免疫沉淀试验培训课件
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《免疫共沉淀》课件
明确实验目的和预期结果，设计合理 的实验方案。
检查所需的仪器设备是否齐全和正常 工作，如离心机、摇床、离心管等。
实验操作流程
抗体与蛋白质样品的结合
将抗体与蛋白质样品混合，确保抗体与目标 蛋白质充分结合。
共沉淀物的分离
通过离心或过滤等方法将共沉淀物与溶液分 离。
清洗非特异性结合
通过洗涤去除未结合的蛋白质和其他杂质。
结果分析方法
统计学分析
采用t检验或方差分析等统计学方法，对实验数据进行处理和分析，以确定共沉淀物之间的相互作用 是否具有统计学显著性。
生物信息学分析
利用在线生物信息学工具对共沉淀物进行功能注释、基因本体论（GO）分类和蛋白质相互作用网络 分析，以深入了解共沉淀物的生物学功能和相互作用关系。
结果解读与讨论
值的实验数据和结论。
未来可以对这些蛋白质复合物的 功能进行深入研究，探讨其在生 物学和医学中的意义和作用机制
。
同时，随着技术的不断进步和应 用领域的拓展，免疫共沉淀技术 还有望在更多领域发挥重要作用
。
未来研究方向与建议
1
进一步优化免疫共沉淀实验条件和方法，提高实 验的特异性和灵敏度，以分离和鉴定更多蛋白质 复合物。
结果解读
根据实验结果，分析共沉淀物的生物学 意义和功能，探讨它们与目标蛋白的相 互作用机制。
VS
结果讨论
结合已有研究，对实验结果进行深入讨论 ，提出可能的生物学模型或假设，为后续 研究提供思路和方向。同时，对实验的局 限性进行说明，并提出改进方向。
05
结论与展望
结论总结
免疫共沉淀技术是研究蛋白质相互作用的经典方法之一，在生物学和医学 研究中具有广泛应用。
பைடு நூலகம்
检查所需的仪器设备是否齐全和正常 工作，如离心机、摇床、离心管等。
实验操作流程
抗体与蛋白质样品的结合
将抗体与蛋白质样品混合，确保抗体与目标 蛋白质充分结合。
共沉淀物的分离
通过离心或过滤等方法将共沉淀物与溶液分 离。
清洗非特异性结合
通过洗涤去除未结合的蛋白质和其他杂质。
结果分析方法
统计学分析
采用t检验或方差分析等统计学方法，对实验数据进行处理和分析，以确定共沉淀物之间的相互作用 是否具有统计学显著性。
生物信息学分析
利用在线生物信息学工具对共沉淀物进行功能注释、基因本体论（GO）分类和蛋白质相互作用网络 分析，以深入了解共沉淀物的生物学功能和相互作用关系。
结果解读与讨论
值的实验数据和结论。
未来可以对这些蛋白质复合物的 功能进行深入研究，探讨其在生 物学和医学中的意义和作用机制
。
同时，随着技术的不断进步和应 用领域的拓展，免疫共沉淀技术 还有望在更多领域发挥重要作用
。
未来研究方向与建议
1
进一步优化免疫共沉淀实验条件和方法，提高实 验的特异性和灵敏度，以分离和鉴定更多蛋白质 复合物。
结果解读
根据实验结果，分析共沉淀物的生物学 意义和功能，探讨它们与目标蛋白的相 互作用机制。
VS
结果讨论
结合已有研究，对实验结果进行深入讨论 ，提出可能的生物学模型或假设，为后续 研究提供思路和方向。同时，对实验的局 限性进行说明，并提出改进方向。
05
结论与展望
结论总结
免疫共沉淀技术是研究蛋白质相互作用的经典方法之一，在生物学和医学 研究中具有广泛应用。
பைடு நூலகம்
免疫共沉淀(CHIP)培训
拓展实验
RNA pull down：使用体外转录法标记生物素RNA探针， 然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。 该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，从而与孵 育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，通过western blot实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用。
拓展实验
超声破碎较重要，需多次优化，选择合适的超声条件； 超声是探头要深入液面约0.5cm左右，探针不可碰壁， 超声过程中不能起泡，否则会影响蛋白活性，整个超 声过程必须在低温中进行（冰水混合物中）间歇时间 宜设置较长；
超声条带大小在200-800bp最佳。
