细胞原生质体的制备
原生质体制备中mes的作用
原生质体制备中mes的作用
原生质体是由细胞膜包裹的细胞质，是一种非常重要的细胞结构。
在原生质体制备过程中，mes (2-(N-甲基氨基)乙磺酸)是一种常用的缓冲剂，它对原生质体的制备起到了重要的作用。
首先，mes可以调节原生质体内的pH值。
在制备原生质体的过
程中，由于涉及到细胞膜的溶解和离子的释放，pH值的变化会对原
生质体的稳定性造成影响。
mes作为一种缓冲剂，可以维持溶液的稳定性，防止pH值的波动，保证原生质体的制备质量。
其次，mes还可以提高原生质体的渗透性。
在原生质体制备过程中，需要利用高渗透压溶液来破坏细胞膜，使细胞质释放出来。
而mes可以与高渗透压溶液配合使用，增强溶液的渗透性，使细胞质更容易被释放出来，从而提高原生质体制备的效率。
此外，mes还可以保持原生质体的结构完整性。
在制备原生质体的过程中，细胞膜的破坏和蛋白质的变性会对原生质体的结构造成影响，从而影响其功能。
mes作为一种缓冲剂，可以在一定程度上保持蛋白质的构象和稳定性，从而保证原生质体的结构完整性和功能性。
综上所述，mes在原生质体制备中起到了多种重要的作用，包括调节pH值、提高渗透性和保持结构完整性。
因此，在进行原生质体
制备时，使用mes是非常必要的。
- 1 -。
微生物原生质体制备及再生的影响因素
文章篇号:1007-2764(2006)03-0263-093微生物原生质体制备及再生的影响因素谭文辉，李燕萍，许杨（南昌大学中德联合研究院 食品科学教育部重点实验室，江西南昌 330047） 摘要：原生质体的制备及再生，是原生质体技术的前提和基础。
本文较全面地介绍了影响微生物原生质体制备及再生的因素，以期在原生质体形成和再生的最佳条件下制备原生质体，为进一步实验打下良好的基础。
关键词：原生质体；制备；再生Factors Affect the Formation and Regeneration of Protoplasts ofMicroorganismTan Wen-hui, Li Y an-ping, Xu Y ang(The Key Laboratory of Food Science of Ministry of Education (Nanchang University); Sino-Germany Joint ResearchInstitute, Nanchang 330047, China)Abstract: Formation and regeneration of protoplasts is the precondition and foundation of protoplasts technology. The factors that affect the formation and regeneration of protoplasts from microorganism were investigated to find the optimum condition of formation and regeneration of protoplasts. It is important to make the good foundation for further research.Keywords: Protoplasts; Formation; Regeneration原生质是有组织的生活物质，是细胞生命活动的物质基础，所有的原生质有相似的基本组成成分和特性。
植物细胞原生质体制备方法
2. 取洗净擦干后并去除叶梗和粗脉的 100-200mg 鲜嫩植物组织样本用手术剪刀尽可能 剪碎，加入 500ul 提取液 A 充分混匀。
【注】： 加入提取液 A 后可以用匀浆机/匀浆器适当匀浆处理。
wwwΒιβλιοθήκη
-2-
咨询邮箱：bestbio@ 电话：021-33921235
400-8363-211
本产品仅供科学研究使用！请勿用于临床、诊断、食品、化妆品检测等用途！
产品说明书
培养细胞 1000g 条件下离心 5 分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞后用 PBS 洗 涤 2 次，然后直接加入提取液 A 重悬。
V2.16
BB-3621-1 50T 50ml 500ul 50ml 1
