3限制性内切酶
限制性内切酶
限制性内切酶限制性内切酶（又称限制酶）首先是在细菌体内发现的，但后来在部分古细菌中也发现了这种成分。
通常，限制性内切酶会切割双链DNA，每个限制性内切酶会识别特定的DNA序列，根据不同的内切酶类型，可在识别序列内或距识别序列不远的位置处切割DNA，识别序列长度通常为4-8bp，酶切之后会形成粘性末端和平末端。
上世纪50年代初期，许多研究团队观测到了噬菌体对于同一物种的不同细菌宿主菌株存在感染效率差异[1,2]，即：使用在一种细菌菌株（例如，大肠杆菌C）内繁殖的噬菌体λ感染同一种类的灵异菌株（例如大肠杆菌K），结果发现，相比于重新感染宿主菌株（大肠杆菌C），大肠杆菌K的感染率出现明显下降。
新的宿主（大肠杆菌K）似乎可以选择性抵御或“耐受”侵入的噬菌体。
研究人员还发现，这一现象并没有遗传性，因为经过一轮感染后，在新菌株中生长的噬菌体还可以以正常的感染率感染该菌株。
这种现象被称为“宿主控制变异”，有关其背后的机制也成为了频繁研究的领域[3]。
直到上世纪60年代，人们才发现宿主变异的机制，其与噬菌体DNA的酶切有关，进而发现并分理出了限制性内切酶。
上世纪60年代初Werner Arber观测发现，宿主范围内的决定性遗传物质都存在于噬菌体DNA中，而后续实验证明甲硫氨酸参与宿主的自我保护[4]。
这些发现最终催生了限制性修饰（R-M）体系的概念，通过该体系，来自于宿主的限制性内切酶和甲基化酶共同作用，切割外来病毒（非甲基化）DNA，同时保护宿主的DNA不受甲基化[5]。
随着DNA连接酶的发现以及位点特异性限制性内切酶的家族不断壮大，重组DNA 技术应运而生。
限制性内切酶的命名规则，考虑到内切酶来源的三种特性——属名、种名和菌株或血清型——组成了一个简短的名称，后面加上罗马数字，代表来自同一菌株的多个限制性内切酶[6]。
例如，以HindⅢ酶为代表：“H”代表Haemophilus“in”代表influenzae“d”代表血清型d“Ⅲ”用于区分来自于Haemophilusinfluenza血清型d的其它限制性内切酶限制性内切酶的分类，根据结构的复杂程度、识别序列、切割位点位置以及辅助因子要求，限制性内切酶分为四类：TypeⅠ：同时具有限制性和甲基化活性的多亚基蛋白需要ATP切割位点与识别位点间的间距不定TypeⅡ：特异性的识别序列切割位点位于识别序列内或邻近识别序列在切割位点生成5＇磷酸基和3＇羟基末端需要M2+TypeⅢ：由两个相反的识别序列组成切割位点与其中一个识别序列的间距恒定需要ATPTypeⅣ：仅切割甲基化的DNA切割位点大约距离识别位点30bp由于自身特殊的特点，TypeⅡ限制性内切酶已经成为分子克隆、法医学DNA分析等许多研究应用最常用的限制性内切酶。
基因工程中常用的三种工具酶
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）1．定义：凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸序列的酶，也称为限制酶（restriction enzyme，RE）。
2．类型：来自原核生物，有三种类型。
Ⅰ型：兼具甲基化修饰和ATP参与的核酸内切酶活性，随机切割。
Ⅱ型：大多能特异识别4～6个核苷酸序列（回文结构），最大识别序列为8个核苷酸，如SfiI、NotI；但有近10种Ⅱ型限制酶的识别序列为非回文结构，如SfaNI、MnlI等，Ⅱ型限制酶均可作为基因工程的工具酶。
另有一些来源不同的限制酶的识别位点是相同的核苷酸序列，将这类酶特称为同工异源酶（isoschizomers）或同裂酶。
同工异源酶切割产生相同的末端；有一些同工异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，故可用来研究DNA 甲基化作用，如SmaI和XmaI；HpaII和MspI；MboI和Sau3AI是成对的同工异源酶；其中HpaII和MspI是一对同工异源酶，其识别位点是CCGG。
与同工异源酶对应的一类限制酶，它们虽然来源各异，识别序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，称为同尾酶（isocaudamers）。
常用的限制酶BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。
显而易见，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。
但必须指出，由两种同尾酶消化产生的粘性末端，重组之后所形成的序列结构再不能被原来的任何一种同尾酶所识别。
Ⅲ型：功能基本同Ⅰ型，但为特定位点切割。
三种限制酶的区别如下表所示：Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型DNA底物dsDNA dsDNA dsDNA辅助因子Mg2+,A TP,SAM Mg2+ Mg2+,A TP识别序列特异特异特异切割位点非特定（于识别序列前后100~1000bp范围之内）特定（切割于识别序列之中或近处，固定位点）特定（切割点在识别序列后25~75bp处）与甲基化作用的关系内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用酶蛋白不具有甲基化作用内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用3．命名：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株。
二、限制性内切酶的类型II类限制性内切酶III类限制性内切酶首先由M.
