His蛋白纯化原理、方法和问题分析
His标签蛋白纯化全攻略
His标签蛋白纯化全攻略作为重组蛋白构建过程中最常用的标签，相信奋战在实验室中的小伙伴对His标签并不陌生。
His标签可通过Ni2+柱进行简单有效的纯化，不过纯化容易想要纯化好却并不那么容易。
爱纯派助力His标签纯化，马上为大家送上His标签纯化全攻略。
His标签蛋白的纯化原理组氨酸（His）的残基上带有1个咪唑基团，可以和Ni2+、Co2+等过渡金属离子形成配位键而选择性的结合在金属离子上，这些金属离子能够用鳌合配体固定在层析介质上，因此带有组氨酸标签的蛋白在经过装配了金属离子的层析介质时可以选择性的结合在介质上，而其他的杂质蛋白则不能结合或仅能微弱结合。
结合在介质上的His标签蛋白可以通过提高缓冲液中的咪唑浓度进行竞争性洗脱，从而得到较高纯度的His标签蛋白。
His标签蛋白纯化说起来简单做起来难。
小编也常常收到小伙伴们类似于“His标签重组蛋白Ni2+柱纯化后纯度不够”、“His标签蛋白挂不到Ni2+柱上”等等之类的抱怨。
其实呢，不怕做不到，就怕没想到。
His标签蛋白纯化是有很大的优化空间哦~His标签纯化优化策略His标签蛋白纯化的所有优化策略都是基于改变标签蛋白和金属离子之间配位结合作用力的强弱，而这种作用力主要和一下因素相关：1）标签长度及暴露程度：最常用的His标签时6个重复的组氨酸，但在实际操作过程中，根据实际情况可控制组氨酸的数目从四到十个不等。
较短的标签与金属离子的结合更弱，较长的标签与金属离子的结合更强；而标签的暴露程度也很容易理解，金属离子只能和蛋白表面的His结合，所以His标签暴露程度越高，结合能力越强。
2）金属离子半径：除最常用的Ni2+以外，但Cu2+、Zn2+、Co2+等金属离子都可用于His标签蛋白的纯化，不同金属离子区别在于离子半径不同，离子半径越小，与His的结合能力也就越强。
几种常用金属离子和His的结合能力为：Cu2+〉Zn2+〉Ni2+〉Co2+。
3）缓冲液条件：His标签蛋白在中性或弱碱性pH值（pH 7到8）环境下显现出比在酸性条件下与金属离子更强的结合能力。
His-Tag 表达蛋白纯化原理
His-Tag 表达蛋白纯化原理组氨酸标签蛋白的纯化His-Tag融合蛋白是目前最常见的表达方式，而且很成熟，它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性，无论是表达的蛋白是可溶性的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱去（IMAC）纯化。
2．1 IMAC(Immobilized Metal-ion affinity chromatography)是Porath etal.1975年用固定IDA作为配基的填料螯合过渡金属铜、镍、钴或锌离子，可以吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白，1987年Smith et al. 发现带有几个组氨酸或色氨酸小肽和螯合金属离子的IDA-sephadexG-25作用力更强，此前在1986年他和他的合作者用Ni2+-IDA-sephadexG-25亲和纯化在氨基端带组氨酸和色氨酸的胰岛素原。
同年1987年Hochuli etal.发现带有相连组氨酸的多肽和Ni2+-NTA填料作用力更强于普通的肽，1988年他第一次用这样的方法纯化了带六个组氨酸标签的多肽，无论是在天然还是变性条件下一次亲和纯化都得到很好效果，此后表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC变得非常普遍，相对而言，不带标签的蛋白纯化就非常困难，所以表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC纯化变成最常用而且最有效的研究蛋白结构和功能的有力手段。
