二氧化碳条件下培养， 控制细胞浓度为 每 1ml 含 1.0× 105~5.0× 105 个细胞，传代后 24 小时用于生物学活性测定。将试验所用溶液预 温至 37℃。取足量 TF-1 细胞培养物，离心收集 TF-1 细胞，用基础培养液洗涤 3 次，然后 重悬于基础培养液配成每 1ml 含 6.0× 104 个细胞的细胞悬液，置于 37℃、5％二氧化碳条件 下备用。在加有标准品溶液和供试品溶液的 96 孔细胞培养板中每孔加入细胞悬液 100μl， 于 37℃、5％二氧化碳条件下培养 66～72 小时。每孔加入 MTS 溶液 20μl，于 37℃、5％二 氧化碳条件下培养 3 小时。以上操作在无菌条件下进行。放入酶标仪，以 550nm 为参比波 长，在波长 490nm 处测定吸光度，记录测定结果。 试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，并按下式计算结果： 供试品生物学活性（U/ml）=Pr×
Ds Es Dr Er
式中 Pr 为标准品生物学活性，U/ml； Ds 为供试品预稀释倍数； Dr 为标准品预稀释倍数； Es 为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数； Er 为标准品半效量的稀释倍数。
Hale Waihona Puke