分子生物学实验设计实验
利用分子生物学方法鉴定食品中的致病微生物(大肠杆菌)实验设计
利用分子生物学方法鉴定食品中的致病微生物(大肠杆菌)实验设计实验目的：利用分子生物学方法鉴定食品中的致病微生物（大肠杆菌）。
实验材料和仪器：1.食品样品（可能受到大肠杆菌污染的食品样品）2.大肠杆菌纯培养物3.DNA提取试剂盒4.PCR试剂盒5.扩增仪6.DNA凝胶电泳仪7.DNA标记物8.电泳凝胶9.UV透射仪实验步骤：1.向含有大肠杆菌的培养物中添加适量的无菌水，制备测定标准曲线用工作溶液。
通过适量稀释，确保能获得包含一定数量大肠杆菌的工作溶液。
2.称取加热灭活的食品样品，如肉类或蔬菜，使用细菌培养基作为负对照。
3.提取食品样品中的细菌DNA。
使用DNA提取试剂盒，按照生产商的说明书操作，从食品样品中提取总DNA。
4. 设计适用于大肠杆菌的引物。
从GenBank数据库中检索适合大肠杆菌的引物序列并合成引物。
5.进行PCR扩增反应。
在PCR反应管中加入模板DNA，引物和PCR试剂盒提供的反应液，将其放入扩增仪中进行PCR扩增。
6.准备凝胶和电泳条件。
在适当的浓度下制备琼脂糖凝胶，并根据引物大小和预期DNA片段大小调整电泳条件。
7.进行PCR产物的电泳检测。
取PCR反应混合液5μL，以及DNA标记物，放入琼脂糖凝胶槽中进行电泳。
8.照相检测结果。
使用UV透射仪照射电泳凝胶，检查PCR产物的大小和带。
如果有大小适合的带出现，则该食品样品中存在大肠杆菌。
9.分析结果。
根据电泳凝胶的结果，判断食品样品中大肠杆菌的存在与否。
实验注意事项：1.实验过程中保持操作环境的高度无菌。
2.准备PCR反应混合液时，避免污染和交叉污染。
3.扩增后的产物严禁回收，以避免引入假阳性结果。
4.进行凝胶电泳时，注意电泳条件的调整，确保PCR产物可以清晰可见。
总结：该实验利用分子生物学方法对食品中的致病微生物（大肠杆菌）进行鉴定。
通过提取食品样品中的细菌DNA，并使用PCR扩增大肠杆菌特异序列，通过电泳检测分析PCR产物的大小和带，判断食品样品中是否存在大肠杆菌。
分子生物学实验技术3篇
分子生物学实验技术
第一篇：PCR技术
PCR（聚合酶链反应）是一种基于体外体内 DNA 复制的技术。
PCR 技术广泛应用于分子生物学、生物医学研究、医学诊断、生物技术等领域。
在 PCR 中，核酸模板、引物、聚合酶和反应缓冲液是必不可少的组成部分。
PCR 引物是在特定位置的 DNA 片段，用于诱导聚合酶模板 DNA 的扩增。
聚合酶通过催化模板 DNA 在 DNA 引物的引导下合成相应的 DNA 片段，产生大量的重复 DNA 片段。
PCR 是一种快速、高效、灵敏的 DNA 分析技术，可以对非常小的样本进行扩增。
PCR 的操作流程如下：
1．取得合适的 DNA 样品。
2．准备 PCR 反应体系，包括 PCR 反应缓冲液、聚合酶、DNA 模板和引物。
3．用 PCR 机进行程序设定和反应。
4．检查 PCR 反应产物，包括 PCR 产物的带型和验证PCR 产物的特异性和纯度等。
PCR 的应用
1．DNA 序列鉴定以及 DNA 序列变异检测。
2．基因表达分析、基因定量、等位基因分析等基因功能研究操作。
3．分子诊断，可以根据染色体、基因、蛋白质等材料进行分析。
4．农业和畜牧业生物工程的研究。
优点：
PCR 反应时间逐渐缩短，灵敏度高，重现性好，稳定性强。
PCR 技术可以在非常小范围内进行 DNA 分析，并可以处理复杂的实验体系。
缺点：
PCR 技术还有一些局限性，比如需要合理设计引物，需要准确的温度控制，需要恰当的试剂，且对样品的纯度和净化度有严格的要求。
分子生物学综合设计性实验 (2)
分子生物学综合设计性实验实验项目：不同限制性内切酶对质粒DNA的切割学院：生命科学学院年级专业班：生科121姓名：廖怡诚学号：1214100058实验地点：生化楼207指导老师：夏岩石摘要：限制酶是一种能将双链DNA切开的酶。