1986年Porath etal.还发现Fe3+-IDA-sephadexG-25可以用于磷酸化蛋白的纯化，而后发现Ga3+-IDA也有同样的效果，这样螯合这两种金属离子的填料就有效用于磷酸化多肽的富集和纯化，同时IMAC也可以用于纯化各种和金属离子结合的多肽，应用非常广泛。
市面常见的商品化IMAC用于带六个组氨酸标签蛋白的配基有以下几种：2.2影响IMAC纯化结果的因素：2.2.1填料的种类：不同填料厂家的填料有差别，所以使用过程最好能得到厂家的技术支持，因为不同的厂家填料不同，此外蛋白纯化个性很强，没有哪一个填料是能适合所有带六个组氨酸标签蛋白的纯化，载量高和特异性好本身就是矛盾。
His-GFP蛋白的纯化步骤
以His-GFP为例简述His-tag蛋白的纯化His-tag是重组蛋白中最常用的融合标签之一。
使用镍柱纯化His-tag融合蛋白的原理为：组氨酸的咪唑侧链可亲和结合镍、锌和钴等金属离子，在中性和弱碱性条件下带组氨酸标签的目的蛋白与镍柱结合，在低pH下用咪唑竞争洗脱。
实验中一般选用6个组氨酸（His6-tag）的标签。
His6标签有许多优点：（1）由于只有6个氨基酸，分子量很小，对蛋白结构和活性的影响较小，一般不需要酶切去除；（2）可以在变性条件下纯化蛋白，在高浓度的尿素和胍中仍能保持结合力；（3）His6标签无免疫原性，重组蛋白可直接用来注射动物，也不影响免疫学分析。
His6标签也有一些不足，如目的蛋白易形成包涵体、难以溶解、稳定性差及错误折叠等。
镍柱纯化时金属镍离子容易脱落，混入蛋白溶液，不但会通过氧化破坏目的蛋白的氨基酸侧链，而且柱子也会非特异吸附蛋白质，影响纯化效果。
本实验将以His-GFP（绿色荧光蛋白）为例，阐述His-tag蛋白的纯化过程。
1. E. coli重组菌体破碎表达完成的E. coli重组菌体，经超声或细胞破碎仪进行破碎。
当需要破碎的细胞沉淀较少（＜1 g）时，通常在Eppendorf管中，用超声法完成细胞裂解。
而当细胞沉淀较多时，可选用细胞破碎仪进行破碎。
本实验采用细胞破碎仪法。
细胞破碎仪法：称量细胞沉淀的湿重，加入细胞湿重10倍体积的裂解缓冲液。
如，1 g细胞沉淀加入约10 ml的裂解缓冲液，使得细胞在溶液中的终浓度为10-15%，在此范围内细胞破碎的效果较好。
过浓或过稀的细胞浓度均不利于破碎效率。
裂解缓冲液的组成如下：Lysis buffer：20 mM Tris-HCl, pH 7.4100 mM NaCl10 mM imidazole0.1% Triton X-1001 × protease inhibitor将细胞沉淀在裂解buffer中充分搅拌至没有结块后，进行高压破碎。
His融合蛋白纯化中常见问题解答集锦
His融合蛋白纯化中常见问题解答集锦His-tag是专门设计用于重组蛋白质的纯化，与其他标签相比有很多明显优势，是目前用于纯化的融合标签中使用最为广泛的一种。
Tag虽然简单，但是做过的人都知道，融合蛋白的纯化并非简单。
纯化介质有10多种，应该如何选择？洗脱的标签蛋白杂带较多是什么原因？如何优化？甚至洗脱产物中没有目标蛋白原因为何？策略如何？GE蛋白质纯化专家就His-Tag融合蛋白在纯化过程中常常遇到的问题进行解答，不容错过！对于HIS标签蛋白纯化的产品，如何选择？我公司为纯化组氨酸标记的蛋白质提供了全面的解决方案，产品种类丰富应用广泛(见图1)，下面一一介绍其特点和应用。
图1 His产品的选择Ni Sepharose High Performance用于高分辨率纯化的预带电荷的介质Ni Sepharose High Performance，通过耦联Ni使介质预带电荷，使用非常方便。