（3）粘性末端（sticky ends，cohensive ends） 含有几个核苷酸单链的末端。 分两种类型：
① 5’端凸出（如EcoR I切点） 5’3’5’3’GAATTC CTTAAG
G AATTC CTTAA G
-3’ -5’
-3’ -5’
② 3’端凸出（如Pst I切点）
5’3’CTGCAG GACGTC -3’ -5’
A 用于核酸操作的工具酶
Enzymes
限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 DNA修饰酶 核酸外切酶 单链DNA内切酶
第一节 限制性核酸内切酶
一、限制性核酸内切酶
（Restriction endonuclease） 是一类能够识别双链DNA分子中的某 种特定核苷酸序列（4—8bp），并由 此处切割DNA双链的核酸内切酶。
U代表嘌呤；Y代表嘧啶。
Sau 3A 5’-GATC----3’ 3’----CTAG-5’ 同尾酶的粘性末端互相结合后形成的 新位点一般不能再被原来的酶识别。 GATCT3’ 5’ -G BamH I Bgl Ⅱ A-5’ 3’-CCTAG 5’-GGATCT-3’ Bgl Ⅱ 3’-CCTAGA-5’ Sau 3A
？
BamH I
（7）限制酶的酶活性
限制性内切酶的识别和酶切活性一般在 一定的温度、离子强度、pH等条件下才 表现最佳切割能力和位点的专一性。
所以一般使用专一的反应缓冲液。 ① 星号（*）活性 如果改变反应条件就会影响酶的专一性 和切割效率，称为星号（*）活性。
限制性核酸内切酶
II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作 II 型核酸内切酶的多酶联合酶解： 对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法： 使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解 低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切 一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切 0.1倍体积的 5 M NaAc pH 5.4 2.5倍体积的冰冷乙醇
限制性核酸内切酶与核酸内切酶、外切酶
限制性核酸内切酶百科名片其3′→5′外切酶活性使双链DNA分子产生出单链区，经过这种修饰的DNA 再配合使用Klenow酶，同时加进带放射性同位素的核苷酸，便可以制备特异性的放射性探针。
核酸内切酶核酸内切酶（endonuclease）在核酸水解酶中，为可水解分子链内部磷酸二酯键生成寡核苷酸的酶，与核酸外切酶相对应。
从对底物的特异性来看，可分为DNaseⅠ、DNaseⅡ等仅分解DNA的酶；脾脏RNase、RNaseT1等仅分解RNA的酶。
如链孢霉（Neurospora）的核酸酶就是既分解DNA又分解RNA的酶。
一般来说，大都不具碱基特异性，但也有诸如脾脏RNase、RNaseT1等或限制性内切酶那种能够识别并切断特定的碱基或碱基序列的酶。
[1]寡核苷酸，是一类只有20个以下碱基对的短链核苷酸的总称（包括脱氧核糖核酸DNA或核糖核酸RNA内的核苷酸），寡核苷酸可以很容易地和它们的互补对链接，所以常用来作为探针确定DNA或RNA的结构，经常用于基因芯片、电泳、荧光原位杂交等过程中。
RNA聚合酶科技名词定义中文名称：RNA聚合酶英文名称：RNA polymerase定义1：以一条DNA链或RNA链为模板催化由核苷-5′-三磷酸合成RNA的酶。
所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；酶（二级学科）定义2：以一条DNA链或RNA链为模板催化由核苷-5′-三磷酸合成RNA的酶。
所属学科：细胞生物学（一级学科）；细胞遗传（二级学科）定义3：以DNA或RNA为模板合成RNA的酶。