主要作用于DNA分子内的磷酸二脂键，进而于两条DNA链上各产生一个切口，且不破坏核苷酸与碱基。
切割形式有两种，分别是可产生具有突出单股DNA的黏状末端，以及末端平整无凸起的平滑末端。
每种限制酶能识别特定的碱基序列并进行特异切割，所以理论上加入的限制酶能够根据其特异性判断会得出的DNA片段。
通过电泳跑胶能够对得出的片段进行分析粗略判断与理论长度的吻合度。
一、关键词：限制酶酶切质粒DNA 电泳二、引言：自然界中限制性酶具有降解外源的DNA的能力，对保护宿主遗传稳定有着重要的作用。
但随着基因工程的发展，对限制酶的应用尤为重视。
由于它具有识别特定DNA序列并进行切割的能力，在基因工程中进行目的基因的导入发挥着重要的作用。
可以取长补短，增强对人类有益生物产品的产量和质量，如导入的抗铃虫基因的木棉大幅度提高了木棉的产量。
但由于，导入基因与受主本身基因结合后存在着不可预判性，可能导致生物危机，也可能随机的酶切将基因导入后产生异常的新物种。
但总体而言，限制酶对于人类基因工程的研究有着重要的意义，对于导入优越基因剔除无用基因有着很大的发展前景。
如进行疾病的治疗（基因治疗），从内在对致病基因进行剔除或置换上优越基因的研究，对于人类生命的延续无疑有着重要意义。
而研究限制酶最为基础之一就是要了解它识别序列的特性和作用机理，所以本实验选取了多种限制酶，可以随机搭配进行对已确定的质粒DNA进行酶切之后进行电泳分析，可以研究限制酶酶切后的序列长度以及多种限制酶的加入在识别位点时是否会互相干扰。
通过实验结果验证理论的准确性以及对实验过程中出现的不可预测的因素导致的各种结果的分析。
对于进一步了解限制酶的作用机理有更深的认识，为以后限制酶的研究奠定良好的基础。
分子实验
分子生物学实验设计方案学院：专业班级：课程：实验名称：组员：实验日期：1、学习与掌握利用ITS序列鉴定真菌的原理；2、掌握用ITS序列鉴定真菌的方法有步骤。
二、实验原理1、菌物是真核生物的重要类别，传统的菌物分类以子实体形态特征和生理生化指标为分类基础，由于部分菌物的子实体不易获得，形态特征不易掌握，少数形态特征和生理生化指标随着环境的变化而不稳定，是传统的菌物鉴定工作困难或分类系统意见分歧。
内转录间隔区ITS(internal transcribed space), 位于5.8S和18S之间（ITS1）以及5.8S和28SrDNA 之间(ITS2)，ITS1和ITS2常被合称为ITS，并且5.8SRNA基因也被包括在ITS之内。
近年来，利用真核生物在rDNA的ITS区域既具保守性又在科、属、种水平上均有特异性序列的特性，对ITS区进行PCR扩增、测序。
随着核糖体rDNA ITS序列分析技术在菌物研究中的应用，一些分类地位不明确、亲缘关系不清楚的物种通过该技术得到了解决，一些重要的菌物遗传信息得到阐明。
2、ITS（Internal Transcribed Spacer）：内转录间隔区。
是真菌核糖体RNA（rRNA）基因非转录区的一部分。
用于真菌鉴定的ITS序列通常包括ITS1、5 .8 S 和ITS2。
真菌ITS 区域长度一般在650 ～750 bp( 碱基对)。
ITS（Internal Transcribed Spacer）鉴定是指对ITS序列进行DNA测序，通过将测序得到的ITS序列与已知真菌ITS序列比较，从而获得未知真菌种属信息的一种方法。
ITS鉴定的原理：rDNA 上的5 .8 、18 和28 SrRNA 基因有极大的保守性, 即存在着广泛的异种同源性。
而由于ITS 区不加入成熟核糖体, 所以ITS 片段在进化过程中承受的自然选择压力非常小,因此能容忍更多的变异。
在绝大多数的真核生物中表现出了极为广泛的序列多态性, 即使是亲缘关系非常接近的 2 个种都能在ITS 序列上表现出差异, 显示最近的进化特征。
