WesternBlot实验详解(--)
WesternBlot详解（原理、分类、试剂、步骤及问题解答）
WesternBlot详解（原理、分类、试剂、步骤及问题解答）Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术:一、原理二、分类i.放射自显影ii.底物化学发光ECLECFiv.底物DAB呈色三、主要试剂四、主要步骤五、实验常见的问题指南1.参考书推荐2.针对样品的常见问题3.抗体4.滤纸、胶和膜的问题5.Marker的相关疑问6.染色的选择7.参照的疑问8.缓冲液配方的常见问题9.条件的摸索10.方法的介绍11.结果分析一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、分类现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP 标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
三、主要试剂1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
westernblot电泳原理及步骤
westernblot电泳原理及步骤一、概述西方印迹（w es te rnb l ot）是一种重要的蛋白质分析技术，广泛应用于分子生物学和生物化学研究中。
它通过将待检蛋白质进行SD S-P AG E电泳分离，再转移到聚合物膜上，利用特异性抗原与抗体结合的原理，检测目标蛋白质的存在与表达水平。
二、原理1.SD S-PA GE电泳分离-准备样品：将待检蛋白质样品加入去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合，使蛋白质变性和解聚。
-加载样品：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶（p ol ya cr yl am id eg e l）孔上。
-电泳分离：将准备好的凝胶置于电泳槽中，通电使蛋白质在凝胶中由负极向正极运动分离。
2.转膜-准备转膜装置：将P V DF或N C膜与吸水性纸张浸泡后，叠放在转膜装置中，并按压缩成一整体。
-预处理转膜：将转膜装置放入转渍缓冲液中浸泡，使其湿润。
-转移：将电泳完的凝胶与转膜装置层叠，加上固定层叠板，施加压力进行转膜。
3.免疫检测-封闭：将转膜后的膜置于封闭液中，阻断非特异性结合位点，减少背景信号。
-孵育：将膜与目标蛋白对应的一抗抗体孵育，使其与目标蛋白特异性结合。
-洗涤：用洗涤缓冲液洗去非特异性结合的抗体。
-二抗检测：将膜与与一抗相应的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，二抗与一抗结合形成复合物。
-显示：加入发色底物，与酶催化反应，生成可视化的蛋白质带谱。
三、操作步骤1.准备样品-将待检蛋白质样品加入适量去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合。
-完全溶解样品，可加热至95°C处理。
2.SD S-PA GE电泳分离-准备分离凝胶：根据目标蛋白质的分子量选择合适浓度的凝胶。
-加载样品：用自动吸管或微量注射器将样品均匀地加载到聚丙烯酰胺凝胶孔上。
-启动电泳：将准备好的凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，通电进行电泳。
3.转膜-准备转膜装置：按照转膜装置的说明书操作，准备好转膜膜和膜瓶。
-预处理转膜：将PVD F或N C膜与吸水性纸张浸泡，并放入转膜缓冲液中浸泡片刻。
Western Blot实验(蛋白质印迹法)
时间：2016-05-07
一：蛋白定量（实验前处理）
• 组织：到手的组织状态：冰袋快递：组织腐烂，蛋白含量减少 干冰快递：基本无影响 甲醛处理：石蜡包埋组织蛋白提取试剂盒 需用匀浆器，液氮等方法加入1*PBS充分研磨 裂解液量：组织（g）：裂解液（ml）=1:10 细胞：一般为细胞悬液实验前需确定细胞大概浓度 裂解液量： 107数量细胞加入1ml裂解液
五：封闭（过程）
• 丽春红染色漂洗完成后。 • 清洗干净的膜放入盛有5%BSA的容器中，室温 封闭60-90min，或者4度过夜。
• 5%BSA：秤取2gBSA
加40ml 1xPBS(或TBST)
六：一抗孵育（查询抗体）
决定二抗属性 条带大小
适用实验
一抗稀释比例
六：一抗孵育（过程）
• 封闭完成前，参照说明书将一抗用5%BSA稀释到足够实验 需求的量（无特殊要求，一抗稀释液用封闭液）。 • 封闭完成后，从膜上剪下宽度为1.5cm左右相应蛋白大小 条带，倒掉封闭液，加入稀释好的一抗溶液，摇床上平缓 摇动，室温孵育120min或4℃孵育过夜。 • 一抗孵育完成后，倒掉一抗溶液（有回收要求的抗体，回 收一抗溶液4℃保存），用TBST漂洗膜4次，第一次漂洗 主要漂洗BSA，冲刷后便可倒去，TBST可以加至膜漂浮在 液体中，每次10min。
