分子生物学分子克隆技术
生物学实验室中的分子克隆技术
生物学实验室中的分子克隆技术分子克隆技术是生物学中非常重要的技术之一，它可以用于生物学研究、医学诊断、基因治疗等方面。
而生物学实验室中的分子克隆技术也是其中重要的一环。
下面让我们来了解一下生物学实验室中的分子克隆技术。
什么是分子克隆技术？分子克隆技术就是将DNA从一个物种中剪切出来，然后将其插入到另一个物种的DNA中，从而制造出具有新的遗传特征的重组DNA。
这种技术可以在DNA分子水平上对基因进行操作，而且是一种广泛应用于分子遗传学和生物化学的技术。
分子克隆技术在生物学实验室中的应用生物学实验室中的分子克隆技术有很多应用，下面介绍一下几个比较常见的应用。
1. 基因克隆分子克隆技术可以用于基因克隆。
这种技术可以从一个物种中分离出一个基因并进行改组，然后插入到另一种物种的DNA中。
通过基因克隆，可以研究某个特定基因的功能以及作用机制。
基因克隆也可以用于设计药物、疫苗和农作物改良等领域。
2. 亚克隆亚克隆技术是一种通过制造DNA片段并插入到克隆向量（如质粒）中来实现的分子克隆技术。
亚克隆技术可以用于分析基因功能、生物学过程、新药开发等领域。
此外，亚克隆技术也可以用于产生大量的DNA片段，以用于DNA测序等分子生物学实验。
3. PCR扩增PCR扩增是一种用于扩增特定DNA序列的方法。
PCR扩增利用酶的催化作用，在高温条件下在目标DNA片段两端分别链接一个引物，然后进行DNA复制和扩增。
基因组DNA或cDNA如此扩增后，可以进行克隆、测序或其他实验。
PCR扩增技术可用于分析DNA序列变异和DNA指纹鉴别。
这些都是分子克隆技术在生物学实验室中应用的一些例子。
分子克隆技术的应用非常广泛，可以用于基础研究和应用研究。
这种技术的应用正在不断扩展，将来还有很大潜力。
分子克隆技术的发展分子克隆技术的发展与进步可以追溯到上世纪70年代，这是DNA重组技术的诞生时期。
此后，在分子克隆技术的不断发展和完善下，许多新技术得以发展出来，如亚克隆、PCR扩增、RT-PCR等技术。
分子生物学实验中的克隆技术使用方法解析
分子生物学实验中的克隆技术使用方法解析克隆技术是分子生物学中常用的实验方法之一，它可以复制DNA分子，从而产生大量相同的DNA片段。
这项技术的应用非常广泛，包括基因工程、疾病研究、生物医药等领域。
本文将从克隆技术的原理、步骤和应用等方面进行解析。
克隆技术的原理是利用DNA分子的复制特性，通过PCR（聚合酶链式反应）或细菌转化等方法，将目标DNA片段复制出来。
首先，需要从源DNA中选择目标片段，可以通过限制性内切酶切割DNA，或利用PCR扩增目标片段。
然后，将目标片段与载体DNA连接，形成重组DNA。
最后，将重组DNA导入宿主细胞，使其复制并表达目标片段。
克隆技术的步骤包括DNA提取、DNA切割、连接、转化和筛选等。
首先，需要从细胞或组织中提取DNA。
DNA提取的方法有多种，包括酚-氯仿法、盐法、离心法等。
其次，需要选择适当的限制性内切酶对DNA进行切割。
限制性内切酶是一类能够识别特定DNA序列并切割的酶，它们可以将DNA切割成特定的片段。
然后，将目标片段与载体DNA进行连接。
载体DNA可以是质粒、噬菌体或人工染色体等，它们能够稳定地复制和传递目标片段。
连接的方法有多种，包括DNA连接酶法、化学连接法等。
连接完成后，将重组DNA导入宿主细胞，使其复制并表达目标片段。
最后，通过筛选方法，选择含有目标片段的克隆进行进一步研究。
克隆技术在分子生物学研究中有着广泛的应用。
首先，它可以用于基因工程，包括基因的克隆、表达和改造等。
通过克隆技术，科学家可以将感兴趣的基因从一个生物体中克隆到另一个生物体中，从而实现基因的转移和表达。
其次，克隆技术也可以用于疾病研究。
通过克隆疾病相关基因，科学家可以深入研究其功能和作用机制，为疾病的治疗和预防提供理论依据。
此外，克隆技术还可以用于生物医药领域，包括药物研发、疫苗生产等。
通过克隆技术，科学家可以大规模复制目标基因，从而实现药物和疫苗的生产。
当然，克隆技术也存在一些问题和挑战。
分子克隆技术在生物学研究中的应用
分子克隆技术在生物学研究中的应用
随着现代科技的发展，分子生物学技术也在不断地发展。
其中，分子克隆技术
作为细胞生物学和遗传学领域的一项重要技术，已经在很多领域得到了广泛的应用。