分子生物学实验设计
菌菌属系统发育提供详实的分子证据。
三、实验设计
3.1实验材料 在野外调查时采集研究材料，新鲜牛肝菌采集后用硅胶干燥或自然风干 后备用。 3.2实验仪器 电子天平；水浴箱；常温超速离心机；北京六一仪器厂电泳槽；Bio Rad电泳仪；WD-9403F型手持紫外分析仪；GE9700 PCR仪； Beckman UV640型紫外分光光度计；Gensnap凝胶成像仪。 3.3 实验试剂 1×CTAB DNA提取液；TE缓冲液；氯仿；苯酚；异戊醇；异丙醇；β巯基乙醇；乙酸钠；70%乙醇；76%乙醇；核酸染料；上样缓冲液（含 0.25%溴酚蓝，40%蔗糖）；dNTP；DL2000Marker；DL5000Marker； MgCl2；10×Buffer；TapDNA聚合酶；NS1/NS8引物；LROR/LR5引 物。
具体实验步骤：
3.7.1 PCR体系参数的优化
PCR扩增体系中，Taq酶用量、镁离子浓度、dNTP、引物及模板浓度 及退火温度均会对扩增结果产生影响，其中扩增模板浓度与退火温度对其 影响最大，直接关系到扩增产物的多少和有无。采用正交实验设计方法， 以Taq酶浓度、镁离子浓度、dNTP浓度、引物浓度四种因素，取A、B、C 3种水平，见表2，对PCR反应体系进行优化。
一、研究概况
在云南，可食用的牛肝菌主要根据子实体的颜色被通俗地分为“白牛肝”， “黄牛肝”和“黑牛肝”，其中“白牛肝”即实际分类学上的“美味牛肝菌” 在贸易中占有重要的地位。从分类学上看，广义的美味牛肝菌复合群包括以下 5个种:美味牛肝菌(Boletus edulis Ball.ex Fr)、褐红牛肝菌(B.pinophilus Pilát & Dermek)、铜色牛肝菌(B.aereus Ball.ex Fr)、网纹牛肝菌(B.Reticulates Schaeff)和夏生牛肝菌(B.aestivalis(Paul.)Fr)这5个种。
分子生物学实验方案
分子生物学实验方案实验目的：本实验旨在通过分子生物学技术，研究基因组中特定基因的表达，以及相关信号转导通路的调控机制。
实验原理：1. RNA提取：从细胞或组织中提取总RNA，利用RNA纯化试剂盒抽提RNA样本。
2. cDNA合成：通过逆转录酶反应，利用mRNA模板合成互补的cDNA，并去除RNA模板。
3. 实时定量PCR：使用合适的引物和荧光探针，通过荧光信号实时监测PCR增殖过程，分析特定基因的表达量。
4. 蛋白质免疫印迹：将细胞提取物或组织样本中的蛋白质，通过SDS-PAGE电泳分离，转移到膜上，用特异抗体与目标蛋白结合，再用二抗识别抗体结合，最后显色检测目标蛋白。
实验步骤：1. RNA提取- 准备待检测细胞或组织的样本。
- 使用RNA纯化试剂盒按照说明书进行RNA提取。
2. cDNA合成- 准备反应体系，包括RNA模板、逆转录酶、引物和dNTPs。
- 在PCR仪中进行cDNA合成反应，设定适当的温度和时间。
3. 实时定量PCR- 准备PCR反应体系，包括cDNA模板、引物、探针和荧光染料。
- 在实时荧光定量PCR仪中设定合适的温度程序和循环次数。
- 分析实时PCR数据，计算目标基因的表达量。
4. 蛋白质免疫印迹- 准备待检测细胞或组织的提取物。
- 使用SDS-PAGE分离细胞提取物中的蛋白质。
- 将蛋白质转移到膜上。
- 进行膜上抗体反应，并用二抗结合以增强信号。
- 检测目标蛋白的表达水平。
实验注意事项：1. 实验操作需在无菌环境下进行，以避免外源性RNA或蛋白的干扰。
2. 实验过程中，需使用质量可靠的试剂和仪器设备，确保实验结果准确可靠。
3. 操作时应注意个人防护，避免接触有害物质和受伤。
4. 实验中的样品处理需严格按照操作规程，以确保样品完整性和纯度。