• 分离胶
分离胶浓度 试剂 6% 分子量（kDa) 去离子水（ml） 30％丙烯酰胺（ml） 1.5MTris－HCl （PH8.8）（ml） 10％SDS（ml） 10％AP（ml） TEMED（ul） 总体积（ml） ≥94 5.3 2 2.5 0.1 0.1 0.008 8% 70-94 4.6 2.7 2.5 0.1 0.1 0.006 10% 55-70 4.0 3.3 2.5 0.1 0.1 0.004 12% 20-55 3.3 4.0 2.5 0.1 0.1 0.004 15% 10-20 2.3 5.0 2.5 0.1 0.1 0.004 18% ≤10 1.3 6.0 2.5 0.1 0.1 0.004
western blot 详解
原理：BCA(bicinchonininc acid二辛可宁酸)与二价铜 离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂，混合一起即成 为苹果绿，即BCA工作试剂。在碱性条件下，BCA与蛋 白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合 二个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复 合物，最大光吸收强度与蛋白质浓度成正比。
Cathode + 带有负电荷的蛋白质从上 到下运动（负极到正极）， 分开
四 转膜
准备物品：转移槽 黑红夹子 NC膜 滤纸 海绵垫 转
膜缓冲液 （1） 转一张膜需准备6张滤纸和1张NC膜。 切滤纸 和膜时一定要戴手套。将切好的NC膜和滤纸置于1X 转模缓冲液浸湿。 • 10X转膜缓冲液 甘氨酸（MW75.07） 151.1g Tris（MW121.14） 30.3g 蒸馏水至 1000ml 溶解后室温保存,用时稀释10倍，并加入甲醇至 20%
（2）夹子黑的一面：海绵-3张滤纸-胶-NC膜-3张滤纸海绵 ①将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵 垫。在垫子上垫三层滤纸，固定滤纸,擀去其中的气泡。 ②刮去玻璃板上的浓缩胶，小心剥下下层胶，用手调整 使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将NC膜盖于 胶上，要盖满整个胶并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除 去气泡。膜盖下后不可再移动。最后盖上另一个海绵垫， 擀几下就可合起夹子。
配胶方法同上，各种溶液加入到烧杯中，后 震荡。
灌浓缩胶：用1ml的移液枪将玻璃板中的剩余 空间灌满浓缩胶，灌胶时也要使胶沿玻璃板 流下以免胶中有气泡产生。将剩余空间灌满 浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。 灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气 泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。
冰箱过夜 待浓缩胶凝固后，取保险膜铺平于桌上，另取两张草 纸铺于保鲜膜上。用ddH2O浸湿草纸。取玻璃板放 于草纸上，包好。放入4℃冰箱过夜。
WesternBlot详解及问题分析
缓冲液PH
pH6.8TrisCl
pH8.8TrisCl
凝胶浓度
低，2-5%
高，根据蛋 白大小
电泳缓冲液：pH8.3 Tris-甘氨酸系统。
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灌制分离胶
隔绝空气
ddH2O 0.1%SDS:<8% 异丁醇：>8%
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灌制积层胶 插入梳子
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Staking gel Separating gel
原 • 膜没有因均匀浸湿
• 转膜前用100%甲醇将膜完 全浸湿
• 膜或者缓冲液污染 • 封闭不充分
• 拿取膜与吸水纸时要戴手
对
套，更换新鲜转膜缓冲液
• 抗体与封闭剂出现交 策 • 检测一抗、二抗与封闭剂
叉反应
是否有交叉反应
• 抗体浓度过高
• 杂交前检测一抗、二抗的
工作浓度
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杂交信号很弱
SDS-PAGE电泳
胶不平？ 凝胶漏液？