所属学科：遗传学（一级学科）；分子遗传学（二级学科）本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布RNA聚合酶（RNA polymerase）:以一条DNA链或RNA为模板催化由核苷-5′-三磷酸合成RNA的酶。
是催化以DNA为模板（template）、三磷酸核糖核苷为底物、通过磷酸二酯键而聚合的合成RNA的酶。
因为在细胞内与基因DNA的遗传信息转录为RNA有关，所以也称转录酶。
限制性内切酶酶切位点汇总
限制性内切酶酶切位点汇总限制性内切酶（Restriction Endonuclease）是一类存在于细菌体内的酶，它能够识别特定的酶切位点，并在该位点上切割DNA链。
限制性内切酶起源于细菌，原本作为细菌对抗噬菌体感染的防御机制，但现在被广泛应用于分子生物学和基因工程领域。
限制性内切酶的分类和命名依据它们发现的第一个类型的噬菌体。
如EcoRI是从大肠杆菌中分离出的内切酶，与T4噬菌体相关；HindIII是与T4噬菌体有关的内切酶等。
酶名中的缩写首字母通常是酶切位点的首字母，比如EcoRI是指E.coli的RY粘性末端的切点。
现在限制性内切酶已被发现有超过3000多个类型。
下面是一些常见的限制性内切酶的切割位点汇总：1. EcoRI：切割位点为G↓AATTC（↓表示切割位点），产生的切割后的两个DNA片段是G-AATTC和CTTAA-G。
2. HindIII：切割位点为A↓AGCTT，产生的切割后的两个DNA片段是A-AGCTT和TTCGA-A。
3. SmaI：切割位点为CCC↓GGG，产生的切割后的两个DNA片段是CCC-GGG和GGG-CCC。
4. BamHI：切割位点为G↓GATCC，产生的切割后的两个DNA片段是G-GATCC和CCTAG-G。
5. XhoI：切割位点为C↓TCGAG，产生的切割后的两个DNA片段是C-TCGAG和GAGCT-C。
6. NotI：切割位点为GC×GGCCGC，产生的切割后的两个DNA片段是GC-GGCCGC和CGC-GC。
7. EcoRV：切割位点为GAT↓ATC，产生的切割后的两个DNA片段是GAT-ATC和TAC-TAG。
8. KpnI：切割位点为GGTAC↓C，产生的切割后的两个DNA片段是GGTAC-C和CCATG-G。
9. SalI：切割位点为G↓TCGAC，产生的切割后的两个DNA片段是G-TCGAC和CAGCT-G。
10. PstI：切割位点为CTGCA↓G，产生的切割后的两个DNA片段是CTGC-AG和GACG-T。
限制性核酸内切酶
2. DNA的甲基化程度
大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒 dam甲基化酶（修饰GATC中的A）； dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。
基因工程中必须使用甲基化酶失活突变 的菌株。
3. 温度
齐平末端：在识别序列内的对称轴上切割，其 切割产物具平头末端（不易重新连接）。
粘性末端：在识别序列2条链对应位上错位切割， 有5’端突出的粘性末端和3’端突出的粘性末端。
粘性末端的意义：粘性末端突出的单链部分可以与相同的酶或 同尾酶切割得到的粘性末端的单链部分互补配对。
粘性末端和平齐末端的动画对比
四 限制性内切酶的识别序列
• EcoRⅠ的识别序列 GAATTC
•
CTTAAG
• Hind Ⅲ的识别序列 AAGCTT
•
TTCGAA
• BamHⅠ的识别序列 GCATCC
•
CCTAGG
• 从以上举例的各种限制性酶切酶的识别序列看出， 它们具有共同的规律性，呈旋转对称或二重互补 对称。
• 有的限制性酶切酶可识别两种以上的核酸 序列。
不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大 多数是37oC，少数要求40-65oC。
酶
最适 温度oC
酶
最适 温度oC
酶
Apa I 30 Apy I 30 Ban I Bcl I 50 BstE II 60 Mae I Mae II 50 Mae III 55 Sma I Taq I 65
最适 温度 oC
特性
限制和修饰活 性
内切酶的蛋白 结构
I类内切酶 单一多功能的酶 3种不同的亚基