BB-3621-2 100T 100ml 1000ul 100ml 1
组份编号
36210A 36210B 36210C
※ ※ ※ 使用前请仔细阅读产品说明书 ※ ※ ※
使用限制： 本试剂盒仅供科学研究使用，不可用于诊断或治疗。
产品更新： 贝博会更新或升级产品，以优化和增强其使用性能，产品说明书会进行相应的 版本更新。使用产品时，只能参照随产品附带的说明书，不能参照网上下载的 说明书，可能是不同的版本。 需要最新电子版说明书时可以在收到产品后发邮件索取。
产品号 BB-3108 BB-3103 BB-3106 BB-3401 BB-3154 BB-3151 BB-3124 BB-3152 BB-3301 BB-3127 BB-3311 BB-3182 BB-3185 BB-3191
-3-
原生质体的制备
原生质体的制备
目的要求
掌握植物原生质体的分离制备
技术，观察原生质体的形态。
实验原理
分离原生质体常采用酶解法。其原理是根据由
纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶配制而成的溶液对
细胞壁成分的降解作用，而使原生质体释放出来。 原生质体的产率和活力与材料来源、生理状态、酶 液的组成、以及原生质体收集方法有关。酶液通常 需要保持较高的渗透压，以使原生质体在分离前细
胞处于质壁分离状态，分离后不致膨胀破裂。渗透
剂常用甘露醇，山梨醇，葡萄糖或蔗糖。酶液中还 应含一定量的钙离子，来稳定原生质膜。游离出来
的原生质体可用过筛法收集。
实验用品
一、 材料
菠菜 二、器材
显微镜，擦镜纸，剪子，镊子，小平皿，吸管四 支，直式漏斗，300目尼龙网，10ml离心管，载 玻片，盖玻片。
三、试剂 1.洗涤液：甘露醇 0.6 M；CaCl2·2H2O 8 mM
NaH2PO4·H2O 2 Mm，pH 5.6
2.酶液：
实验方法
1、酶液的制备 2、材料准备 3、酶解
4、洗涤
观
察
纯 化 后 的 原 生 质 体
胚性愈伤组织亦是原生 质体分离的主要材料
思考题1、何为原生质体 Nhomakorabea2、分离得到的原生质体可有哪些用途？
3、为什么酶解材料时，酶解液要保持较 高的渗透压？
原生质体制备
原生质体的制备：1、选取3-4周长势良好的植株的展开叶片（通常选取第5~7片真叶）。
2、用新的锋利的刀子从叶片的中部切0.5-1 mm叶条，比较理想的情况下，每克新鲜叶片中大约含有107个原生质体（大约100-150个叶条在5-10 ml酶溶液中消化）。
对于常规实验，10-20个叶条消化在5-10 ml酶溶液中将得到0.5-1×106个原生质体，足够25-100个样品使用。
3、快速而温柔的转移叶条到准备好的酶溶液中（10-20叶条在5-10 ml酶液中），用平头镊子将叶条完全淹没。
4、用真空泵将叶条在黑暗中真空30 min。
5、室温下在黑暗中至少消化3 h（继续消化，不要摇晃）。
经过轻微转动后酶溶液应该变成绿色，这表明原生质体已经被释放。
6、用显微镜检查原生质体的释放（拟南芥叶肉的原生质体的大小大约为30-50μm）。
7、用等体积的W5溶液稀释酶溶液，通过过滤去除没有消化的叶片组织。
8、用水洗去75 μm尼龙过滤器中的酒精（通常浸泡在95%乙醇中）并去除过量的水，用W5溶液润洗过滤器后过滤原生质体。
9、将原生质体溶液转移到30 mL圆底离心管中，100×g离心5 min，尽可能的去除上清液。
10、用计数板进行细胞计数，每2×105个原生质体加入1 mL W5溶液，在冰，上静置30 min。
11、室温下沉降原生质体15 min，去除W5溶液，每2×105个原生质体加入1 mL MMG溶液重悬浮。
12、在2 mL离心管中分别加入10 mL DNA（5-10 kb的质粒DNA 10-20 mg）和100 mL原生质体（2×104个原生质体细胞），轻轻混匀。
13、加入110 mL PEG溶液，轻弹试管完全混匀。
14、室温下孵育转染混合物15 min（反应5 min足够）。
15、室温下，用400-440 mL W5溶液稀释转染混合物，轻轻摇动或倒置离心管混匀来停止转染过程。
原生质体融合操作方法
原生质体融合操作方法
原生质体融合是将两个或更多的细胞融合在一起，以形成单一的细胞。