由于多次洗涤后会导致细胞量损失，因此需保证细胞 量。
RIP 技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation Assay， RNA 结合蛋白免疫沉淀）主要是运用针对目标蛋白的抗体把相应 的RNA-蛋白复合物沉淀下来，经过分离纯化就可以对结合在复合 物上的RNA 进行q-PCR验证或者测序分析。RIP 是研究细胞内RNA 与蛋白结合情况的技术，是了解转录后调控网络动态过程的有力 工具，可以帮助我们发现miRNA 的调节靶点。
注意事项
收样须知：
① 需客户提供预测靶位点信息及参考文献或者资料； ② 需提供CHIP级抗体； ③ 若客户提供细胞，需明确告知客户，分多次（至少3次）
提供足量新鲜细胞10^7以上以摸索超声条件（体积、间歇 时间、总时间、剪切效果片段大小200-1000bp最佳）。
超声破碎尤其重要，需多次优化，选择合适的超声条件，才 能保证后期实验有效进行：
CHIP模式图
CHIP流程图
甲醛固定 超声破碎
免疫沉淀
CHIP简要步骤
细胞收集及体内交联 细胞裂解及DNA剪切 蛋白-DNA免疫沉淀 DNA解交联及DNA纯化 常规PCR或QPCR检测
沉淀反应(免疫学检验课件)
第十三章
沉淀反应
沉淀反应
(precipitation)
可溶性抗原（细菌培养滤液、细胞或组织的 浸出液、血清蛋白等）与相应抗体在液相中特异 结合后，形成的免疫复合物受电解质影响出现的 沉淀现象。
反应中的抗原称为沉淀原（precipitinogen） 可以是类脂、多糖或蛋白质等；抗体称为沉淀素 （precipitin）。
❖ (3)溶液中的抗原－抗体复合物的数量要足够多。如果 数量太小，溶液浊度变化太小，对光通量影响不大。
❖ (4)透射比浊是依据透射光减弱的原理来定量的，因此 只能测定抗原－抗体反应的第二阶段，检测需抗原－ 抗体温育反应时间，检测时间较长。
❖ (5)检测用的抗体一般应选择亲和力较高的抗体，且在 检测中应保证抗体过量。
退。实际上在电泳的过程中受
负电荷多
－
电泳力 ＞
电渗力
抗体 负电荷少
电泳力 ﹤ 电渗力
+
步骤：
制板
3－4ml琼脂
打孔
孔间距3mm
加样
约7ul
抗体
抗原
电泳
总电流＝4mA x 1cm/板宽 x N(板数） 20—30分钟
三、免疫电泳技术
免疫电泳技术的用途
是散射比浊法的改良。一般在30～120min内比 浊
用于免疫沉淀反应的缺陷
(1)因为是一次性测定光吸收值，没有考虑每一个待测 样本的吸收和散射效果，可测定结果不准确
(2)测定的仍是抗原－抗体反应的第二阶段，不适合快 速检测。
(3) 终点法存在反应本底（空白管），测定样本的含量 越低，本底比例越大，故在微量测定时，本底的干 扰是影响准确测定的重要因素。
（4）若反应时间过长，IC聚合形成沉淀则导致散射值 偏低。故需掌握最适时间比浊。
沉淀反应
沉淀反应
(precipitation)
可溶性抗原（细菌培养滤液、细胞或组织的 浸出液、血清蛋白等）与相应抗体在液相中特异 结合后，形成的免疫复合物受电解质影响出现的 沉淀现象。
反应中的抗原称为沉淀原（precipitinogen） 可以是类脂、多糖或蛋白质等；抗体称为沉淀素 （precipitin）。
❖ (3)溶液中的抗原－抗体复合物的数量要足够多。如果 数量太小，溶液浊度变化太小，对光通量影响不大。
❖ (4)透射比浊是依据透射光减弱的原理来定量的，因此 只能测定抗原－抗体反应的第二阶段，检测需抗原－ 抗体温育反应时间，检测时间较长。
❖ (5)检测用的抗体一般应选择亲和力较高的抗体，且在 检测中应保证抗体过量。
退。实际上在电泳的过程中受
负电荷多
－
电泳力 ＞
电渗力
抗体 负电荷少
电泳力 ﹤ 电渗力
+
步骤：
制板
3－4ml琼脂
打孔
孔间距3mm
加样
约7ul
抗体
抗原
电泳
总电流＝4mA x 1cm/板宽 x N(板数） 20—30分钟
三、免疫电泳技术
免疫电泳技术的用途
是散射比浊法的改良。一般在30～120min内比 浊
用于免疫沉淀反应的缺陷
(1)因为是一次性测定光吸收值，没有考虑每一个待测 样本的吸收和散射效果，可测定结果不准确
(2)测定的仍是抗原－抗体反应的第二阶段，不适合快 速检测。
(3) 终点法存在反应本底（空白管），测定样本的含量 越低，本底比例越大，故在微量测定时，本底的干 扰是影响准确测定的重要因素。