➢ 胶板洗刷干净 ➢ 加入AP和TEMED的量要合适 ➢ 加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部
分胶块聚合不均匀 ➢ 温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀 ➢ 两块玻璃板底部要对齐
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SDS-PAGE电泳
条带比正常的窄？ “微笑”或“倒微笑”
对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提 取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白
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蛋白样品的定量
➢ 目前常用比色法测定样品蛋白的含量：Bradford 法（考马斯亮蓝法）、Lowry法（Folin-酚试剂 法）、 BCA法等。但各有优缺点，大家可以根据 具体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说 明操作，测定样品浓度。
WesternBlot实验详解(--)
Western Blot 实验详解、实验材料Western Blot 相关试剂：甘氨酸，最后加入 200ml 甲醇。
4 C 保存。
文档收集自网络，仅用于个人学习30%储备胶：丙烯酰胺 Acr 29.0g 、亚甲双丙烯酰胺（Bis ） 1.0g ，混匀后加入去离子水37 C溶解，定容至100ml 。
4C 避光保存。
文档收集自网络，仅用于个人学习10%AP （过硫酸铵）：称取1gAP ，加入10ml 去离子水搅拌。
分装，-20C 保存。
Western BIot 相关仪器：电泳仪；转移仪；摇转仪。
二、实验原理经过 PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体 （例如硝酸纤维素薄膜） 上，固相载体 以非共价键形式吸附蛋白质， 且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载 体上的蛋白质或多肽作为抗原， 与对应的抗体起免疫反应， 再与酶或同位素标记的第二抗体 起反应， 经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
文档收集自网络，仅用于个人学习2X Sample Buffer : 1ml Glycerol （甘油）；0.5ml Beta mercaptoethanol （B -巯基乙醇）；3ml 10%SDS; 1。
25ml 4 X Upper buffer; 4.25ml dH 2O; Add bromop he nol blue （溴酚蓝）to color 。
文档收集自网络，仅用于个人学习10X 电泳缓冲液（pH 8.3 ）:在1L 大烧杯中加入800ml 去离子水，称取 Tris 30.2g 、甘氨酸 188g ，混匀，加入100ml 10%SDS ，定容至1L 。
（注：SDS 在68C 水浴中溶解）。
工作液：1 X 电泳缓冲液 去离子水稀释 室温保存。
文档收集自网络，仅用于个人学习1.5M Tris-HCl （pH8.8） : Tris 181。
Western blot(蛋白印迹法)详细步骤
Western blot（蛋白印迹法）详细步骤一、组织的研磨准备：研钵、研磨棒、EP管、药匙、液氮、液氮匙、自封袋、一次性手套、棉手套步骤：①用研磨棒将装有冻存组织的EP管敲碎，取出组织，在研钵中盛满液氮，用力敲碎组织，研磨。
②研磨过程中一旦液氮干了，立即加入液氮，保持研磨在液氮中进行，直至组织呈干粉状。
③用在液氮中浸泡过的药匙将研磨好的粉末盛入新的EP管中。
④装有组织粉末的EP管现在液氮中保存，待所有组织都研磨结束后装入自封袋，于-80℃保存。
注意：1.研钵使用前要用锡纸包口、研磨棒用锡纸包头，在烘箱中烘烤180℃至少3h 以上。
2.组织研磨成粉末后待液氮全部挥发后再将组织粉末装管。
3.每种样品都最好留有副管，备用。
二、裂解提蛋白准备：裂解液配制比例RIPA:PMSF=1000：10=100：1若需要加入蛋白酶抑制剂，则比例一般为1:1000（即1ml裂解液加1μl蛋白酶抑制剂）步骤：①将RIPA和PMSF按比例混匀，加入到装有组织粉末的EP管中，一般加入300~500μl左右（浓度尽量高点）。
②盖好盖子，在冰上裂解30~40min.③到时间后于4℃，12000rpm离心10min，取上清液转移到新的离心管中，于-20℃保存。
注意：1.裂解液加入后用手指弹一下混匀，当加入量很少时，成粘稠状，有必要时应用枪头混匀。