三酶切和单酶切
三酶切和单酶切摘要：1.三酶切和单酶切的概念2.三酶切的原理和过程3.单酶切的原理和过程4.三酶切和单酶切的优缺点比较5.在实际应用中的选择正文：三酶切和单酶切是分子生物学中常用的两种酶切技术。
它们的主要区别在于所使用的酶的种类。
三酶切是指同时使用三种不同的限制性内切酶进行切割，而单酶切则只使用一种限制性内切酶。
这两种技术都可以用于DNA 分子的切割和连接，但具体应用时需要根据实验需求和条件来选择合适的技术。
三酶切技术的主要原理是利用三种不同种类的限制性内切酶识别并切割DNA 分子的不同序列，形成特定的切口。
通过设计三种酶的切割位点，可以实现精确的DNA 片段切割。
在实际操作过程中，首先将三种酶混合在一起，然后将混合酶与待切割的DNA 分子一起温育。
在酶的作用下，DNA 分子被切割成特定大小的片段。
接下来，通过电泳或离心等方法将切割后的DNA 片段分离开来。
最后，将所需的DNA 片段重新连接起来，进行后续实验。
单酶切技术则是利用一种限制性内切酶对DNA 分子进行切割。
这种技术相对简单，操作过程与三酶切类似，但只需使用一种酶。
通过设计酶的切割位点，可以获得特定大小的DNA 片段。
单酶切技术的优点是操作简便，酶的来源和性质相对单一，实验条件相对容易控制。
但缺点是切割位点有限，可能无法满足某些特定实验需求。
在优缺点比较方面，三酶切技术具有更高的切割准确性和灵活性，可以实现更复杂的切割位点设计。
但同时，操作过程相对复杂，可能需要更长的实验时间和更多的实验技巧。
单酶切技术操作简便，实验条件易于控制，但切割位点有限，可能无法满足某些特定实验需求。
在实际应用中，选择三酶切还是单酶切技术取决于实验的具体需求和条件。
如果需要进行复杂的切割位点设计或对切割效果要求较高，可以选择三酶切技术。
如果实验条件有限，或对切割效果要求相对较低，可以选择单酶切技术。
限制性内切酶名词解释
限制性内切酶名词解释限制性内切酶（Restriction enzyme）是一类由细菌产生的酶，主要作用是切割DNA分子特定的酶切位点。
限制性内切酶在遗传工程和分子生物学研究中被广泛应用，能够将长的DNA 分子切割成特定大小的片段，从而使得研究者能够更好地研究和操作DNA。
限制性内切酶的发现和研究起源于1970年代。
当时，研究人员发现一些特定的细菌能够产生一种奇特的酶，它对DNA分子具有特异性的切割作用。
这种切割作用通常发生在特定的核苷酸序列上，被称为酶切位点或限制性位点。
每个限制性内切酶所识别和切割的酶切位点都有其独特的序列特征，并且有许多不同类型的限制性内切酶，如EcoRI、BamHI、HindIII等。
限制性内切酶的酶切作用是通过切割DNA分子的磷酸二酯键来实现的。
酶在酶切位点附近结合DNA分子，然后通过水解反应切割两股DNA的骨架，形成切割产物。
限制性内切酶的切割位置对两股DNA是对称的，意味着切割产物的两端都有一小段单链的“黏性末端”。
这种黏性末端的单链序列是由酶切位点的一部分序列决定的，如EcoRI酶切产生的末端序列是5'-GAATTC-3'。
黏性末端可以与其他黏性末端互补配对，形成DNA双链的黏性连接。
这种黏性连接有助于分子生物学研究者将DNA分子重新连在一起，或者将不同的DNA分子连接在一起，从而构建新的DNA分子。
限制性内切酶的应用非常广泛。
一方面，通过限制性内切酶的切割作用，可以将长的DNA分子切割成小片段，从而方便进行测序、克隆和分析。
另一方面，限制性内切酶可以用于DNA重组和基因工程。
研究人员可以利用黏性末端的互补配对原理，将不同的DNA片段连在一起，构建新的DNA分子，例如将外源基因插入到质粒中，形成重组DNA分子。
此外，限制性内切酶还可以用于DNA分子的鉴定和分析，例如通过切割产物的大小和形态来鉴定特定的DNA序列。
总之，限制性内切酶是一种重要的分子工具，广泛应用于分子生物学研究、遗传工程和基因工程等领域。
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２．将反应体系充分混匀，并于台式离心 机上短暂离心。 ３．Eppendorf管于３７℃水管中反应1小 时。 ４．反应结束后加入2μl的6XLoading buffer 以终止反应。 ５．混匀后0.8％琼脂糖凝胶上60伏电泳２ 小时。