在实验室中，原生质体融合可用于合成杂交细胞或研究细胞膜蛋白质交互作用。
以下是一种常用的原生质体融合操作方法：
1. 制备原生质体：收获新鲜的植物细胞并环绕其周围的细胞壁。
用酶类解除细胞壁以获得原生质体。
2. 制备混合物：在离心管中将两种原生质体混合并加入缓冲液。
3. 让细胞融合：通过高渗透压或电脉冲使膜破裂或局部破损，让细胞形成互通。
4. 分离融合物：将融合物分离出来，并放在一个合适的培养基上培养。
5. 检测融合结果：使用显微镜观察细胞是否真正融合，或使用特定的抗体标记来检测融合后的细胞表面分子。
需要注意的是，原生质体融合需要谨慎操作，避免损坏细胞结构或引入杂质。
在实验中，需要仔细选择不同类型的原生质体，以确保它们能够融合。
原生质体制备的原理
原生质体制备的原理原生质体啊，简单来说，就是把植物或者微生物细胞外面那层细胞壁给去掉之后剩下的部分。
那为啥要去掉细胞壁来制备原生质体呢？这就像给细胞做了个“脱壳手术”，让细胞变得更“赤裸裸”，这样就方便我们对细胞进行各种研究啦。
对于植物细胞来说，细胞壁是由纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的。
就像一个坚固的小房子，把细胞里的原生质给围在里面。
那怎么把这“小房子”拆掉呢？这就用到了一些特殊的酶。
比如说纤维素酶，它就像一个小小的拆迁队队员，专门针对细胞壁里的纤维素，把纤维素的化学键给切断。
还有果胶酶呢，它也没闲着，负责把果胶分解掉。
这俩酶就这么齐心协力，一点一点地把细胞壁给瓦解掉，原生质体就被释放出来啦。
微生物细胞也类似哦。
不过微生物的细胞壁成分和植物不太一样。
像细菌的细胞壁有肽聚糖，这时候就需要用溶菌酶这样的酶来对付它。
溶菌酶就像一个精准的小剪刀，找到肽聚糖里合适的地方，“咔嚓”一下剪断化学键，细胞壁就开始破掉啦。
原生质体的制备啊，还有很多小讲究呢。
比如说酶的浓度很重要。
如果酶的浓度太低，就像拆迁队的人手不够，拆细胞壁拆得慢吞吞的，效率特别低。
可要是酶的浓度太高呢，就有点像一群莽撞的工人，可能会对原生质体本身造成伤害，把原生质体里面的一些重要结构也给破坏掉了，这可就不好了。
温度也是个关键因素。
就像人干活的时候，温度合适干活才舒服。
对于酶来说也是一样的，不同的酶有它最适宜的工作温度。
在这个温度下，酶的活性最高，拆细胞壁的速度最快，效果也最好。
要是温度不合适，酶可能就会偷懒，不好好干活啦。
而且啊，制备原生质体的时候，还得注意渗透压。
细胞里面是有一定渗透压的，当把细胞壁去掉之后，如果外面的渗透压不合适，原生质体就会像一个被捏扁或者胀大的气球一样。
要是外面的溶液浓度太高，原生质体里的水就会被吸出去，原生质体就会皱缩起来；要是外面溶液浓度太低，水就会大量涌进原生质体，原生质体就可能会胀破。
所以得找到合适的渗透压条件，让原生质体能够舒舒服服地待着。
分离原生质体的方法
分离原生质体的方法分离原生质体是一项关键的细胞学实验技术，用于研究和分析细胞的细胞器和细胞内组分。
原生质体是细胞的一种重要组成部分，包含遗传物质和细胞器，通过分离原生质体可以获得纯度较高的细胞器制备，以便于进一步的研究和分析。
以下是一些常用的分离原生质体的方法：1. 离心法（Centrifugation）：离心法是一种基于细胞器的密度差异将原生质体分离的方法。
通过不同离心速度的离心，可以分离得到不同密度的细胞器。
一般而言，较低速度的离心可以分离细胞核，较高速度的离心可以分离线粒体、质膜、内质网和液泡等细胞器。
2. 亲和纯化法（Affinity purification）：亲和纯化法是利用具有特异性结合配体（例如抗体或亲和标签）的纯化基质与目标细胞器结合，然后通过洗脱的方法分离纯化的细胞器。
这种方法可以根据特定的目标进行选择性分离，例如可以使用标记的抗体选择性地分离细胞核。
3. 差速离心法（Differential centrifugation）：差速离心法是通过逐渐增加离心速度来分离原生质体。
通过一系列不同的离心步骤，每一步离心都可以沉淀出具有不同密度或大小的细胞器。
比如，通过设定不同的离心速度和离心时间，可以分离得到细胞核、线粒体、质膜等不同细胞器。
4. 密度梯度离心法（Density gradient centrifugation）：密度梯度离心法是利用密度差异来分离细胞器的方法。