三、BCA法测定蛋白浓度（BCA试剂盒）准备：BCA试剂盒（BCA试剂A、BCA试剂B、蛋白标准液）、酶标板、酶标仪、摇床步骤：①按1:15或1:30稀释待测样品，即取1μl样品+14μl水。
③按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）根据样品数量配制BCA工作液。
④每个标准品孔加入200μl BCA工作液，样品孔加入待测样品10μl和200μlBCA工作液，充分混匀，在摇床上震荡30s，37℃放置30min，于492nm下测定OD值。
⑤标准曲线以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，根据样品的吸光度可以在标准曲线上查得相应的蛋白含量。
Western Blot 实验步骤及注意事项
Western Blot 实验步骤及注意事项western blot的实验步骤及注意事项一、实验步骤1.缓冲液配制(1) Transfor Buffer: 2.9g Glycine, 5.8gTris, 0.37g SDS（可不加）, 200ml Methanol（临用前加）,ddH2O to 1L(2)10×TBS: 1 M Tris・HCl（pH 7.5）100 mL, 88 g NaCl, ddH2O to 1L (3)TBST: 1×TBS中加入1/1000的Tween (4)封闭液：脱脂奶粉5%(w/v),用TBST配制 2. SDS-PAGE电泳电压：积层胶电泳电压80V左右，分离胶电泳电压110V~120V 3.免疫印迹(1) SDS 聚丙烯酞胺凝胶电泳结束后，将胶放至转移缓冲液中浸泡15m in，切6张Whatman 3mm滤纸和1张PVDF膜，与凝胶大小相符合。
将PVDF膜事先用甲醇浸泡，再用转移缓冲液浸泡。
(2) 将凝胶及PVDF膜以“三明治”状(即3层滤纸、凝胶、PVDF膜、3层滤纸)逐层铺于转印仪上，凝胶一面连接阴极，100 V转移40 min（根据转移蛋白的分子量确定转移时间）。
(3) 将膜放入小盒中，加入5 mL封闭液，摇床上温育1 h。
(4) 以1/1000的比例，加入5 μL第一抗体，4 ℃温育过夜。
(5) TBST溶液洗膜10 min，轻倒，重复3次。
(6)加入 5 mL TBST溶液，以1/2000的比例，加入2.5 μL第二抗体，温育1 h。
(7) TBST溶液洗膜5min，轻倒，重复3次。
(8)加入2 mL显色底物温育3 min，将薄膜封入保鲜袋中，压平，尽可能不留空气，滤纸吸干显色底物。
放入夹板中。
(9)配制显影液和定影液。
暗室操作：将X光片放入夹板中，曝光5 s（根据荧光强度确定），然后放入显影液中，至出现明显的条带取出，水洗后放入定影液中，定影一段时间，取出用水冲洗干净。
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Western Blot实验详解
一、实验材料
Western Blot相关试剂：
2×Sample Buffer：1ml Glycerol（甘油）;0.5ml Beta mercaptoethanol（β-巯基乙醇）; 3ml 10%SDS; 1。
25ml 4×Upper buffer; 4.25ml dH2O; Add bromophenol blue （溴酚蓝）to color。
10×电泳缓冲液（pH 8.3）：在1L大烧杯中加入800ml去离子水，称取Tris 30.2g、甘氨酸188g，混匀，加入100ml 10%SDS，定容至1L。
（注：SDS在68℃水浴中溶解）。
工作液：1×电泳缓冲液去离子水稀释室温保存。
1.5M Tris-HCl(pH8.8)：Tris 181。
7g去离子水溶解，用浓盐酸调至pH8.8，定容至1L 室温保存。
1M Tris-HCl(pH6.8)：Tris 121.1g去离子水溶解，用浓盐酸调至pH7.5，定容至1L 室温保存。
10×TS(洗膜液)：在800ml去离子水，加入Nacl 90g，1M Tris-HCl(pH7.5) 100ml，去离子水定容至1L。
工作液：1×TS 室温保存。
1M Tris-HCl(pH7.5)：Tris 121.1g去离子水溶解，用浓盐酸调至pH7.5，定容至1L 室温保存。
10%SDS：称取十二烷基磺酸钠（SDS）10g，加入约80ml去离子水，68℃加热溶解。
用10%HCl 调pH至7.2，定容至100ml。
1×Transfer Buffer：在1L大烧杯中加入800ml去离子水，加入3.03g Trisgrams，14.43g 甘氨酸，最后加入200ml甲醇。
4℃保存。
30%储备胶：丙烯酰胺Acr 29.0g、亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加入去离子水37℃溶解，定容至100ml。
4℃避光保存。
10%AP（过硫酸铵）：称取1gAP，加入10ml去离子水搅拌。