分子克隆技术是指利用DNA重组技术，将一个DNA片段插入到另一个DNA
分子中的过程。
其基本原理是在体细胞中将含有所需DNA序列的质粒导入细胞内，使细胞内的DNA含量发生改变。
这项技术的发展，极大地促进了基因工程和基因
治疗等领域的研究。
分子克隆技术研究的对象和应用范围非常广泛。
其中，最重要的应用之一是基
因工程。
分子克隆技术可以用于构建基因工程载体，从而实现外源基因的转移和表达。
例如，利用分子克隆技术，可以将人类的基因片段克隆到细胞中，从而生产出对应的蛋白质，以治疗一些疾病。
同时，这项技术还可以用于农业领域，例如将某些耐旱、耐寒或抗病性更强的基因克隆入植物中，从而使植物更具有抗性和适应性。
另外，分子克隆技术还可以用于DNA测序和基因分型、遗传工程、信号转导
途径的研究、药物研发等领域。
例如，基于分子克隆技术，可以构建基因库，对大量的DNA片段进行测序和分析，从而发现可作为特定蛋白质编码的基因。
在药物
研发方面，可以通过克隆所需的基因片段，制备具有更高效药理学特性的药物。
总之，分子克隆技术已经成为现代生物科技中不可或缺的一部分。
其应用不仅
在研究领域具有重要作用，而且可以为人类的健康和社会发展做出贡献。
随着这项技术的不断发展和改进，相信在未来的生物学研究中，分子克隆技术将发挥更加重要的作用。
DNA分子克隆技术(也称基因克隆技术)
DNA分子克隆技术（也称基因克隆技术）：在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接，转入细胞获得大量拷贝的过程中DNA分子克隆(或基因克隆)。
其基本步骤包括：制备目的基因→将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接，制成DNA重组→导入宿主细胞→筛选、鉴定→扩增和表达。
载体（vecors）在细胞内自我复制，并带动重组的分子片段共同增殖，从而产生大量的DNA分子片段。
主要目的是获得某一基因或NDA片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，随着引入的DNA片段不同，有两种DNA库，一种是基因组文库（genomic library）,另一种是cDNA库。
载体所谓载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。
细菌质粒是一种细菌染色体外小型双链环状结构的DNA，分子大小为1-20kb，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。
质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。
最常用的质粒是pBR322。
基因库的建造含有某种生物体全部基历的随机片段的重组DNA克隆群体，其含有感光趣的基因片段的重组子，可以通过标记探针与基因库中的重组子杂交等方法而筛选出来，所得到的克隆经过纯化和扩增，可用于进一步的研。
其主步骤包括：（1）构建基因库迅速的载体；(2)DNA片段的制备；（3）DNA片段与载体DNA 的连接；（4）包装和接种。
cDNA库的建造是指克隆的DNA片段，是由逆转录酶自mRNA制备的cDNA。
cDNA库包括某特定细胞的全部cDNA克隆的文库，不含内含子。
特异基因的筛选常用的方法有：（1）克隆筛选即探针筛选法；（2）抗体检测法，检测其分泌蛋白质来筛选目的基因；（3）放射免疫筛选法，查出分泌特异抗原的基因；（4）免疫沉淀法，进行特异基因的筛选。
核酸序列测定DNA的碱基序列决定着基因的特性，DNA序列分析（测序，sequencing）是分子生物学重要的基本技术。
分子生物学分子克隆
质粒不相容原理
当两个不相容质粒被导入同一细胞时，它们在 复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争。由于质 粒分子是从细胞内的质粒库中随机选取出来进行复制 的，所以两种不同的质粒在一个细胞中的拷贝数并不 总能保持相等。最初在随机过程中产生的微小差异， 将很快导致两种质粒在拷贝数上更严重的失衡。在一 些细胞中，一种质粒处于优势，而在另一些细胞中， 另一种质粒处于优势。细菌繁殖几代后，占少数的质 粒将会丧失殆尽，在原始细胞的后代中可含有两种质 粒中的任意一种，但不会兼而有之。