３．反应缓冲液：
反应缓冲液主要由Tris· HCl、NaCl、Mg2+组成， 其中Mg2+为内切酶辅基； Tris· HCl维持反应体系pH值在7.2-7.6之间； NaCl浓度不同形成３种级别的离子强度： 低盐（10mM NaCl) 中盐（50mM NaCl） 高盐（100mM NaCl） 不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。
４．酶解温度与时间：
大多数限制酶反应温度为３７℃，如 EcoRⅠ, HindⅢ, BamHⅠ, PstⅠ等，也有 如BclⅠ需在５０℃下进行反应， 反应时间根据酶的单位与ＤＮＡ用量之比 来定，原则是酶：ＤＮＡ=２－３：１ ２小时即可，充分酶解。
实验方法
１．按下表分别加入各试剂（注意限制性 内切酶最后加入且在冰上操作）于 Eppendorf管中。 DNA 5μl 10×buffer 1μl 无菌水 3.5μl 内切酶 0.5μl 总体积： 10μl
酶切反应中应注意以下几个问题：
１．内切酶： 不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染； 注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端； 内切酶的用量 根据内切酶单位和ＤＮＡ用量而定，通常 1u指在适当条件下，1小时内完全酶解１ug特定ＤＮＡ底 物所需要的限制性内切酶量，使用中一般以１ug DNA对 ２－３u酶短时间为宜。 同时内切酶体积不能超过反应体系１０％，因内切酶中含 ５０％甘油，体系中甘油超过５％会抑制内切酶活力； 使用时防止操作中对内切酶的污染。
２．ＤＮＡ：
作为内切酶底物，ＤＮＡ应该具备一定的 纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、 SDS、EDTA、高盐浓度、酒精等，这些因 素的存在均不同程度影响限制性内切酶的 活力。 这种抑制可通过： 增加酶作用单位数（10~20U/ug DNA）、 增大反应体积以稀释可能的抑一类能识别双链ＤＮ Ａ中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶 都是从原核生物中发现，它们的功能犹似 高等动物的免疫系统， 用于抗击外来ＤＮ Ａ的侵袭。 限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的 磷酸二酯键， 产生的ＤＮＡ片段５’端为 Ｐ，３’端为ＯＨ。
限制酶的类型
根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具 有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。 Ⅰ类和Ⅲ类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼 有甲基化作用及依赖ATP的限制性内切酶活性。 Ⅰ类限制性内切酶结合于特定识别位点，且没有 特定的切割位点，酶对其识别位点进行随机切割， 很难形成稳定的特异性切割末端。 Ⅲ类限制性内切酶在识别位点上切割，然后从底 物上解离下来。 故Ⅰ类和Ⅲ类酶在基因工程中基本不用。
Ⅱ型酶
Ⅱ型酶就是通常指的ＤＮＡ限制性内切酶. 它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序，并在这个顺序内进 行切割，产生特异的ＤＮＡ片段； Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子， 识别顺序一般为４～６个碱基对的反转重复顺序； Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’ 端突出；３’端突出和平末端。 正是得益于限制性的内切酶的发现和应用， 才使得人们 能在体外有目的地对遗传物质ＤＮＡ进行改造，从而极大 地推动了分子生物学的兴旺和发展。