分装，-20℃保存。
Western Blot相关仪器：
电泳仪；转移仪；摇转仪。
二、实验原理
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
三、操作程序与结果判定
操作程序：
（一）蛋白样制备
1.无双抗DMEM（10%血清）接皿，代细胞长至80%时，细胞转染，6h后换含双抗DMEM
（10%血清），再过22h后处理细胞。
2.吸出培养液，用PBS洗1-2次。
3.每个皿（60mm）加入200-300ul细胞裂解液，摇均匀，刮细胞。
(最好处理完一个样品
后再处理另外的样品，不要同时处理)
4。
用一次性1ml针筒吸出裂解的细胞液，注入1.5ml离心管中，用针筒吸打至清亮。
5。
取80ul 2×Sample Buffer混匀，37度30min，沸水10min，1200rpm 10min 取上清，冰浴，上样，剩余样品-20度储存。
（二）SDS-PAGE
1.制备分离胶5ml加入组装好的玻璃板中，立即水封。
（一般配10%分离胶）
2.待两液相出现折线，胶凝后将水倒出，加入制备的浓缩胶3ml插入梳子，待凝固。
3.胶凝后拔出梳子，将玻璃板转过来，加入电泳缓冲液。
4.用针筒吹净每个孔。
5.上样，通电电泳：浓缩胶电压90V（约30min）分离胶120V（约90min）。
（三）转膜（湿转）(100KD以上)，小的蛋白片段建议半干转膜。
1.海绵，滤纸在转膜液中浸泡，PVDF膜在甲醇中浸泡2min。
2.在玻璃板上铺海绵，五层滤纸，用玻璃棒赶走气泡，将电泳后的胶轻放在滤纸上，玻璃
棒赶走气泡，贴上PVDF膜，再铺上五层滤纸及海绵，玻璃棒赶走气泡。
将其整体转移到转膜夹上。
3.12V电压下转膜过夜，在其四周放上冰袋。
注意：方向应为：阴极-海绵-五层滤纸-胶-PVDF膜-五层滤纸-海绵-阳极
（四）封膜
1.配制封膜液，在20ml 1×TBST中加入1g脱脂奶粉（一块膜的用量），充分混匀倒入保
鲜盒中。
2.将膜用镊子夹出平铺在封闭液中，蛋白面朝下。
3.摇床上摇2h。
（五）一抗
把膜从封闭液中夹出剪去边缘，平铺入一抗溶液中，蛋白面朝下，摇床上摇4h。
（六）二抗
1.将一抗回收，放入-20度冰箱中。
2.在保鲜盒内加入8ml 1×TBST摇床10min 3次。
3.倒掉冲洗液，加入二抗溶液（8ml），摇床2h。
（六）洗膜，显影，定影
1.将二抗回收，放入-20度冰箱中。
在保鲜盒内加入8ml 1×TBST摇床10min 3次。
2.将A、B液按1：1配制，在一试管中各加400ul的A液和B液。
注明：ECL A、B液最好选用Pierce公司的Super Signal West Pico，国产可选用碧云天的。
3.在工作台上铺好保鲜膜，在保鲜膜上滴一小滴ECL混合液，将洗好的膜放上，在膜上
滴ECL混合液，盖上保鲜膜，确定无气泡。
4.关灯，黑暗中拿出胶片，折起一角，放在膜上，压膜（压膜必须带手套，且不能有水，
否则会有非特异性黑斑，压膜时间越长，条带越浓）。
5.将压好的膜放入显影液中在红光下观察膜片上的条带。
6.用水冲洗，放入定影液中定影，用水冲洗，晾干。
结果判定
四、注意事项
1.免疫印迹杂交的敏感与检测系统有关。
因此,凝胶电泳时的蛋白上样量应该保证被检测抗
原量不至于太低，如果过低应该重新纯化和浓缩使用，或者建议做一次梯度稀释。
2.形成凝胶的试剂要有足够的纯度,激活剂的浓度适当，不仅可以决定凝胶聚合的速度,也
将影响凝胶的质量,聚胶时的温度也将影响凝胶聚合的速度。
因此，建议要根据不同温度
下适量增减激活剂的用量以保证分离胶从加入激活剂起至开始出现凝胶凝聚的时间为15-20分钟最佳,对于浓缩胶最佳聚合时间为8-10分钟开始可见聚合。
灌完分离胶加水封闭分离胶与外界氧气的结合。
3.未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性,操作时应该戴手套口罩防护。
梳子插入浓缩胶时，应确
保没有气泡，可将梳子稍微倾斜插入以减少气泡的产生，梳子拔出来时应该小心,不要破坏加样孔，如有加样孔上的凝胶歪斜可用针头插入加样孔中纠正但要避免针头刺入胶内。
4.加样前样品应先离心，尤其是长时间放置的样品,以减少蛋白质带的拖尾现象。
5.为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液。
6.上样时，小心不要使样品溢出而污染相临加样孔。
7.样品缓冲液中煮沸的样品可在-20℃存放数月，但是反复冻融会使蛋白质降解。
8.为减少蛋白质条带的扩散,上样后应尽快进行电泳，电泳结束后也应尽快转印。
9.取出凝胶后应注意分清上下，可用刀片切去凝胶的一角作为标记(如左上角)转膜时也应
用同样的方法对PDVF膜做上标记(如左上角)以分清正反面和上下关系。
10.转膜时应依次放好PDVF膜与凝胶所对应的电极,即凝胶对应负极,PDVF膜对应正极。