载体
载 体 主 要 有 两 类 ： 质 粒 （ plasmid ） 和 噬 菌 体 （bacteriophage or phage）。它们都经过了人工的 改造，使其能更好地满足分子克隆工作的需要。它 们在宿主细胞中都能够复制，并且在带有外源DNA 片段时也不影响它们的复制，而单独的外源DNA不 能复制。
质粒的遗传标记
质粒携带的常见基因有β-内酰胺酶基因，带有 这种质粒的大肠杆菌能够抗氨苄青霉素（amp r）； 氯霉素乙酰基转移酶基因能够抗氯霉素（cat r）。 其他一些遗传标记有lacZ、tet r、str r等。
质粒的复制类型
一般来说，一个质粒上只带有一个复制子 （replicon），目前使用的大多数质粒载体都带有一 个来自pMB1质粒的复制子。其他常用的复制子还有 ColE1、p15A、pSC101等。
大肠杆菌的遗传标记
大肠杆菌的遗传标记一般采用三字母命名，如tet r、 tet s、amp r等，其中上标r代表抗性（resistance），s 代表敏感（sensitivity）。当大肠杆菌中含有质粒或 噬菌体时，记为E. coli K-12（pBR322）、E. coli K12（λ）等。
分子克隆技术的使用方法
分子克隆技术的使用方法分子克隆技术是在分子生物学领域中最常用的一种实验方法，它可以帮助研究人员复制并分离出特定的DNA序列，用于进一步研究和应用。
分子克隆技术的使用方法主要包括DNA提取、限制性内切酶切割、连接反应、转化和筛选等步骤。
下面将对这些步骤逐一进行介绍。
首先，DNA提取是分子克隆技术的第一步，它的目的是从样品（例如细菌、植物或动物组织）中提取出目标DNA。
提取方法主要有酚/氯仿法、盐法和商用DNA提取试剂盒等。
在提取过程中，我们需要将样品细胞破裂，并通过使用蛋白酶分解蛋白质，最后通过乙酸盐、异丙醇等溶剂沉淀目标DNA。
其次，限制性内切酶是分子克隆技术中的关键工具，它能够识别并切割DNA 的特定序列。
在实验中，我们选择与目标DNA序列相匹配的限制性内切酶，将其与目标DNA一起反应，酶可以精确切割DNA链，产生特定的末端序列。
这样的切割可以生成需要的DNA片段用于后续的连接反应。
连接反应是分子克隆技术的核心步骤，通过该步骤可以将目标DNA片段与载体DNA连接起来。
通常情况下，载体DNA是一种循环的DNA分子，如质粒或噬菌体。
在连接反应中，我们需要将目标DNA片段与已经经过限制性内切酶切割处理的载体DNA进行连接。
连接反应可以使用DNA连接酶和缓冲液，在适当的温度下进行反应。
连接反应的最终产物是重组载体，内含目标DNA的插入片段。
然后，转化是将重组载体导入到宿主细胞中的过程。
对于大多数分子克隆实验来说，大肠杆菌是最常见的宿主细胞。
在转化过程中，我们需要将重组载体与宿主细胞共同处理，使其能够进入细胞内。
转化方法主要有热激、电击和化学法等。
通过转化，重组载体可以复制并表达其携带的目标DNA片段。
最后，筛选是分子克隆技术中的关键步骤，它可以确定是否成功克隆了目标DNA片段。
筛选依赖于所克隆目标的特性和选择的标记方法。
常用的筛选方法包括酶切鉴定、PCR扩增、限制性酶切图谱分析以及DNA序列分析等。
这些方法可以帮助我们鉴定和验证克隆的目标DNA片段是否符合预期。
克隆技术分子生物学的重要应用
克隆技术分子生物学的重要应用在现代分子生物学领域中，克隆技术是一项至关重要的工具，它为科学家们提供了一种研究生物体内基因组以及其功能的方式。
克隆技术的发展为我们解开了许多生物学谜团，同时也为医学领域的诊断和治疗提供了新的可能。
本文将探讨克隆技术在分子生物学中的一些重要应用。
1. 基因克隆基因克隆是指将特定基因从一个生物体中复制并插入到另一个生物体中的过程。
这种技术使得科学家能够大规模生产特定蛋白质或其他生物分子。
例如，通过将人类胰岛素基因克隆到大肠杆菌中，科学家们得以生产大量胰岛素来治疗糖尿病患者。
基因克隆也被广泛应用于农业领域，以改良作物的品质和抗病能力。
2. 基因组测序基因组测序是指对生物体中的基因组进行全面解读和分析的过程。
克隆技术为基因组测序提供了重要的支持。
通过克隆技术，科学家们能够将基因组中的DNA分离并进行大规模复制，从而提供足够的样本来进行测序。