和其它厂家的同类产品比较，它具有高载量和低的Ni脱落的特点，低的镍脱落保证的HIS-标记的蛋白质在多次重复的纯化中保持可靠的载量。
同时Ni Sepharose High Performance填料的颗粒大小只有34um，具备最高的分辨率和最低的样品稀释。
Ni Sepharose High Performance除了有散装填料形式，也具有HISTrap1Ml和5Ml的实验室预装柱,可以连接AKTA仪器，蠕动本以及手动注射器操作,使用非常方便。
His MultiTrap HP 96孔过滤板用于高通量筛选和多样品的平行纯化，预装了Ni Sepharose High Performance的填料，未澄清的细胞裂解液可以直接上样，具有高重复性，操作简单方便快捷的特点。
His SpinTrap柱用于少量的蛋白质制备，预装了100ul的HP填料，可以直接上澄清和未澄清的样品，可用于细菌细胞裂解液的筛选和优化纯化条件，与标准离心机使用，一次纯化仅需10分钟。
个人经验总结 His Taq镍柱纯化常见问题分析解决(FAQ)
镍柱纯化常见问题及分析1:通过His标签纯化的蛋白，杂带比较多，如何改进？（1）如果纯化的是上清，蛋白酶会部分降解目的蛋白，可通过加多种入蛋白酶抑制剂改进。
（2）可提高杂蛋白与镍柱结合起始咪唑浓度，以降低杂蛋白与镍柱的亲和力。
（3）杂蛋白和目的蛋白结合，可通过超声前加入去垢剂的方式消除(1%-2%Tritonx-100)。
2:镍柱使用中出现棕色是怎么回事?(1)出现这样的情况，主要是缓冲液中DTT的影响，DTT会对镍柱的颜色和纯化效率有很大的影响,在碱性的缓冲液条件下，镍离子会被DTT还原生成棕色的沉淀，所以所有镍柱的生产商都强调要尽量避免DTT的参与（一般的镍柱耐受小于5mM DTT,推荐缓冲液中不要超过2mM DTT）。
3:柱子堵了，怎么办？（1）柱子发生堵塞，可能是样品中细胞碎片或其他杂颗粒所致，所以样品一定要高速离心。
（2）上清纯化时，蛋白发生变性，有絮状物产生，赶紧加入1-2mM DTT(上清样品处理要在冰浴中进行)，还不行加尿素变性，使其在变形环境下。
（3）样品处理时的料液比不要太小，否则黏度大，或者导致蛋白析出或变性，料液比要在1/10-1/15之间较适宜。
4：纯化过程中，蛋白出现了浑浊，怎么办？（1）出现浑浊，说明蛋白处在不稳定的环境中或者自身就不稳定，所以要检查缓冲体系是否正确，环境是否低温，或在缓冲液中加入还原剂DTT。
（2）加入肌氨酸钠，迅速使蛋白变性，消除浑浊现象。
5：没能纯化到带His标签的蛋白，蛋白都流穿了（未挂柱）？（1）超声的功率不对(太大，蛋白炭化，太小，蛋白没有释放)策略：改变超声功率，并在超声前加入溶菌酶。
（2）样品或者是结合缓冲液不正确：策略：检测pH及样品和结合缓冲液的组成份（EDTA 等）。
确保在溶液中鳌合剂或强还原剂的浓度及起始咪唑的浓度不是太高。
（3）组氨酸的标签没有完全的暴露策略：在变性条件下(用8M脲，6M盐酸胍,1%SDS)并加入1-2mMDTT进行纯化。
蛋白纯化常见问题：His标签
蛋白纯化常见问题：His标签1、常用的His标签蛋白纯化填料，Ni Sepharose 6FF和Ni Sepharose HP有什么区别，应该如何选？答：HP：High Performance，高性能，填料平均颗粒大小约34 μm，颗粒细能带来高分辨率的分离纯化。
HP 纯化后峰更窄，样品浓度高，节省了浓缩步骤的时间，但会带来更高的反压，因此流速更慢。
FF：Fast Flow，快流速，填料平均颗粒大小约90 μm，较 HP 颗粒粗，流速快，具有良好的分辨率及轻松实现规模扩大的分离纯化，同样适用于重力流下的蛋白纯化和多孔板筛选。