（4）若反应时间过长，IC聚合形成沉淀则导致散射值 偏低。故需掌握最适时间比浊。
临床免疫学与检验课件：沉淀反应
火箭免疫電泳
影響因素
1.瓊脂（無電滲或電滲很小的）影響火箭形狀不規 則。 2.電泳終點時間的確定。 3.標本數量多時應先通電後加樣,防止寬底峰形. 4.IgG定量時，可用甲醛與IgG上的氨基結合（甲 醯化），抵消了電滲作用。
火箭免疫電泳示意圖
+
-
火箭免疫電泳圖 ①②③④為標準抗原；⑤⑥為標本
三、免疫電泳
電泳時凝膠中抗體不移動，樣品孔中的 抗原向正極泳動，隨著抗原量的逐漸減 少，抗原泳動的基底區越來越窄，抗原 抗體分子複合物形成的沉澱線逐漸變窄， 形成一個形狀如火箭的不溶性複合物沉 澱峰，抗體濃度固定時，峰的高度與抗 原量呈正相關。
火箭免疫電泳
技術要點
1.2%巴比妥瓊脂糖約55℃，加入適量抗 血清，混勻後制板，打孔，孔內加待測樣 品，樣品孔放負極側， 6h後觀察瓊脂板 上沉澱峰，繪製標準曲線，求出待測樣品 濃度。
單向擴散試驗（平板法）
傾注平板 打孔 加樣 放置37℃ 24～48h觀察沉澱環
單向擴散試驗 （平板法）
沉澱環的直徑與待測標本含量兩種計算方法
Mancini曲線： 大分子抗原（IgM）
時間擴散＞48h， 常數K＝C∕d2 普通座標紙曲線
Fahey曲線： 小分子抗原（IgG,IgA）
擴散時間24h 常數K＝logC∕d 半對數座標紙曲線
單克隆抗體；多克隆抗體； 可出現假性降低與增高
• 雙環現象
不同擴散率抗原性相同的兩個 組分
單向擴散試驗 上排為5個不同濃度的參考品； 下排為患者血清，下排右2為異常病 理血清
二、雙向擴散試驗 （平板法）
鑒定抗原抗體的最基本、最常見的方法之一
原理：將抗原抗體 分別加在瓊脂糖 不同的對應孔中， 兩者在凝膠中自 由擴散，在比例 合適處形成白色 沉澱線。
免疫沉淀实验课件
第39题 解析：参考答案：C [解析] “天下虽安，忘战必危”体现的是矛盾双方在一定条件下可以相互转化的辩证法思想， 因此要居安思危。“贾人旱则资舟，水则资车，以待乏也”意思是商人旱天购买舟船， 涝天购买车辆，等待货有所缺。与题干中的意思相似，体现未雨绸缪、居安思危的逆 向思维。本题答案选C。
第40题 解析：参考答案：D [解析] 植物蛋白的消化、吸收要比动物蛋白差。动物蛋白和人类的营养结构比较吻合，其蛋 白质的种类和结构更加接近人体的蛋白结构和数量，而且一般都含有人体必需的8种氨 基酸。故本题选D。
实验一 免疫沉淀类反应
1
l 免疫沉淀反应：可溶性抗原与相应抗体在 溶液或凝胶中接触形成肉眼可见的抗原抗 体复合物沉淀称为免疫沉淀反应。
2
对流免疫电泳
环状沉淀反应
沉
电
淀 反
琼脂扩散试验
单向扩散试验 双向扩散试验
泳
＋
技 术
应
絮状沉淀反应
火箭免疫电泳
3
一、双向免疫扩散试验
实验原理
l 指可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散， 彼此相遇，在浓度比例适当处形成沉淀线。
12
13
试剂和器材
l 抗原：人全血清 l 抗体：兔抗人全血清 l 1％琼脂：0.05mol/L pH8.6的巴比妥缓冲液
配制 l 电泳槽、电泳仪、 l 载玻片、水浴箱、打孔器、微量加样器
14
实验步骤
l 制板 取已经融化的1%琼脂约4ml，加到 水平放置的载玻片上，使成厚度约为 1.5mm的琼脂板，待冷凝。
l 打孔 打梅花孔（如图），各孔间的距离为4-5mm。
1
7
l 倍比稀释抗体 （见下表） l 加样 用微量加样器分别取抗原、抗体10ul加入各
第40题 解析：参考答案：D [解析] 植物蛋白的消化、吸收要比动物蛋白差。动物蛋白和人类的营养结构比较吻合，其蛋 白质的种类和结构更加接近人体的蛋白结构和数量，而且一般都含有人体必需的8种氨 基酸。故本题选D。
实验一 免疫沉淀类反应
1
l 免疫沉淀反应：可溶性抗原与相应抗体在 溶液或凝胶中接触形成肉眼可见的抗原抗 体复合物沉淀称为免疫沉淀反应。
2
对流免疫电泳
环状沉淀反应
沉
电
淀 反
琼脂扩散试验
单向扩散试验 双向扩散试验
泳
＋
技 术
应
絮状沉淀反应
火箭免疫电泳
3
一、双向免疫扩散试验
实验原理
l 指可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散， 彼此相遇，在浓度比例适当处形成沉淀线。
