基因复习题

3酶联免疫吸附测定（ELISA原理：
一抗（primary antibody）:与目标分子的特异结合。
二抗（secondary antibody）：与一抗的特异性结合。
酶连（enzyme-linke）：二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。
（2着丝粒型质粒载体
该型质粒载体是在自主复制型的基础上，增加了酵母染色体有丝分裂稳定序列元件。在细胞分裂时，质粒载体能平均分配到子细胞中，稳定性较高，但拷贝数很低，通常只有1～2个拷贝。
（3酵母人工染色体
该载体在酵母细胞中以线性双链DNA的形式存在，每个细胞内只有单拷贝。
在细胞分裂和遗传过程中，能将染色体载体均匀分配到子细胞中，并保持相对独立和稳定。
3）二抗结合：加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）。
4）显色反应：加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。
5）比色：在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。
ELISA的局限性
有效，但准确性稍差（主要取决于一抗的特异性）。
2）真核生物基因表达系统
1转录是在核内进行的，先生成hnRNA，再加工去掉内含子，外显子相连接，并修饰5′和3′末端后才形成成熟的、有功能的mRNA。
2mRNA只能在细胞质中的核糖体上转译成多肽或蛋白质，再经过加工、糖化，形成高级结构
2原核生物作为基因表达系统的受体细胞所具有的特点：
1原核生物多为单细胞异养，生长快，代谢易于控制，可通过发酵迅速获得大量基因表达产物。
优点：肽疫苗可以诱发很强的细胞反应，持续时间较长，有记忆功能且不需要佐剂。
缺点：某些抗原要制造肽段疫苗有很大困难，要求肽段的构象必须与完整病毒上的抗原决定簇构象一致，选定的单一抗原决定簇必须要有足够强的免疫原性。目前合成肽疫苗的生产成本昂贵，只限于对人和比较珍贵动物危害严重而又无其他安全、有效疫苗的疾病。(
增强其免疫原性的方法：
①调整基因组合使之表达成颗粒性结构
②是在体外加以聚团化，包入脂质体或胶囊微球
③加入有免疫增强作用的化合物作为佐剂（adjuvant）。
2、核酸疫苗（nucleic acid vaccine）
核酸疫苗或称基因疫苗（gene vaccine），指使用能够表达抗原的基因本身，即核酸制成的疫苗。
酶联免疫吸附测定（ELISA）步骤：
①抗体制备（普通抗体、酶标记抗体[一抗、二抗]）
②抗体或抗原的包被(固定在固相载体上）
③免疫反应
④特异性表达产物的检测
具体步骤：
1）固定样品：将待测样品加入96孔微量滴定板（microtiter plate）的孔中，干燥后就被固定在孔底。
2）一抗结合：加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。
2基因组结构简单，便于基因操作和分析。
3多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于构建相应的表达载体。
4生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚。
5不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物无特定的空间构象。
6内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳定。]
3真核细胞表达系统表达外源基因的特点：
真核生物可识别并切除外源基因的内含子，从而表达目的多肽，所以不必向原核细胞表达体系那样从mRNA制备cDNA。2真核基因在真核细胞中表达是，其SD序列与细胞核糖体RNA16S亚基3‘末端的互补程度较高，对于翻译水平的调节有利3在真核细胞内由外源基因表达的蛋白可被糖基化，成为糖蛋白，有利于保持或提高免疫原性4外源基因导入真核细胞表达效率较低，其在染色体DNA上的整合是随机的和自发的，还无法控制整合的位置和适当的拷贝数5真核细胞的培养要求较高，大量生产比较困难，成本较高。
寡聚型外源蛋白：为提高外源蛋白表达量，在构建外源蛋白表达载体时，将多个外源目的蛋白基因串连在一起，克隆在质粒载体上，以这种方式表达的外源蛋白称为寡聚型外源蛋白.
整合型外源蛋白:为防止外源基因随质粒丢失，将要表达的外源基因整合到染色体的非必需编码区上，使之成为染色体结构的一部分而稳定地遗传，以此种方式表达的外源蛋白即为整合型外源蛋白。
优点：①易于制备；②便于保存；③可多次免疫并且容易制成多联多价疫苗。
缺点：①外源核酸是否会整合到染色体中引起癌变；②能否引起免疫病理作用，如自身抗核酸抗体的产生，免疫耐受等。
3、基因缺失活疫苗（gene deleted live vaccine）
基因缺失活疫苗使用分子生物学技术去除与毒力有关的基因获得的缺失突变毒株制成的疫苗。
优点：①有突变性状明确、稳定；②不易返祖、毒力恢复；③是研究安全有效的新型疫苗的重要途径。
缺点：免疫效率、低用量大。
5、蛋白工程疫苗（protein engineering vaccine）
蛋白工程疫苗是指将抗原基因加以改造，使之发生点突变、插入、缺失、构型改变，甚至进行不同基因或部分结构域的人工组合，以期达到增强其产物的免疫原性，扩大反应谱，去除有害作用或副反应的一类疫苗。
（2）(2)需要在真核生物基因的上游加入SD序列.