2、HisTrap FF Crude 和 HisTrap excel 的特点是什么？应该如何选择？答：HisTrap FF Crude 的滤膜孔径更大，裂解液无需离心过滤处理，可以直接上样，适合样品不稳定或者比较粘稠容易造成柱子堵塞的料液。
例如如果纯化包涵体蛋白较多时，可以优先考虑FF Crude （预装柱）或 FF。
HisTrap excel 最大的特点是镍脱落极低，且能耐受100 mM EDTA，特别适合真核外泌蛋白（如培养基中含有螯合剂）。
无需脱镍，即可直接使用 NaOH 清洗，防止交叉污染且有更长的使用寿命。
3、 His 标签蛋白纯化实验中，常用的缓冲液成分是什么？答：建议缓冲溶液成分如下· 结合缓冲溶液：FF、 HP系列： 20mM磷酸钠缓冲溶液， 500mM NaCl(避免非特异电荷吸附)，20-50mM 咪唑(提高浓度，可以增加纯度但会降低收率)， pH7.4 (可以根据实际情况调节pH)。
Talon 系列：20mM 磷酸钠缓冲溶液，500mM NaCl，10-20mM咪唑， pH7.4。
Excel 系列： 20mM 磷酸钠缓冲溶液， 500mM NaCl， pH7.4 (结合缓冲液中一般不添加咪唑，在wash缓冲液中可根据样品性质加入 0-30 mM 咪唑)· 洗脱缓冲溶液：20mM 磷酸钠缓冲溶液，500mM NaCl，500mM 咪唑，pH 7.44、纯化得到的组分中没有或很少目的 His 标签蛋白，怎么回事？答：若目的His 标签蛋白正常表达（使用抗His 标签的抗体进行WB 检测）且充分释放至上清中，确认蛋白是流穿还是未被洗脱：若 His 标签蛋白流穿：· 样品或结合缓冲液的条件不合适，注意螯合剂或强还原剂以及咪唑的浓度。
纯化his标签蛋白的镍柱填料
纯化his标签蛋白的镍柱填料如何纯化His标签蛋白的镍柱填料。
第一部分：理论知识介绍（8001000字）1.1 His标签蛋白的定义和性质His标签是通过基因工程技术将610个连续的组氨酸残基（His）插入到目标蛋白的其中一段序列中，以便后续纯化和检测。
His标签蛋白具有一些独特的性质，如易表达、易纯化和高亲和力等。
1.2 镍柱填料的原理和应用镍柱填料是常用的His标签蛋白纯化材料之一，它利用镍离子与His标签之间的特异性亲和力来实现纯化。
填料的主要成分是硅胶固相材料，通过将镍离子与其配位，形成一种特定的亲和柱填料。
1.3 纯化His标签蛋白的步骤纯化His标签蛋白的基本步骤包括样品处理、柱子平衡、负载和结合蛋白、洗脱、再平衡等。
其中，填料的选择和操作条件的优化对纯化的效果起着关键作用。
第二部分：实验方法介绍（20004000字）2.1 镍柱填料的选择和预处理在实验开始之前，我们需要选择合适的镍柱填料。
可以从商业供应商购买预包装的填料，也可以选择自包装的填料。
并且，填料在使用之前需要进行预处理，如清洗和等离子改性处理。
2.2 样品处理和柱子平衡将待纯化的His标签蛋白样品进行必要的处理，如去除杂质和浓缩。
然后将样品废液进行平衡柱中，以保证柱子在纯化过程中的流动性和亲和性。
2.3 His标签蛋白负载和结合通过将样品溶液添加到镍柱中，利用His标签与镍离子之间的亲和力，使His标签蛋白能够与填料结合。
在此步骤中，控制pH值、盐浓度和蛋白负载量等因素十分重要。
2.4 洗脱和再平衡在结合蛋白后，通过逐渐提高洗脱缓冲液的镍离子浓度或改变pH值，使结合的His标签蛋白从填料中洗脱出来。
最后，再平衡填料以便下一次的使用。
第三部分：常见问题及解决方法（2001000字）3.1 His标签蛋白不结合或结合不牢固可能是因为填料的质量或预处理步骤不当，可以尝试更换填料或者重复预处理步骤。
3.2 His标签蛋白洗脱不完全可以尝试调整洗脱缓冲液的镍离子浓度、pH值或者增加洗脱缓冲液的体积。
蛋白纯化相关原理及方法
蛋白纯化相关原理及方法蛋白纯化是生物科学研究中常用的一项技术，它可以分离纯化出目标蛋白质，从而方便后续的研究和应用。
