6 分子生物学组
分子生物学实验技术实验内容讲解
2006年《分子生物学实验技术》实验内容一、RT-PCR（一）总RNA的提取实验安排：每两人抽提一管。
为了使操作同步以节省时间，各组样品请一起离心。
操作步骤：1、将100μl液体样品加入1.5ml Ep管中，再加入900μl冰预冷的LS-Biotragents TM（苯酚和异硫氰酸胍的混合物）。
2、将样品剧烈混合后，在室温放置5min。
3、加入200μl氯仿，颠倒Ep管混和两次，并剧烈振荡混和10s。
4、在4℃条件下，以10000×g离心15min。
5、将上层水相转移到一个新的Ep管中，加入等体积的异丙醇（Isopropanol）并混匀，然后在4℃放置至少10min。
6、在4℃条件下，以10000×g离心15min后，小心并尽可能地去除全部上清夜。
7、用1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀和管壁。
8、将RNA沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μl无RNase污染的水（RNase-Free Water）将RNA溶解并于-20℃保存。
注意事项：1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
2、所用的塑料材料，如吸头、离心管等需用0.1% DEPC水浸泡过夜。
3、配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。
然后用高压灭菌除去残留的DEPC。
不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
4、操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换。
（二）反转录实验安排：每人做一管。
反应体系（20μl）：按下列顺序加样反应条件：42℃ 1h注意事项：1、加样时，一般从体积大的开始加，样品最后加。
如在一般的PCR反应体系中，应先加水、Buffer、dNTPs、引物，最后加酶和模板。
2、液体应直接加到管底，且每加一种试剂后应更换新的吸头。
3、加完所有试剂后，应用手指轻弹混匀，然后低速离心数秒以收集管壁上沾有的液体。
分子生物学-课件-分子生物第六章可编辑全文
• 使双链DNA解链度达到50%所需的温度称为解链温度 (Tm)、变性温 度、熔点
• DNA的解链温度一般在82-95℃ ，与DNA的分子大小和碱基组成、 溶液的pH值和离子强度（+）等有关
二、复性
• DNA复性：缓慢降温可以使热变性DNA重新 形成互补双链结构
且RNA的完整性和纯度都很高
3、氯化锂-尿素法
• 利用高浓度尿素变性蛋白质同时抑制RNA 酶，氯化锂选择性沉淀RNA
• 缺点：存在DNA污染，氯化锂沉淀RNA会 丢失一些小分子RNA，如5sRNA等
• 优点：快速、简便、产量高，尤其适用于大 量样品少量组织细胞的RNA提取
4·热酚法
• 将异硫氰酸胍、巯基乙醇和SDS等联合使用，可以快速裂 解细胞，解离核蛋白复合物，释放RNA，并有效抑制 RNase的活性
• 在某些理化因素的作用下，维 系核酸二级结构的氢键和碱基 堆积力受到破坏，DNA双螺旋 结构松散，变成单链的过程称 为核酸的变性
• 核酸双螺旋区的氢键断裂，变 成单链，但并不涉及共价键的 断裂
DNA解链曲线
DNA变性的本质是氢键的断裂
核酸的变性因素
• 变性方法
–热变性、酸碱变性、化学变性剂（乙醇、 尿素和甲酰胺 ）
(3)煮沸裂解法
• 以溶菌酶、Triton裂解细菌，然后以沸水浴加热，不 仅促进细菌裂解，还可以使蛋白质和染色体DNA、质 粒DNA变性
• 当降低温度时，闭环质粒DNA复性留在上清液中，而 染色体DNA保持与细胞膜碎片结合、沉淀，可以通过 离心除去
• 在离心上清液中加入有机溶剂 (例如异丙醇)便得到质 粒DNA粗品沉淀
分子生物学 6 DNA 损伤、修复和重组
吖啶橙、原黄素、吖黄素等吖啶类染料 嵌合到DNA碱基对之间 base addition /deletion / frameshift mutation