在浓度梯度离心管中，将样品与浓缩的梯度液体混合，然后通过离心速度离心，细胞器会在离心过程中在不同浓度的梯度位置沉淀。
这种方法通常用于分离线粒体、质膜、内质网等细胞器。
5. 超声破碎法（Ultrasonication）：超声破碎法是利用超声波的物理效应来破碎细胞，释放原生质体和细胞器。
首先，通过用缓冲液浸泡细胞进行振荡，然后应用超声波破坏细胞膜，释放细胞器。
这种方法操作简单，对细胞器的纯度较高。
6. 自由流电泳法（Free-flow electrophoresis）：自由流电泳法是一种电泳分离的技术，通过应用电场来在细胞液中分离细胞器。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
细胞原生质体的制备
—植物原生质体分离和活性鉴定
一、实验目的
1.学习植物细胞原生质体分离纯化的方法。
2.了解原生质体活性鉴定的原理。
3.了解植物原生质体分离、融合和培养的基本原理及其过程
二、实验原理
去掉植物细胞壁的方法可以是机械的人工操作，也可以利用酶解法。
较早利用机械法制备原生质体的
酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁，即可得到原生质体。
由于原生质体内部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜，必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性。
其次，还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响。
测定原生质体的活性有多种方法。
荧光素双醋酸酯(FDA)染色是常用的一种方法，FAD 本身无荧光，无极性，可透过完整的原生质膜。
一旦进入原生质体后，由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。
它不能自由出入原生质膜，因此有活力的细胞能产生荧光，无活力的原生质体不能分解FAD无荧光产生。
PEG作为一种高分子化合物，20～50％的浓度能对原生质体产生瞬间
冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连，随后用高Ca高pH法进行清洗．使原生质体融合得以完成。
PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够长时，可阼为邻近原生质表面之间的分子桥而使之粘连。
PEG也能连接Ca2+等阳离子，Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。
在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱．这样将引起电荷的紊乱和再分布．从而引起原生质体融合：高Ca高pH由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高了融合频率，洗涤时的渗透压冲击对融合也可能起作用。
原生质体分离纯化或融合后，在适当的培养基上应用合适的培养方法，能够再生细胞壁，并启动细胞持续分裂，直至形成细胞团，长成愈伤组织或胚状体，再分化发育成苗。
其中，选择合适的培养基及培养方法是原生质体培养中最基础也是最关键的环节。
三、实验用品
1．材料：绿豆，烟草幼苗叶片，油菜或菠菜或烟草等。
2．试剂：
酶解液(绿豆)：1%(W/V) 纤维素酶，1% (W/V)果胶酶，0.7mol/L 甘露醇;10mmol/L CaCl，2.2H2O，0.7mmol/L KH2PO4，pH 6.8～
7.0。
13%CPW洗涤液(绿豆)：27.2mg/L KH2PO4，101.0 mg/L KNO3，
1480.0mg/LCaCl，2.2 H2O，246.0 mg/L MgSO4，0.16 mg/L KI，
0.025 mg/L CuSO4·5H2O，13%(W/V)甘露醇，pH 6.0。
0.1％2-N-吗啡啉乙磺酸钠或三羟甲基氨基甲烷溶液：内含20％
蔗糖，pH6.0。
0.02%二乙基荧光素(FDA):5mgFDA溶于1ml丙酮中，避光4℃下
贮存，使用时取0.22mlFDA贮存液加入5ml0.65mol/L甘露醇中.