实验结果与分析：通过以上实验方案，可以获得目标基因的表达水平及相关信号转导通路的调控机制。
实时定量PCR结果可用于定量分析目标基因在不同样本中的表达量的差异。
分子生物学实验的设计与操作技巧
分子生物学实验的设计与操作技巧引言：分子生物学在现代生物科学研究中占据重要的地位，其实验设计和操作技巧的高超与否直接影响研究结果的准确性和可重复性。
本文旨在分享一些分子生物学实验的设计与操作技巧，帮助读者在实验中取得较好的效果。
一、实验前的准备工作1. 设计实验方案：在进行分子生物学实验之前，首先需要明确实验的目的、研究问题和实验流程，并合理安排时间和资源。
2. 准备实验材料和试剂：根据实验方案确定所需的实验材料和试剂，例如DNA/RNA样本、引物、酶切剂、PCR试剂盒等，并确保其质量和储存条件良好。
3. 消毒和清洁：实验前需要对实验台面、仪器设备和实验用具进行消毒和清洁，以防止污染对实验结果的影响。
二、实验设计的要点1. 正、对照组的设置：在进行实验设计时，应考虑设置适当的正、对照组，以验证实验结论的准确性和可靠性。
2. 重复实验的次数：为了保证实验结果的可信度，应尽量增加实验的重复次数，统计分析实验结果的稳定性和可靠性。
3. 实验步骤的顺序和时序：在进行分子生物学实验时，应按照实验步骤的顺序和时序进行操作，确保实验各步骤的顺利进行，避免操作失误和结果偏差。
三、实验操作的技巧1. 分装试剂的技巧：在分装试剂时，应根据需要准确称量，并使用干燥、无污染的试剂瓶和量筒或量管，避免试剂损失或污染。
2. 样本的提取和纯化：样本提取和纯化是分子生物学实验中的重要一步，应选择合适的提取和纯化方法，并注意反应条件的控制和操作技巧的熟练程度，以提高样本的纯度和产量。
3. PCR反应的条件控制：PCR反应是分子生物学实验中常用的方法之一，应合理选择引物的设计和浓度，控制反应的温度、时间和循环次数，避免非特异性扩增或PCR产物的损失。
4. 凝胶电泳的操作技巧：在进行凝胶电泳实验时，应注意凝胶的制备和质量，选择合适的电泳缓冲液，并控制电泳条件，以得到清晰的电泳图谱。
5. 技术操作的规范化：在进行分子生物学实验时，应严格按照操作规范进行，注意实验操作的细节和步骤，避免引入外源污染和操作偏差。
分子生物学实验设计
分子生物学实验设计在分子生物学领域中，实验设计是进行科学研究的关键步骤之一。
良好的实验设计可以确保实验结果的准确性和可重复性，从而为科学研究提供有力的支持。
本文将介绍分子生物学实验设计的基本原则和常用方法，以及一些注意事项。
一、实验目的每个实验都应该有明确的目的，这有助于指导实验设计和实验操作。
在分子生物学实验设计中，实验目的可以是检测特定基因的表达水平、研究蛋白质的功能、分析细胞信号通路等等。
根据实验目的的不同，可以选择合适的实验方法和技术。
二、选择合适的实验模型在分子生物学实验中，常用的实验模型包括细胞系、动物模型和植物模型等。
选择合适的实验模型要考虑实验目的、实验内容和实验可行性等因素。
例如，如果研究某个基因在特定细胞中的表达情况，可以选择合适的细胞系进行研究。
三、合理设计实验组和对照组实验组和对照组是进行比较分析的基本单位。
实验组是接受特定处理或介入干预的样本，而对照组是与实验组相对照的样本，用于比较分析实验结果。
在分子生物学实验设计中，应该根据实验目的和研究问题合理设计实验组和对照组，确保实验结果的可靠性。
四、选择合适的实验方法和技术分子生物学领域有多种实验方法和技术可供选择，例如PCR、Western blot、免疫组化等。
在实验设计中，应该根据实验目的和研究问题选择合适的实验方法和技术。
同时，还需要合理设计实验的控制组和实验参数，以保证实验结果的准确性和可重复性。
五、样本处理和数据分析在分子生物学实验中，样本处理和数据分析是非常重要的步骤。
样本处理应该严格按照实验设计的要求进行，保证实验结果的可信度。