DNA损伤（DNA damage）
自发损伤: 脱氨基/ 脱嘌呤 外源损伤: 1. 氧化损伤 (需氧细胞) 活性氧：超氧化物，过氧化氢和羟自由基（· OH） 8-氧鸟嘌呤，2-氧腺嘌呤，5-甲酰尿嘧啶 2. 烷基化损伤 影响DNA复制和转录时的解旋 多数是间接诱变 3. 加成损伤 嘧啶二聚体 苯并芘（肝脏细胞色素P-450） 双环氧物-G 芳基化试剂 黄曲霉毒素B1（肝致癌剂）
DNA损伤、修复和重组
突变和突变发生
（mutation and mutagenesis) DNA损伤（DNA damage） DNA修复（DNA repair） 重组（recombination）
突变概念
突变（mutation） DNA分子碱基序列的可遗传改变 突变体（mutant） 与野生型（+）相对 突变剂（mutagen） 突变发生（mutagenesis） 自发突变（spontaneous mutation） 诱发突变（induced mutation）
突变类型 1. DNA碱基序列改变的多少 单点突变（point mutation） 碱基替换（base substitution） 转换（transition） A-T G-C 颠换（transversion）A-T T-A 碱基增加（base addition） 碱基删除（base deletion） 多点突变（multiple mutation）
BER
5' 3' UvrABC 3' 5' 3' 5' Pol I (或δ和ε） 5' 3' DNA glycosylase 5' 3' AP内切核酸酶 5' 3' 进一步酶切
分子生物学-6
分子生物学-6（总分：100.00,做题时间：90分钟）一、选择题（总题数：10,分数：10.00）1.以下哪一项不会在位点特异性重组中出现：（分数：1.00）A.Holliday 中间体B.链迁移C.链交换D.链侵入V解析：［解析］位点特异性重组中形成Holliday中间体，有链迁移和链交换现象，但没有RecA或类似蛋白质出现，也就没有链入侵。
2.HIV病毒侵染宿主细胞的过程中，主要识别细胞表面的哪种抗原分子？（分数：1.00）A.CD4 VB.CD8C.IgMD.gp120 解析：3.以下哪种蛋白质没有参与DNA同源重组过程中Holliday中间体的拆分过程：（分数：1.00）A.RecA VB.RuvAC.RuvBD.RuvC 解析：4.以下所列的各项功能中，哪一项不是逆转录酶所具有的：（分数：1.00）A.以DNA为模板合成RNA的功能VB.以RNA为模板合成DNA的功能C.以DNA为模板合成DNA的功能D.RNase H的活性解析：［解析］逆转录酶没有催化RNA合成的功能。
5.以下哪种酶能专门水解DNA-RNA杂交分子中的RNA：（分数：1.00）A.DNA聚合酶IB.逆转录酶VC.RNase AD.核酸外切酶m 解析：6. A噬菌体DNA进入大肠杆菌后通过哪种方式整合入宿主DNA：（分数：1.00）A.转座作用B.位点特异性重组VC.同源重组D.逆转座作用解析：7.大肠杆菌的插入序列编码以下哪种酶：（分数：1.00）A.逆转录酶8.转座酶VC.RecAD.限制性内切酶解析：8.以下关于HIV病毒的整合酶叙述正确的是：（分数：1.00）A.是一种DNA限制性内切酶B.作用于宿主DNA产生平末端切口C.在LTR上发挥外切酶的作用VD.切除DNA-RNA杂合链中的RNA解析：9.以下关于大肠杆菌基因组DNA中的chi位点叙述正确的是：（分数：1.00）A.顺式作用元件，在其内部可以产生一个自由的单链DNA3' -OH VB.双链DNA发生断裂的位点，并因此诱发DNA重组C.单链DNA发生断裂的位点，并因此引起单链DNA的同化作用D.RecA的结合位点解析：［解析］大肠杆菌基因组DNA中的chi位点是RecBCD的识别序列，RecBCD在此处结合DNA,切割单链DNA产生自由的3' -OH。
分子生物学第5章、第6章
•DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合，称为 遗传重组，或基因重排。→ 重组DNA •真核生物基因组间重组多发生在减数分裂时同源染 色体之间的交换；细菌及噬菌体的基因组为单倍体， 来自不同亲代两组DNA之间可通过多种形式进行遗传 重组。 •DNA重组对生物进化起着关键的作用。 •重组分类：同源重组(homologous recombination) 、 位点特异性重组(site-specific recombination)、 转座重组(transposition recombination)和 异常重组(illegitimate recombination)。
1. 互变异构体：碱基发生烯醇式-酮式互变异构或者氨 基-亚氨基互变异构时，使碱基错配。 2. 脱氨基作用：碱基上氨基自发脱落，或在诱变剂的 作用下脱去氨基，则C→U、A →I、G →X，引起子 链错误。 3. DNA聚合酶“打滑”：DNA复制时发生碱基的环出现 象，引起一个或数个碱基的插入或缺失，易发生于 几个相同碱基串联的部位。 4. 活性氧（O3）引起的诱变：①氧化碱基与C、A配对， 造成GC → TA颠换，这种损伤可以积累；②H2O2造成 的DNA氧化损伤，此类损伤一般能被修复。
核苷酸切除修复
错配修复
错配修复对 DNA复制忠实 性的贡献力达 102-103，DNA 子链中的错配 几乎完全都被 修正，充分反 映了母链的重 要性。
大肠杆菌甲基化引 导的错配修复
重组修复
易错修复和SOS反应
•SOS反应：当DNA损伤广泛难以继续复制时，由此而
诱发出一系列复杂的反应。
•这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。
5.3.4 基因突变的后果
基因突变的后果主要是生物功能的丧失。 某一基因突变后使其所表达的蛋白质或酶失活， 有时还会引起多种酶的缺乏。 有些突变可产生功能获得性显性表现型。 典型的人体细胞突变每个基因每代发生率为107～10-5，但并非所有的突变都会导致疾病。
分子生物学习题集总
分子生物学习题集（2012版）目录习题一基因、基因组、基因组学和基因的化学本质 (2)习题二DNA的复制、重组、损伤、修复以及突变 (7)习题三DNA转录、逆转录及其转录后加工 (12)习题四翻译及其后加工 (17)习题五基因表达的调控 (22)习题六基因工程以及其他现代分子生物学技术 (27)习题一基因、基因组、基因组学和基因的化学本质一、名词解释（每题3分，共15分）1、SNP2、satellite DNA3、annealing4、RFLP5、physical map二、填空题（每空1分，共15分）1、T m是指DNA热变性时候的熔点，双链DNA中若____含量多，则其T m值高。
2、DNA分子中存在三类核苷酸序列，高度重复序列、中度重复序列和单拷贝序列。
tRNA、rRNA以及组蛋白等由__________________编码，而大多数蛋白质由_______________编码。
3、硝酸纤维素膜可结合单链核酸。
将RNA变性后转移到硝酸纤维素膜上再进行杂交，称为________________印迹法；将DNA变性后转移到硝酸纤维素膜上再进行杂交，称为________________印迹法。
4、蛋白质组是指_________________________________________________________。
5、维持DNA双螺旋结构稳定的主要因素是_______________，它由范德华力和疏水作用构成。
6、现在普遍使用的测定DNA一级结构的方法是Sanger提出的_________法。
7、真核生物构成染色质的蛋白质有_________和____________两类。
染色质的一级结构为_________，二级结构是________纤维。
8、DNA在酸性溶液中会发生_________，所以DNA应该存放在碱性溶液中；RNA在碱性溶液中发生______，所以RNA应该存放在酸性溶液中。
生物化学与分子生物学(61)硕士研究生培养方案