12
13
试剂和器材
l 抗原：人全血清 l 抗体：兔抗人全血清 l 1％琼脂：0.05mol/L pH8.6的巴比妥缓冲液
配制 l 电泳槽、电泳仪、 l 载玻片、水浴箱、打孔器、微量加样器
14
实验步骤
l 制板 取已经融化的1%琼脂约4ml，加到 水平放置的载玻片上，使成厚度约为 1.5mm的琼脂板，待冷凝。
l 打孔 打梅花孔（如图），各孔间的距离为4-5mm。
1
7
l 倍比稀释抗体 （见下表） l 加样 用微量加样器分别取抗原、抗体10ul加入各
免疫共沉淀原理和注意事项培训ppt课件
免疫共沉淀原理和注意事项
8
三 实验流程
提取细胞总蛋白
↓
↓
离心，上清电泳(抗原抗体)
准备PA珠子， PBS洗3遍
↓
PA珠子加入蛋白裂解液 (去除非特异性蛋白背景)
↓
离心去PA珠子，取上清
↓
测蛋白浓度 (BCA法)
↓
加一抗反应(4℃过夜)
↓
加PA珠子捕捉复合物 (室温1h或4℃过夜)
↓
离心，收集沉淀，预冷RIPA Buffer洗3遍
2. RIPA裂解液中蛋白样品含有较高浓度的去垢剂，不能用 Bradford法但可用BCA法或改良Lowry法测定蛋白浓度
免疫共沉淀原理和注意事项
16
裂解液成分
国内博士：
细胞裂解液： 50mM Tris-HC (lpH7.5)，
150 mM NaCl, 0.5%NP-40,
1mM EDTA 使用前加入PMSF至终浓度1mM、 proteinase inhibitor cocktail (混合物)。
ECL 试剂 +
一抗
一抗
二 抗 ( 辣 根 酶 标 记 的 羊 抗 兔 IgG)
一抗(兔抗Actin)
曝光后的蛋白条带
含有转印蛋白的PVDF膜
转印膜上蛋白检测示意图
免疫共沉淀原理和注意事项
X光片曝光显影
ECL
12
CO-IP与质谱分析流程
免疫共沉淀原理和注意事项
13
三 实验的关键
v 1. 实验最需要注意点就是抗体的性质。特别是多抗的特异性是问题。 v 2. 为防止蛋白的分解、修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制
剂，低温下进行实验。
v 3. 考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不 能沉降在beads上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多 则抗原被稀释。
医学免疫学实验课件-沉淀反应
沉淀物
目 录 末页
琼脂扩散实验
可溶性抗原和抗体在琼脂中扩散，相遇， 在适当比例下形成沉淀线或沉淀环。
分类:
单向琼脂扩散实验: 仅抗原或抗体扩散 —— 定量
双向琼脂扩散实验: 抗原和抗体同时扩散 —— 定性
目 录 末页
沉淀反应分类
一、单向琼脂扩散 特点
1. 简单 2. 灵敏度较低约为：10－20μg 3. 1~2天才能看结果
目录
概述
一、单向琼脂扩散试验 二、双向琼脂扩散试验 三、火箭电泳 四、对流免疫电泳 五、免疫电泳
•目的要求
目 录 末页
目的要求
1.掌握对流免疫实验原理、操作过程及应用。 2.熟悉单向、双向琼脂扩散实验的原理、操作 过程及应用。 3.了解免疫电泳、火箭电泳实验的原理、操作 过程及应用。
目 录 末页
2. 取约4ml 琼脂液浇注在载玻片上
凝固
3. 打4个孔，孔径3mm，孔距6mm
_
+
4. 在孔中加入相应样品
Ag1
Ab
Ag2
Ab
5. 电泳约1h
目 录 末页
对流免疫电泳
目 录 末页
沉淀反应分类
1.单向琼脂扩散 2.火箭电泳 3.双向琼脂扩散 4.对流免疫电泳 5.免疫电泳
目 录 末页
免疫电泳
目 录 末页
特点： 1.需仪器 2.灵敏度提高约为：10μg/ml 3.1h能看结果
目 录 末页
四、对流免疫电泳
【原理】
在适宜缓冲液和电场条件下，抗原和相应抗 体在琼脂凝胶中，由于电泳和电渗作用，抗原向 正极移动，抗体向负极移动，两者相向移动，在 两孔之间相遇，在比例合适处形成沉淀线。
目 录 末页
《免疫共沉淀》课件
机制。
研究疾病机制： 免疫共沉淀技术 可以用于研究疾 病机制，了解疾 病相关的蛋白质 相互作用和调控
机制。
实验流程及操作
实验材料：抗体、抗原、缓冲液、 离心管等
实验环境：无菌操作台、超净工作 台等
添加标题
添加标题