同时，在数据分析过程中，应该选择合适的统计方法和软件工具，对实验结果进行科学的定量分析和解释。
六、安全和伦理考虑分子生物学实验设计不仅需要考虑实验的科学性，还需要考虑实验的安全性和伦理性。
在实验设计过程中，应该注意选择符合伦理规范和安全要求的实验方法和技术，并严格遵守实验室的操作规程和安全规定。
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分子生物学实验设计实验题目：在大肠杆菌中表达绿色荧光基因（EGFP ）学院：生命科学学院专业：生态学教师：吴传芳姓名/学号：余光辉/20 方成/20一、实验目的在大肠杆菌中表达绿色荧光蛋白二、实验流程三、实验试剂、材料及步骤(一)质粒DNA的提取1.原理碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求2.试剂LB培养液:胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast extract）5 g，NaCl 5g，琼脂（固体培养基）15g，用1N NaOH调pH 7.5。
溶液Ⅰ：50mmol/L 葡萄糖，10mmol/ EDTA-Na，25mmol/L Tris-HCl (pH8.0)溶液Ⅱ：0.4mol/L NaOH ，2% SDS临用前1：1配制。
溶液Ⅲ：5mol/L 醋酸钾60ml冰醋酸11.5ml双蒸水28.5ml卡那霉素(20mg/mL)抽提液（饱和酚：氯仿：异戊醇=25：24：1 ）无水乙醇70%乙醇TE缓冲液或ddH2O3.材料含质粒pET-28a和pEGFP-N3菌液1.5ml塑料离心管EP管架微量取液器和取液器吸头常用玻璃器皿4.实验步骤（1）将带有质粒pET-28a和pEGFP-N3的大肠杆菌接种在液体培养基中（加氨苄青霉素50μg/mL），37℃培养过夜（2）取培养菌液1.5mL置Eppendorf小管中，10000rpm×2min，弃上清液（3）加入100μL溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置10 min（4）加入200μL新配制的溶液Ⅱ，轻轻翻转2~3次，使之混匀，冰上放置5 min（5）加入150μL冰冷的溶液Ⅲ，加盖后温和颠倒数次使混匀，产生白色絮状物，冰上放置15 min（6）10000rpm×5 min，取上清液于另一干净的离心管中（7）向上清液中加入等体积（约400μL）酚/氯仿/异戊醇（25:24:1，v/v），振荡混匀，10000rpm ×10 min，将上清液转移至新的离心管中（8）加入等体积（约370μL）氯仿/异戊醇（24:1），混匀，离心2min ,取上清液于新离心管中（9）向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，-200C放置1h（10）12000rpm × 5 min，倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体（11）加0.8mL70%乙醇，离心1 min，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥30min（12）加30μL ddH2O ，-200C保存备用5.注意（1）饱和酚（取下层）单独吸200μL，氯仿：异戊醇（24：1）吸200μL（2）制备质粒过程中，所有操作必须缓和，不要剧烈振荡（特别是加入溶液II 和III ），以避免机械剪切力对DNA的断裂作用(二)DNA琼脂糖凝胶电泳检测1.原理在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、开环DNA 、闭环超螺旋DNA 。