生物化学与分子生物学（61）硕士研究生培养方案一、培养目的生物化学与分子生物学专业主要培养德智体全面发展，适应社会主义现代化建设需要的生物化学、分子生物学、分子遗传学等方面的高层次专门人才，具体要求：1．坚持党的基本路线，拥护改革开放，热爱祖国，遵纪守法，品德良好。
2．具有坚实的基础理论和系统的专门知识，熟悉本专业国内外研究现状和发展趋势，掌握一门外语，能及时追踪学科前沿，具有独立从事本专业科研和教学工作的能力。
3．具有创新能力和开拓精神二、研究方向1．分子生物学2．生物化学3．分子遗传学4．人类基因组学三、学习年限与学分学习年限为2-3年，总学分36-38学分四、课程设置（一）学位课程（本专业各方向硕士生公共必修课，计18分）（二）指定选修课程（三）任意选修课程（可选修生命科学学院其他硕士学位点相关课程）五、教学实践各研究方向的硕士生必须进行教学实践，为本科生讲授部分章节或指导实验课时间不少于四周，安排在第3、4学期进行。
实践合格者计2分。
六、调查研究结合导师的研究方向，确定学位论文的选题。
围绕学位论文选题内容开展调查研究，收集资料，或参加有关学术会议等。
调查研究之前，应拟定调研计划。
调研结束后，须撰写调研报告交导师评定成绩。
七、科学研究及学位论文要求1.本专业硕士生在校期间应至少完成1篇课程论文，1篇学年论文。
其中一篇论文在省级或省级以上刊物公开发表。
2.本专业硕士生至迟应在第三学期初定学位论文题目，通过学位论文开题报告，并定出学位论文工作计划。
3.本专业硕土生学位论文选题及学术水平的要求为：4.本专业研究生学位论文的选题应结合本专业的特点和国民经济的需要，既反映本学科研究进展和前沿，又有较大的实践意义。
在研究方法上应采用国内外先进方法和手段，在研究对象上要有新内容、新见解，强调创新性。
论文写作要求规范，应具有较高的学术价值，应达到国内一级刊物上发表的水平。
八、培养方式与方法导师指导与专业指导组集体培养相结合，系统的理论学习与科学研究相结合，课堂讲授与自学讨论相结合。
分子生物学6
W
M
隐性
W
M
顺式显性
分子生物学6
W
M
顺式及反式显性
W
M显性负突变体源自分子生物学6三、原核生物的基因转录及表达调控
2. 基因表达调控 （2）操纵子的发现 n 结论
通过阻遏基因（阻遏物）与操纵区， lacZ、lacY、lacA这3个结构基因是一起 被调控的，它们组成了一个操纵子（the lac operon） n 后来的研究证实了Jacob与Monod的预 言，并使操纵子的慨念进一步完善
分子生物学6
三、原核生物的基因转录及表达调控
2. 基因表达调控 （4）乳糖操纵子的正调控
n 乳糖操纵子的启动子实际上是一种弱启动子， 其 -35 box与原核启动子相应的共同序列相差 甚大，因此才需要CAP-cAMP进行正调控； 如果是强启动子（与共同序列十分相近）， 则不需要正调控，但这种情况会使得即使葡 萄糖存在，乳糖操纵子也一样运作。
分子生物学6
negative control
分子生物学6
三、原核生物的基因转录及表达调控 2. 基因表达调控
（2）操纵子的发现 n 操纵子概念的提出者
n François Jacob n Jacques Monod
分子生物学6
François Jacob, Jacques Monod, et André Lwoff, Prix Nobel 1965
分子生物学6
三、原核生物的基因转录及表达调控
2. 基因表达调控 （4）乳糖操纵子的正调控
n 阻遏物的调控是负调控，乳糖操纵子的调控还需正调 控因子
n 代谢物阻遏效应（catabolite repression） n cAMP在细胞中的浓度与葡萄糖的含量成反比，它与
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分子生物组检测系统/方法分析性能验证评估报告检验科分子生物组检测依据CNAS-CL02：《医学实验室质量和能力认可准则》（ISO 15189：2007）对医学实验室检测系统性能评价的相关要求，对ABI 7000 Real Time PCR System 荧光定量仪进行性能评价，主要从以下几个方面进行：正确度、精密度、临床可报告范围、线性范围等。
具体实施方案如下：
1 目的：