添加标题
添加标题
实验设备：离心机、显微镜、电泳 仪等
实验人员：具备相关实验技能和操 作经验的人员
关键因素：抗体浓 度、孵育时间、洗 涤次数、复溶缓冲 液
注意事项：避免非 特异性结合、防止 蛋白降解、确保实 验重复性
洗涤步骤：使用洗涤缓冲液洗涤，去除未结合的蛋白 洗涤次数：一般需要洗涤3-5次 检测方法：使用Western Blotting或ELISA等方法进行检测 检测结果：根据检测结果判断免疫共沉淀是否成功
有害气体
穿戴防护服、 手套、口罩等 个人防护用品
实验过程中， 避免直接接触 实验材料，使 用一次性手套
和镊子
实验结束后， 及时清理实验 台面，避免污
染环境
实验过程中， 如出现异常情 况，立即停止 实验，并报告 实验室负责人
实验结束后， 对实验材料进 行妥善处理， 避免污染环境
实验优化与拓展
抗体选择：针对目 标蛋白选择特异性 抗体
免疫共沉淀实验成功分离出目标蛋白 目标蛋白与相互作用蛋白结合，验证了实验假设 实验结果支持了目标蛋白在细胞信号传导中的作用 实验结果提供了对目标蛋白功能的新认识
实验注意事项及常 见问题
确保实验操作在无菌环境下进行，以避免污染。 注意使用新鲜的抗体，避免影响实验结果。 注意控制孵育时间和温度，以保证实验结果的准确性。 在洗涤过程中要彻底洗去未结合的蛋白质，以免干扰实验结果。
洗脱条件：优化洗 脱条件以减少非特 异性结合
研究疾病机制： 免疫共沉淀技术 可以用于研究疾 病机制，了解疾 病相关的蛋白质 相互作用和调控
机制。
实验流程及操作
实验材料：抗体、抗原、缓冲液、 离心管等
实验环境：无菌操作台、超净工作 台等
添加标题
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添加标题
添加标题
实验设备：离心机、显微镜、电泳 仪等
实验人员：具备相关实验技能和操 作经验的人员
关键因素：抗体浓 度、孵育时间、洗 涤次数、复溶缓冲 液
注意事项：避免非 特异性结合、防止 蛋白降解、确保实 验重复性
洗涤步骤：使用洗涤缓冲液洗涤，去除未结合的蛋白 洗涤次数：一般需要洗涤3-5次 检测方法：使用Western Blotting或ELISA等方法进行检测 检测结果：根据检测结果判断免疫共沉淀是否成功
有害气体
穿戴防护服、 手套、口罩等 个人防护用品
实验过程中， 避免直接接触 实验材料，使 用一次性手套
和镊子
实验结束后， 及时清理实验 台面，避免污
染环境
实验过程中， 如出现异常情 况，立即停止 实验，并报告 实验室负责人
实验结束后， 对实验材料进 行妥善处理， 避免污染环境
实验优化与拓展
抗体选择：针对目 标蛋白选择特异性 抗体
免疫共沉淀实验成功分离出目标蛋白 目标蛋白与相互作用蛋白结合，验证了实验假设 实验结果支持了目标蛋白在细胞信号传导中的作用 实验结果提供了对目标蛋白功能的新认识
实验注意事项及常 见问题
确保实验操作在无菌环境下进行，以避免污染。 注意使用新鲜的抗体，避免影响实验结果。 注意控制孵育时间和温度，以保证实验结果的准确性。 在洗涤过程中要彻底洗去未结合的蛋白质，以免干扰实验结果。
洗脱条件：优化洗 脱条件以减少非特 异性结合
临床免疫学检验 课件 第6章 沉淀反应 2
1898年Kraus首次发现毒素-抗毒素的沉 淀现象；
1905年Bechgold 发现沉淀可以在明胶中 进行；
1965年Mancini发明单向免疫扩散技术；
上世纪70年代免疫浊度法出现。
上述技术的发明发展，使得沉淀反应向 快速、准确、微量、自动化方向发展， 在医学检验中的应用越来越广泛。
沉淀反应分两个阶段
把抗原液小心地加于 已含抗体液的细试管液
?方法评价： 敏感度较低、简便、 快速、实用、只能 定性不能定量、缺
面上，当对应的抗原与 乏多对分辨力。
抗体相遇，在界面处形 ?临床意义：
成清晰的乳白色沉淀环。 鉴定血迹、
诊断炭疽
操作步骤
环状沉淀示意图
环
状
沉
淀
示
意
图
?沉淀管内径 1.5～2mm Ag ?1～5min出现沉淀环为阳性 Ab ?30min不出现沉淀环为阴性
将抗原作系列稀释，与恒量浓度的抗血清等量混合反应后，产生的沉淀物 随抗原量的变化而不同。抗原抗体比例适当时，形成的沉淀物最多。
抗体稀释法：抗体最适比例
将抗体作系列稀释，与恒量浓度的抗血清等量混合反应后，产生的 沉淀物随抗体量的变化而不同。