本文将介绍蛋白纯化的原理和方法。
一、蛋白纯化的原理蛋白纯化的原理是基于不同蛋白质的特性差异，通过采用不同的分离技术，将目标蛋白质从复杂的混合物中分离出来，并且使其达到纯度较高的状态。
蛋白质的特性差异主要包括以下几个方面：1. 分子质量：蛋白质的分子质量不同，可以通过分子大小的差异进行分离。
常用的方法包括凝胶过滤层析和超速离心。
2. 电荷性质：蛋白质具有不同的电荷性质，可以通过离子交换层析、电泳等方法进行分离。
离子交换层析是利用蛋白质与固定在固相上的离子交换基团之间的相互作用进行分离。
3. 亲和性：蛋白质与其他分子之间可能存在特异的结合，可以通过亲和层析进行分离。
亲和层析是利用蛋白质与特定配体之间的结合进行分离。
4. 疏水性：蛋白质的疏水性不同，可以通过逆向相层析等方法进行分离。
逆向相层析是利用溶剂的极性进行分离，疏水性较高的蛋白质会更早洗脱。
二、蛋白纯化的方法1. 直接纯化法：直接从生物样品中纯化目标蛋白质，可以通过分离离心、沉淀和过滤等简单的操作步骤进行。
这种方法适用于目标蛋白质含量较高的样品。
2. 柱层析法：柱层析是一种常用的蛋白纯化方法，可以根据目标蛋白质的特性选择不同的层析柱进行分离。
常用的柱层析方法包括凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。
3. 电泳法：电泳是利用蛋白质的电荷性质进行分离的方法，常用的电泳方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和等电聚焦电泳（IEF）等。
4. 超滤法：超滤是利用膜的孔径大小对蛋白质进行分离的方法，常用的超滤方法包括凝胶过滤和离心浓缩等。
5. 亲和纯化法：亲和纯化是利用蛋白质与特定配体之间的结合进行分离的方法，常用的亲和纯化方法包括亲和层析、亲和吸附、亲和沉淀等。
6. 水相两相法：水相两相法是利用两相体系的差异进行蛋白质的分离，常用的方法包括聚乙二醇硫酸铵法和聚乙二醇聚丙烯酰胺法等。
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组氨酸(His)标签蛋白的纯化
His-Tag融合蛋白是目前最常见的表达方式，而且很成熟，它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性，无论是表达的蛋白是可溶性的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱（IMAC）纯化。
IMAC(Immobilized Metal-ion affinity chromatography)是Porath et al.1975年用固定IDA作为配基的填料螯合过渡金属铜、镍、钴或锌离子，可以吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白，1987年Smith et al. 发现带有几个组氨酸或色氨酸小肽和螯合金属离子的IDA-sephadex G-25作用力更强，此前在1986年他和他的合作者用Ni2+-IDA-sephadex G-25亲和纯化在氨基端带组氨酸和色氨酸的胰岛素原。
同年1987年Hochuli et al.发现带有相连组氨酸的多肽和Ni2+-NTA填料作用力更强于普通的肽，1988年他第一次用这样的方法纯化了带六个组氨酸标签的多肽，无论是在天然还是变性条件下一次亲和纯化都得到很好效果，此后表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC变得非常普遍，相对而言，不带标签的蛋白纯化就非常困难，所以表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC纯化变成最常用而且最有效的研究蛋白结构和功能的有力手段。