使用时，使最终浓度为0.01%。
20%蔗糖溶液
无菌蒸馏水。
3．仪器：摇床，离心机，倒置显微镜，普通显微镜，超净工作台，培养皿，离心管，载玻片，刀片，镊子，过滤漏斗，200目筛网，吸管，高压蒸汽，消毒锅，镊子，解剖刀。
四、实验方法步骤
1. 分离原生质体——绿豆幼苗下胚轴：
(1) 绿豆种子用70%乙醇消毒，自来水流水浸泡4h左右，于湿滤纸上萌发。
25℃黑暗中培养约60h。
取幼苗下胚轴或根为材料进行分离原生质体。
(2) 取黄化幼苗下胚轴2～3g，从弯钩下3mm处向下切取约5mm的切段，切成0.5mm的薄片置于10 ml酶解液中(也可以取1 cm左右的绿豆幼苗的根尖作为实验材料，直接置于酶解液中)。
置于摇床上，25～28℃，60～70r/min，酶解6～7h。
(3) 用200目筛网过滤酶解液(制一张装片，观察)，滤液经1000rpm
离心5min，弃去上清液。
(4) 用3～4ml13%CPW液洗涤并溶解沉淀，悬液经1000rpm离心5min，留1ml上清液，其余弃之。
(5) 取10ml离心管1支，注入3ml20%～25%蔗糖，将沉淀的原生质体悬浮，用滴管吸出悬液小心地铺于蔗糖溶液上，1000rpm离心5～8min，将位于中间一层的原生质体用吸管小心吸出至另一离心管中，沉淀制一张装片，观察。
(6) 用13% CPW液洗涤1～2次，每次1000rpm离心5min，得到较为纯净的原生质体。
用13% CPW液悬浮至一定密度并制一张装片，观察。
(7) 取1滴原生质体提取液在载玻片上，加入相同体积的0.02%FDA 稀释液，静置2min 后，于荧光显微镜下观察，发绿色荧光的为有活力的原生质体，没有产生荧光的原生质体无活力。
(8)将1-2滴原生质体混合物（密度分别为105一106/ml）滴入小培养皿，静置8—10分钟。
相对方向加入2滴40％的PEG溶液，静置10分钟，依次间隔5分钟加入0.5ml、1 ml和2 ml含13％甘露醇的CPW洗液洗涤，注意在第二、三次洗液加入前，用移液器轻轻吸走部分溶液，但不能吸干，否则原生质体破碎死亡；最后用液体培养基洗l一2次即可进行培养：
(9)培养
将原生质体或融合体悬液铺于愈伤组织诱导培养基（固体）上进行浅
层培养，在温度25±2℃，光照度1000Lx,光照14～16h/d 的条件下培养，经1-2个月后在培养基上出现肉眼可见的细胞团。
细胞团长到2～4mm左右，即可转移到分化培养基上，诱导分化芽和根，长成小植株。
3、收集纯化
（1）用吸管将酶解液吸至5mL离心管中，以600rpm离心5分钟以上，使原生质体沉降
（2）将上清（酶解液）回收，剩下原生质体及残渣于管底
（3）加氯化钙液约2mL，轻轻吹打均匀
（4）用注射器向离心管底部缓缓注入蔗糖约2—3mL，出现下部蔗糖液，上部原生质体悬浮液
（5）以600rpm离心10分钟，在两液相之间出现一条绿色带，便是纯净的原生质体
4、观察或培养。