方阵滴定法：抗原抗体最适比例
将以上两种方法结合，将抗原抗体同时稀释，找出最佳比例。
一、絮状沉淀试验 ( flocculation test)
? 原理
抗原溶液与相应抗体 溶液混合，在电解质存 在下，抗原与抗体结合 出现可见的絮状沉淀。
?操作步骤 ?方法评价：
敏感度较低、简便、 易受抗原抗体比例 影响--最适比 ?临床意义： 测定抗原抗体反应 的最适比。
絮状沉淀试验
抗原稀释法：抗原最适比例
免疫学实验课沉淀反应培训课件
免疫学实验课沉淀反应
17
;两者相遇时在比例合适处形成沉淀线。
抗体
抗原
免疫学实验课沉淀反应
11
免疫学实验课沉淀反应
12
双向琼脂扩散试验 免疫学实验课沉淀反应
13
(3)对流免疫电泳检测血清中AFP
• 1、3孔加抗AFP抗 体
+
1
• 2孔，AFP阳性对照
3
血清
• 4孔，待检血清
pH 8.6巴比妥缓冲液
免疫学实验课沉淀反应
2
免疫学实验课沉淀反应
实验室规则－要点
❖ 实验室安全－门窗、水、电、火源
实验结束后关闭门窗、水、电、火源 酒精灯和易燃物的使用注意事项；棉塞着火须报
告老师 电源－空气开关 水的使用
❖ 实验室安全－生物安全
白大褂的穿着要求
不得将实验无关物品带入实验室
不得在实验室内饮食
不得擅自开UV灯
污染及潜在污染物品须进行消毒处理
免疫学实验课沉淀反应
5
沉淀反应:
可溶性抗原（血清蛋白质、细胞裂解液、组织浸液、微生
物蛋白等）与相应抗体，在一定的抗原抗体比例下，在一定离 子浓度的缓冲体系中，发生结合后出现沉淀物称沉淀反应。
沉淀原，沉淀素。
环状法、絮状法、琼脂扩散法
类型：
★单向免疫扩散 ★双向免疫扩散 ★对流免疫电泳
★免疫比浊法
免疫学实验课沉淀反应
-
4
14
电场力
Ab
pI～7.5
电
Ag
pI～4.8
琼脂糖：在pH8.6的缓冲液中带负电 与琼脂糖接触的可移动液体：带正电
免疫学实验课沉淀反应
15
对流免疫电泳 免疫学实验课沉淀反应
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各管抗体量不变
Ab
振摇 混匀、37℃孵育
Ag
沉淀量不同
出现沉淀量最多的管为最免疫适沉比淀试例验管。 1/11/2021
轻摇
10
最适比方阵测定法
抗原稀释度
抗体
稀释度
1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640
对照
1/5
+
++ +++ +++ ++
+
±
—
1/10
+
++
++
1/11/2021
免疫沉淀试验
14
透射比浊试验和散射比浊试验光路
IC
透射比浊试验
I
检测器A
I0
θ
当复合物＜3×106dal，
I≈Iθ;θ＜90°，散射光的
量代表IC的量。
1/11/2021
免疫沉淀试验
Iθ 检测器B
散射比浊试验
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补充：免疫浊度测定影响因素
（1）抗原抗体的比例：反应体系保持抗体过量
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免疫沉淀试验
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（2）抗体的质量
•抗体的特异性 •抗体的效价(>1:20) •抗体的亲和力 •R型和H型抗体（R型）
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免疫沉淀试验
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（3）抗原抗体反应的环境 最适PH为：6.5-8.5 离子强度大，IC形成快 离子种类的影响，常用磷酸盐缓冲液 （4）增浊剂 PEG(6000—8000) 浓度4%吐温-20
24～48h观察沉淀
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免疫沉淀试验
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Mancini曲线
Fahey曲线