1986年Porath et al.还发现Fe3+-IDA-sephadex G-25可以用于磷酸化蛋白的纯化，而后发现Ga3+-IDA也有同样的效果，这样螯合这两种金属离子的填料就有效用于磷酸化多肽的富集和纯化，同时IMAC也可以用于纯化各种和金属离子结合的多肽，应用非常广泛。
Ni柱中的氯化镍可以与有HIs（组蛋白）标签的蛋白结合，也可以与咪唑结合。
步骤是：过柱子前可以选择Ni柱重生，也就是往柱子里倒氯化镍，一个柱长体积就行了，然后平衡柱子，拿你自己的buffer，给蛋白提供最适的环境，我一般平衡4个柱长，然后蛋白上样，你可以让他自己挂，这样挂柱子的效果好一些，如果流速太慢，可以加个恒流泵，但是一定不能太快，太快挂柱效果差，当然你也可以选择循环挂柱，就是恒流泵的一头接你装蛋白的烧杯，从柱子中留下来的液体还用同一个烧杯接回去。
挂完之后，按理想来讲，你的蛋白在Ni柱中与Ni就结合了，杂蛋白多数在烧杯里，留下来了，当然肯定有少量杂蛋白也挂上了，这时候你要梯度洗脱，拿咪唑和你的buffer配，一般从0 20mM 40mM。
100mM这样洗脱（当你不知道你的蛋白大概在什么时候出来的时候）我指的是咪唑的终浓度。
咪唑加入之后，会和蛋白争夺与Ni的结合位点，杂蛋白、你的目的蛋白，会在不同的浓度被洗脱下来，洗完之后，你可以用400mM咪唑洗柱子，清理一切蛋白，然后平衡几次，是否选择重生你自己定咯~然后放上20%乙醇保存柱子就可以咯~过的蛋白用不同的管子收下，然后SDS-page检测在哪个管子里。
市面常见的商品化IMAC用于带六个组氨酸标签蛋白的配基有以下几种：
一、组氨酸(His)标签蛋白的纯化步骤：
大肠杆菌的破碎方法：
1）收集培养发酵液，4度7000-8000g离心10分钟，收集沉淀的菌体(如果不是马上破碎可以放-70度冷冻，但是最好能保存成小块或者薄片，这样好用。
)
2）取1-2克菌体加10ml破碎缓冲液（pH7.4的50mM磷酸缓冲液含0.5M NaCl，0.5mg/ml溶菌酶，1mM PMSF，1mM MgCl2，1.7units/ml Benzonase,其中的菌酶，1mM PMSF，1.7units/ml Benzonase现加）在冰上混合45分钟，如果pH不在7-8，需要用0.5M NaOH一边搅拌一边滴加.如果溶菌酶10mg/ml混合时间可以缩短到
10分钟.
3）把混合菌体在冰水中用超声探头破碎20秒种,总共四次,中间间隔要保持2分钟冷却破碎液,检测pH,如果不在7-8,还是用0.5M NaOH一边搅拌一边滴加去调.如果菌体的为50-500克,可以高压破碎的方法,缓冲液同上,体积为1升,破碎三次,压力为800 bar.
4）破碎的液4度12000g离心10分钟，如果要让溶液更澄清，可以4度50000g 离心30分钟，这时候可以把上清和沉淀分别留样，跑电泳，如果只沉淀中有目标蛋白，那就用变性条件下去提取。
1.大肠杆菌的破碎离心的上清加2M咪唑溶液0.12ml使终浓度为20mM，样品的总体积为10ml。
2.过柱子的样品最好过0.45μm的滤膜，避免堵柱。
3.可溶性蛋白的纯化：
1）平衡缓冲液：pH7.4的50mM磷酸缓冲液含0.5M NaCl，含20mM咪唑。
2）洗脱缓冲液：pH7.4的50mM磷酸缓冲液含0.5M NaCl，含500mM咪唑。
3）取1ml镍琼脂糖凝胶FF或镍NTA琼脂糖凝胶FF预装柱，用10ml平衡缓冲液平衡，然后取破碎上清10ml样品以0.5ml/min上样，然后2ml/管分管收集。
4）用15ml平衡缓冲液洗去未吸附的样品，流速1-2ml/min，2ml/管收集。
5）用5 ml洗脱缓冲液洗去未吸附的样品，流速1-2ml/min，2ml/管收集。