当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA泳动速度：闭环超螺旋〉线状〉开环。
但有时也有也会出现相反情况，因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核酸染料含量有关。
2.试剂Gold view（DNA染料）0.5×TBE缓冲液上样缓冲液（6×）3.材料提取的pEGFP-N3和pET-28a ，琼脂糖，锥形瓶，一次性手套，胶铲，封口膜，剪刀，取液器吸头4.步骤（1）琼脂糖凝胶板的制备：称取0.3g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入30mL0.5×TBE缓冲液，微波炉加热直至琼脂糖溶解。
待胶液冷却到650C（不烫手为宜），加入1μL Gold view混匀，搅拌器上搅拌排除气泡，（如右图）缓慢倒入事先准备的制胶有机玻璃槽（插入样品槽模板梳子）内。
静置30min左右，轻轻晃动拔出梳子。
（2）加样：胶板放入电泳槽中（样品孔位于负极），注入0.5×TBE缓冲液淹没过胶板1mm，用取液器将提取的质粒DNA5μL与1μL Loading Buffer（6×）混匀，加入胶板的样品小槽内（3）电泳：将电泳槽与电泳仪接通，调节电压为100V左右，直至缓冲液的蓝色指示剂移动到距离胶板边沿约1~2cm处，停止电泳（4）观察、拍照：将胶板小心取出，放入凝胶成像系统中，调节位置居中，波长为254nm的紫外灯下，观察凝胶中DNA存在处显示出荧光条带(三)DNA的限制性内切酶酶切1.原理限制性内切酶能识别并切割特异的双链DNA序列，其中：Bam HⅠ切割识别序列后产生的粘性末端：5'⋯ G↓GATCC ⋯3' →5'⋯G GATCC⋯3'3'⋯ CCTAG↑G ⋯5' →3'⋯CCTAG G⋯5'Not I切割识别序列后产生的粘性末端：5'⋯GC↓GGCCGC⋯3'→5'⋯GC GGCCGC⋯3'3'⋯CGCCGG↑CG⋯5'→3'⋯CGCCGG CG⋯5'2.试剂Not I, Bam HI, ddH2O，10×buffer，琼脂糖，Gold view3.材料提取的质粒pEGFP-N3和pET-28a ，0.2mlEP管，取液器吸头，一次性手套4.步骤（1）分别去两支0.2mlEP管做上记号：如①②（（3）将两只EP管混匀后瞬时离心，放入恒温培养箱37℃酶切3h（4）取5μL ①②EP管的酶切反应液，同时取5μL原质粒溶液作对照，进行电泳检测酶切结果（5）按照回收试剂盒步骤切胶回收所需酶切产物片段(四)DNA的连接1.原理ＤＮＡ分子的体外连接就是在一定条件下，由ＤＮＡ连接酶催化两个双链ＤＮＡ片段组邻的５’端磷酸与３’端羟基之间形成磷酸酸脂键的生物化学过程，ＤＮＡ分子的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进行的。
具有相同粘性末端（同种酶切的片段）的DNA分子比较容易连接在一起，因为相同的粘性末端容易通过碱基配对氢键形成一个相对稳定的结构。
2.试剂T4DNA连接酶, ddH2O，T4DNA连接酶buffer3.材料酶切后的EGFP和pET-28a ，0.2mlEP管，取液器吸头，一次性手套4.步骤（X ：Y = 1 : 3～10，用水补足20 μL（2）EP管中液体混匀后瞬时离心，放入培养箱160C反应过夜后，-200C 下保存用于转化(五)重组DNA的转化1.原理细菌处于容易吸收外源DNA的生理状态叫感受态。
转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA分子导入细菌的过程。
其原理是细菌处于00C，在有CaCl2存在的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。