T以1为上1,1/6可11-/202见214hT3；为T直2为线2，4-T418为h；反抛T3为物免疫4线8沉h淀试t4物18验为线h以1上6-,2可4h见；tt1为2 为直2线4-，48th3；为反t293 抛为
待检蛋白质抗原须具备的条件
仅针对某待测抗原的单价特异性抗血清 已知含量的标准品 待测品含量在1.25g/ml以上
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免疫沉淀试验
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一、单向免疫扩散试验
单向扩散试验
上排为5个不同浓度的参考品；
下排为患者血清，下免疫排沉淀右试验2为异常病理血清
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应用
IgG、IgA、IgM、C3、C4、 转铁蛋白、抗胰蛋白酶、糖蛋白和前白蛋白
免疫沉淀试验
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一、单向免疫扩散试验
定量试验
原理：抗体与待测的抗 技术要点：
原,在两者比例合适的
部位结合形成沉淀环。
环的大小与抗原的浓
度成正相关。
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1.制板 2.打孔 3.加样 4.扩散 5.绘制标准曲线 26
一、单向免疫扩散试验
倾注平板
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打孔
加样免疫放沉环淀置试3验7℃
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优 点：
稳定性好、简便快速，易于自动化 敏感度高 精确度高 无放射性核素污染
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分 类：
1.根据反应的时间和反应结合的动力学分为 速率比浊法 终点比浊法 2.根据检测仪器的位置及光信号性质分为 透射免疫比浊法 散射免疫比浊法 3.免疫胶乳比浊法
第六章 免疫沉淀试验
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免疫沉淀试验
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教学目的
掌握：液相内沉淀试验、凝胶内沉淀试验 原理
熟悉：沉淀反应的特点、免疫电泳技术、 沉淀反应的应用
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免疫沉淀试验
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第一节 免疫沉淀试验的基本原理
一、基本原理
免疫沉淀反应（immunoprecipitation
reaction）指可溶性抗原与相应抗体在
等多种血浆蛋白的检测
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免疫沉淀试验
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二、双向免疫扩散试验
技术要点：
1.制板
2.打孔
3.加样
4.扩散
++ +++ ++
+
—
1/20
+
++
++
++ +++ ++
+
—
1/40 —
±
+
+
++
++ +
++
—
1/80
—
—
—
—
+
+
+
—
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二、免疫浊度测定
原理： 当可溶性抗原与相应抗体特异结合，
二者比例合适时，在增浊剂中它们 快速形成一定大小的抗原抗体复合 物，使反应液体出现浊度。
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原理
可溶性抗原和相应抗体在凝胶中 扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体 相遇并且浓度比例适当的位置形成 肉眼可见的沉淀线或沉淀环。
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反应介质：凝胶