对ABI 7000 Real Time PCR System 荧光定量仪的性能进行评价，结果与生产厂家给出的性能指标进行比较，来验证生产厂家给出的性能指标是否能满足检验科的要求。
若无厂家性能指标则与卫生部室间质评计划表提供的标准比较，判断仪器的性能是否符合要求。
2 原理：
2.1 正确度评价
评价仪器测量结果与真值的一致程度。
本组参加室间质评的项目一律用卫生部临检中心的室间质评回报结果作为评价标准。
2.2 精密度评价
采用EP15-A《用户对精密度和准确性能的核实实验-批准指南》的性能要求，通过检测每个项目2个不同浓度的混合血清和质控物值，计算项目重复精密度和中间精密度，并与厂家声明的重复精密度和中间精密度进行比较，核实是否与厂家声明的一致。
2.3 临床可报告范围评价
荧光定量PCR法HBV DNA检测试剂盒说明书中显示本检测系统临床可报告范围为1.00E3～1.00E8copies/ml。
因试剂盒阳性参控品最高载量为1.00E8copies/ml，大于1.00E7copies/ml 浓度已属临床高载量患者，符合抗病毒治疗指标，不必要对更高的载量进行精确检测，小于1.00E3copies/ml已为临床疗效监测效果较好的指标，大量研究表明，此群患者对抗病毒治疗不敏感，因此对疗效监测意义不大。
2.4 线性范围评价
因为每次实验都做标准曲线，并要求其R值在0.98以上。
因此，本项目不需要进行线性验证。
3 检测方法：
检测方法为实时荧光定量PCR法。
4 方案：
4.1正确度评价方案（卫生部室间质评样品）
采用卫生部临检中心2011年第一次和第二次室间质评与2012年第一次和第二次室间质评
回报结果作为评价标准。
判定标准：绝对偏倚≤±0.4
4.2精密度评价方案
根据NCCLS EP15-A文件，重复精密度测定方案：取2个浓度患者的混合血清重复测定20次。
中间精密度测定方案：采用1个浓度的质控物，每批次分析1次，测定30天。
每天应进行正常的室内质量控制，在控后方可进行检测。
所检测所有数据超出3SD的数据不能超过2个，否则应分析失控原因纠正后重新进行试验，统计数据，计算重复精密度和中间精密度，与允许范围或厂家声明的重复精密度及中间精密度比较，判断验证是否通过。
判定标准：
●重复精密度：厂家声明值低值CV≤10.0%，高值CV≤10.0%；
●中间精密度：厂家声明值低值CV≤10.0%，高值CV≤10.0%；
●将重复CV(%)、中间CV(%)与厂商声称精密度值比较，若试验的精密度小于等于厂商声称精
密度值，则验证通过。
●如果试验的精密度大于厂商声称精密度值，需要进一步计算该项的验证值，如果重复CV(%)、
中间 CV(%)小于验证值，说明差异无统计学意义，同样核实了与允许范围的一致性，验证通过。
如二者数值很接近，为可靠起见，可以添加2个批次测量，将所得数据与以前数据合并再计算，可能得到更可靠的结果。
●如重复CV(%)、中间 CV(%)大于验证值，精密度验证未通过，应与厂家联系并取得帮助。
4.3临床可报告范围评价方案
荧光定量PCR法HBV DNA检测试剂盒说明书中显示本检测系统临床可报告范围为1.00E3～1.00E8copies/ml。
因试剂盒阳性参控品最高载量为1.00E8copies/ml，大于1.00E7copies/ml 浓度已属临床高载量患者，符合抗病毒治疗指标，不必要对更高的载量进行精确检测，小于1.00E3copies/ml已为临床疗效监测效果较好的指标，大量研究表明，此群患者对抗病毒治疗不敏感，因此对疗效监测意义不大。
4.4 线性范围评价
因为每次实验都做标准曲线，并要求其R值在0.98以上。
因此，本组项目不需要进行线性验证。
5 器材
ABI 7000 Real Time PCR System 荧光定量仪，详见附表一。
6 结果：验证结果符合相关规定，详见附表一。
7 结论：
ABI 7000 Real Time PCR System 荧光定量仪定量项目在正确度、精密度、临床可报告范围、线性范围等方面符合要求。
报告人：赵友云
2012年11月28日
湖北省中医院分子生物组检测性能验证评估报告附表一检测系统/方法的分析性能验证评估表。