(3)使用原核生物的强启动子.
(4)如果人工合成某一蛋白质的基因,需要考虑原核生物对密码子的偏爱性.
(5)为了防止原核生物分解目的蛋白可以考虑分泌表达和融合表达等方法.
(6)需要较复杂翻译后加工的蛋白质最好不用原核细胞表达.
信号肽：(signalpeptide)是引导新合成肽链转移到内质网上的一段多肽，一般位于新合成肽链的N端，含有6～15个带正电荷的非极性氨基酸，由于信号肽又是引导肽链进入内质网腔的一段序列，又称开始转移序列(start transfer sequence)。
2um质粒：：一个闭合环状超螺旋DNA分子，长约2um。在酿酒酵母中发现的一种模
拟微生物。可用于研究基因调控、染色体复制的理想系统，也可作为酵母菌转化的有效载体，并组建基因工程菌
YEP质粒：含有酿酒酵母2um质粒和DNA复制有关的部分或全部序列，是一种酵母附加体型质粒。
2基因工程疫苗种类
主要包括基因工程亚单位疫苗，核酸疫苗，基因缺失活疫苗，及蛋白工程疫苗等四种
酵母菌选择标记基因赭石突变抑制基因SUP4表达时菌落呈白色，不表达时呈红色。外源基因的插入可灭活SUP4基因，获得红色的重组转化子。
YAC载体可插入200～800kb的外源基因片段，因而特别适合高等真核生物基因组的克隆与表达研究。
第十一章
1原核细胞表达真核基因的障碍和措施：
障碍：
1细菌RNA聚合酶不能识Байду номын сангаас真和基因的启动子
2酵母基因表达载体
1）自主复制型质粒载体（yeast replicating plasmid，YRP）
该载体含有酵母基因组的DNA复制起始区、选择标记和基因克隆位点等元件，能够在酵母细胞中进行自我复制。
优点：在酵母细胞中的转化效率较高，每个细胞中的拷贝数可达200个。
缺点：经过多代培养后，子细胞中的拷贝数会迅速减少。
1、基因工程亚单位疫苗(gene engineering subunit vaccine)
基因工程亚单位疫苗，主要是指将基因工程表达的蛋白抗原纯化后制成的疫苗。
优点：①产量高；②纯度高；③安全性高；④用于病原体难于培养或有潜在致癌性，或有免疫病理作用的疫苗研究。
缺点：与传统亚单位疫苗相比，免疫效果较差。
2从真和基因转录的mRNA缺乏SD序列，不能结合到核糖核蛋白体上
3真核基因中一般含有内含子，而原核基因缺乏真核细胞的转录后加工系统，不能切除内含子，不能形成成熟的mRNA，不能表达真核蛋白。
4表达的真核蛋白在原核细胞中不稳定，容易被细菌蛋白酶破坏。
措施：
（1）可以通过人工合成的方法或者从cDNA库中获取.
2.不同一限制酶切位点连接：双酶切
优点：
①不必将原有的内切酶失活，可以直接进行重组连接；
②有原有限制性内切酶的重组，载体自连就不会发生，不必用碱性磷酸酶进行处理，从而得到高效连接。
缺点：
同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别
（二）平头末端连接法：常用①同聚物加尾连接②人工接头连接等
第八章
外源DNA片段与载体DNA的重组主要有哪几种方法？各自的优缺点？
（一）黏性末端连接法：.
1同一限制酶切位点连接：单酶切
优点：
黏性末端连接可抑制载体和目的DNA分子的自连，因而可大大提高连接的效率。更重要是不同限制性酶切位点的黏性末端连接可以控制目的DNA和载体DNA的连接方向。
缺点：
载体易自身环化；不易定向克隆；产生串联重组体；难以插入特定的基因；大片段DAN的重组率低，
必须与其他方法一起综合考虑
第十章
外源基因表达系统：泛指目的基因与表达载体重组后，导入合适的受体细胞，并能在其中有效表达，产生目的基因产物（目的蛋白）。
包涵体蛋白：在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地集中在一起形成无膜的裸露结构，这种结构称为包涵体。涵体存在部位：细胞质、细胞周质
融合蛋白：将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但不改变两个基因的阅读框，以这种方式表达的蛋白称为融合蛋白。①稳定性好；②表达效率高；③较易于分离纯化
分泌型外源蛋白:外源基因的表达产物，通过运输或分泌的方式穿过细胞的外膜进入培养基中，即为分泌型外源蛋白.
1基因表达在原核生物与真核生物中的差别和特点：
1）原核生物表达系统
1基因表达是以操纵子的形式进行的。
2当操纵子的调节基因与RNA聚合酶作用时，结构基因则开始转录成相应的mRNA;
3与此同时，mRNA立即与核糖体结合转译出相应的多肽或蛋白质，转录完毕时转译也完成，随之mRNA也被水解掉。
缺点：1效率很低2平头末端连接常常破坏原有的识别性序列3双向插入，由于平头末端没有粘性末端的碱基互补限制，只要是平头末端均能连接，造成插入方向良种可性。4造成多拷贝外源DNA片段插入载体可能性。