凝胶的特点：
1、固相的液体
2、多孔的网状结构
3、Ag-Ab复合物网络在凝胶 中
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（2）抗体的质量 ：特异性强，效价高，亲和力 强，并使用R型抗体
（3）抗原抗体反应液的环境：最适PH为6.5-8.5
（4）增浊剂
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（1）抗原抗体的比例
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海德堡曲线
在抗体过量的反应体系中,抗原量的递 增与比浊定量成正比,当抗原抗体比例合 适时反应达峰值,而当抗原过量时,形成的 免疫复合物分子小,浊度反而下降的一个 抛物曲线。
免疫电泳技术
免疫浊度测定
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免疫沉淀试验
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三、 免疫沉淀试验的特点
1. 阶段性 2. 特异性 3. 抗原性质：可溶性 4. 抗体的选择：2价
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第二节 液体免疫沉淀试验
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免疫沉淀试验
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第二节 液体免疫沉淀试验
一、絮状免疫沉淀试验
絮状免疫沉淀试验是将抗原与相应
抗体混合，在电解质存在的条件下，
抗原抗体结合形成肉眼可见的絮状
沉淀物。
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免疫沉淀试验
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一、絮状免疫沉淀试验
抗原稀释法：抗原最适比例
抗体稀释法：抗体最适比例
方阵滴定法：抗原抗体最适比例
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免疫沉淀试验
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絮 状 沉 淀 示意图
各管抗原倍比稀释
Ag
加入抗血清
1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128
适当条件下发生特异性结合而出现的沉
淀现象。
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免疫沉淀试验
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沉淀反应分两个阶段
第一阶段
第二阶段
抗原抗体特异性结 形成肉眼可见的大的 合，快速但不可见 免疫复合物。
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二、免疫沉淀试验的分类
液体内 沉淀试验
凝胶内 沉淀试验
环状ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ淀试验
免疫扩散试验
絮状沉淀试验
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伪浊度形成的原因
1.抗血清中有非特异性的交叉反应性杂 抗体成分
2.增浊剂浓度和反应时间掌握不当
3.样品本身的浊度处理不当
4.试剂污染变质
5.比色杯不够清洁
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第三节 凝胶内免疫沉淀试验
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免疫沉淀试验
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第三节 凝胶内免疫沉淀试验