6）再用5ml平衡缓冲液平衡柱子，灌满20%乙醇，封闭，以备下次使用。
7）此方法是通用的方法，但是未必能得到适合自己蛋白的满意效果，所以优化的办法是洗脱可以用50mM，100mM，300mM，500mM分阶段洗脱，各洗脱5个柱体积，这样配合电泳检测，得到适合自己的蛋白的条件。
8）收集的部分可以用紫外分光光度法、BCA法或用考玛斯亮蓝法测定蛋白的浓度，再取有蛋白的部分电泳检测纯度。
二、常见问题及解决方法
1.不溶解或沉淀在柱子上：要留意缓冲液体的pH，此外在样品中添加一些表面活性剂甚至乙醇等有机溶剂可以增加疏水性蛋白的溶解度，对于带半胱氨酸多的蛋白很容易氧化聚集沉淀，所以需要加2-5mM巯基乙醇避免沉淀。
2.白不吸附：这是最常见的，通常的原因有：1是标签不暴露，被折叠在蛋白的结构内，可以在变性的条件下去纯化，如果用脲变性吸附不好，可以改用盐酸胍，个人经验是这样通常可以使吸附不上的蛋白得到改善，顺利纯化。
2可以选择作用力更强，配基密度更高的填料，通常镍琼脂糖凝胶作用力最强，如果蛋白分子量大可以选择手臂长的填料，如镍NTA琼脂糖凝胶，填料的好坏可以看填料的颜色，颜色越深那配基密度越高，作用力也相应要强。
3样品的pH过低或者沉淀导致不能吸附，所以样品和缓冲液的pH要尽量一致，避免沉淀，通常再偏碱性条件下吸附更好。
3.难洗脱：如果穿透中目标蛋白明显减少，而洗脱又没有，取点填料加电泳缓冲液煮后离心跑电泳还是有目标蛋白，可以用更强的洗脱条件如500mM咪唑，如果还不能洗脱，可以直接用500mM咪唑加到6M盐酸胍去洗脱。
4. 电泳杂带多：因为这种亲和毕竟特异性要差点，原因在蛋白中带组氨酸，色氨酸，半胱氨酸等很常见，特别是蛋白折叠会导致几个这样的氨基酸残基临近，
这样也会使它们和镍柱的作用力增加，因此可以用不同浓度的咪唑阶段洗脱，此外在咪唑洗脱前增加一步0.5M pH5的醋酸缓冲液洗脱，在平衡缓冲液中添加0.5%吐温或Triton可以避免因为疏水相互作用导致非特异吸附，这样可以电泳的杂带明显减少，但是如果用这样的方法还是杂带多，那就地回头去看看破碎的条件是不是太剧烈或者温度控制不好导致蛋白短裂或者分解导致一些蛋白片段带标签，或者因为样品长时间保存导致水解等，总之纯化的好坏决定于每一个步骤，不仅仅是纯化的问题。
还有一个不容忽略的问题是有时候因为蛋白相互作用或者因为形成聚合体导致杂带增加，而由于疏水相互作用或者因为离子作用可以通过添加表面活性剂或者增加离子强度得到改善，对于因为形成聚合体的可以在缓冲液和样品中加1-2mM巯基乙醇避免，如果这样的情况下最好是选择镍NTA琼脂糖凝胶，因为它在还原剂下更稳定。
三、影响IMAC纯化结果的因素
1.填料的种类：
不同填料厂家的填料有差别，所以使用过程最好能得到厂家的技术支持，因为不同的厂家填料不同，此外蛋白纯化个性很强，没有哪一个填料是能适合所有带六个组氨酸标签蛋白的纯化，载量高和特异性好本身就是矛盾。
2.填料的配基种类、密度、金属离子种类
填料最简单的判断是螯合好同样的金属离子，哪家产品的颜色越深就意味着和蛋白的作用力越强，适用范围越广，载量也越高，纯化的好坏关键看纯化的条件，仅有填料的特异性是不够的，同样配基密度下IDA填料的亲和力要比NTA的强，所以NTA上不能吸附的样品可以选择IDA为配基的填料。
3.螯合金属离子和蛋白作用强弱为铜和镍离子的强，而锌和钴离子的弱。
因此如果一个蛋白作用力强，想得到好的特异性可以选择螯合钴离子，它还有一个优点是不怕还原剂，特别时候有高浓度的还原剂。
相同金属离子，IDA的强于NTA。
螯合金属离子的价位越低和蛋白的作用力越强。
同时镍离子是最常用的，如果有条件可以换不同金属离子以得到更好的效果，因为不同的金属离子有不同的选择性。
因此要希望填料应用范围广就选择镍琼脂糖凝胶，如果是希望特异性好而且稳定就选择镍NTA琼脂糖凝胶.。