转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经420C短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。
将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型得到表达。
在选择性培养基上进行重组子的鉴定。
2.步骤（1）取出感受态细胞DH5a让其在冰上自然解冻，每200μL解冻的感受态细胞加入整管连接产物，混匀后冰浴30min（2）42℃热冲击60秒，立即置于冰浴5min（3）再在感受态细胞混合物中加入0.8mL的LB培养基，于370C摇床中培养1h（4）1h 后，6000r/min 离心3min，去掉上清（约留200μL的培养液），摇匀菌块（5）用玻璃涂布器将溶液均匀涂布在含Kana的LB固体培养基上，正置培养皿半小时后，37℃培养箱中倒置培养皿过夜（6）观察结果(六)重组子的鉴定提取质粒后，酶切鉴定EGFP(七)菌落PCR技术扩增目的基因片段EGFP1.原理PCR是在生物体外进行的由引物介导的酶促DNA扩增反应，主要有变性—退火—延伸三个步骤组成高温变性-94℃下DNA双链解旋为单链；低温退火-55 ℃左右时，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；中温延伸-72 ℃时，Taq酶以4种dNTP为原料，引物为复制起点，按5′→3′方向，复制模板的互补链。
按此循环（变性—复性—延伸），一般重复25~30次,短时间内，使目的基因片段扩增2n（n代表循环次数）。
2.试剂10×buffer，15 mmol/L MgCl23.材料DNA模板，4×dNTP，T7正反引物，Taq酶，琼脂糖，Marker DNA，吸头4.步骤（1）在0.2mL EP管内配制25μL PCR反应体系1个（2）用灭菌枪头挑单菌落接触EP管内，混匀瞬时离心（3）放入PCR仪中，设置反应程序（4）取9 μL反应液加1 μL10 ×loading Buffer做电泳检测，分析所得目的片段的大小(八)pET-28a-EGFP的表达1.步骤（1）取出感受态细胞BL21让其在冰上自然解冻，每200μL解冻的感受态细胞加入5μL pET-28a-EGFP质粒，混匀后冰浴30min（2）42℃热冲击90秒，立即置于冰浴5min（3）再将感受态细胞混合物转入0.8mL的LB培养基，于37℃摇床中培养1h。
期间将200μL的24mg/ml IPTG涂布在含Kana的LB培养基上，待用（4）1h 后，6000r/min 离心5min，去掉上清（约留200μL的培养液），摇匀菌块（5）用玻璃涂布器将溶液均匀涂布在含IPTG和Kana的LB固体培养基上，正置培养皿半小时后，37℃培养箱中倒置培养皿过夜（6）观察结果(九)感受态细胞的制备1.挑一大肠杆菌单菌落放入3ml LB液体培养基（含Kan+），37℃培养过夜2.活化大肠杆菌：取3ml新鲜的LB液体培养基加入50-150μl的过夜菌，培养2-3个小时3.将昨夜摇出来的DH5α或BL21培养液转入离心管中,冰上放置10min,然后于4℃下4000rpm离心5min4.弃去上清,用预冷的0.1mol/L 的CaCl2溶液600μL轻轻悬浮细胞,冰上放置20min, 4℃下4000rpm离心5min5.弃去上清,加入300μL预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置5min,即成感受态细胞悬液，可-80℃长期保存四、实验仪器恒温摇床，高压灭菌锅，超净工作台，10、100、1000μL微量移液器各一支，台式高速离心机，制冰机，混合漩涡器电泳仪，电泳槽，样品槽模板（梳子），有机玻璃内槽，水平仪，取液器，微波炉，凝胶成像系统。