基因组测序的发展使得我们能够深入了解不同生物体的遗传信息，研究基因与表型之间的关系，并从中发现新的治疗方法。
3. 基因编辑基因编辑是一种通过改变生物体基因组中的特定区域来实现基因功能调控的技术。
克隆技术在基因编辑中起到了至关重要的作用。
通过克隆技术，科学家们能够制备出具有特定基因变异的动物模型，进而深入研究此基因对于生物体发育和功能的影响。
基因编辑技术也被广泛应用于医学研究，以研究与疾病相关的基因变异，并开发新一代基因治疗方法。
4. 表达克隆表达克隆是指将特定基因导入到宿主生物体中，并通过其宿主的细胞机制使该基因得以表达。
这种技术可以用于生产重要蛋白质的大规模制备，如激素、抗体等。
通过克隆技术，人们可以将目标基因与植物、动物或微生物的基因组结合，使其能够在宿主中获得高效表达。
表达克隆被广泛用于药物生产、工业酶的制备以及其他生物制品的生产。
5. 基因治疗基因治疗是一种通过介入生物体的基因组来治疗疾病的方法。
克隆技术有助于基因治疗的研究与实施。
分子生物学中的克隆策略
分子生物学中的克隆策略克隆技术是分子生物学中应用最广泛的一项技术，其在基因工程、治疗、疫苗和药物研发等领域都有着重要的应用。
具体来说，克隆技术主要是指在体外复制和扩增特定DNA序列的过程。
为了实现有价值的克隆，需要选择合适的克隆策略。
一、催化剂-下游PCR法PCR是分子生物学实验室中最常用的技术之一，其可以扩增DNA的片段。
但是，PCR方法具有一定的局限性，PCR扩增的DNA片段长度不宜过长，而且与RNA结合后再翻译会产生较大的误差。
考虑到此种情况，研究者便设计了催化剂-下游PCR法。
在这种克隆策略中，研究者首先在DNA末端加入适当的序列标记（例如，带有限制酶切位点的标记），并在PCR反应体系中添加在另一条DNA链上特异性结合的相应催化剂，通过PCR扩增特定长度的DNA片段。
此外，在克隆过程中应注意，催化剂不能过多，否则可能引发非特异性放大，导致产物不纯。
二、限制酶-连接PCR法限制酶-连接PCR法是一种基于限制酶嗣中的DNA连接技术的克隆策略。
此种策略中，研究者在目标DNA的两端加入相同的限制酶切割位点，然后使用相应的限制酶处理目标DNA和载体DNA，以及用T4 DNA连接酶连接。
通过连接后，将连接后的目标DNA插入到适当的载体上并导入所需的表达宿主，如大肠杆菌（E. coli）, 单细胞藻等。
这种方法的优点是适用于大片段DNA的克隆，具有比较高的克隆效率和精确度。
此外，使用脚印标记探测目标DNA和核心连接位的研究也具有极大的借鉴意义。
三、COLD-PCR技术肿瘤组织中富含突变，突变基因的测序需要进行高度敏感的检测。
在这种情况下，COLD-PCR技术可以带来巨大的帮助。
COLD-PCR技术基于常规PCR方法进行改进，该策略使用高选择性扩增，以扩大突变基因，减小野生型基因，以达到高灵敏度检测突变基因以及基因突变率的效果。
通过这种技术，可以分离出包含目标突变基因的DNA片段，随后再进行DNA测序，以更好地理解该突变基因的生物学特性和相关性。
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分子克隆
基因工程
基因工程是指在微观领域（分子水 平）中，根据分子生物学和遗传学 原理，设计并实施一项把一个生物 体中有用的目的DNA(遗传信息)转 入另一个生物体中，使后者获得新 的需要的遗传性状或表达所需要的 产物，最终实现该技术的商业价值。
基因工程的基本特点是，分子水平 操作，细胞水平表达。
基因工程与建筑工程
基因工程的核心技术是DNA重组技术
重组DNA技术的重大突破带动了现代生物技术的兴起，并 很快产生了许多生命科学的高技术产业。
重组DNA技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因工程 的核心技术。该技术包括了一系列的分子生物学操作步骤。
分子克隆技术
又称为重组DNA技术，是指将一种生物体（供体）的基因与载体在 体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人 们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序。 供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。
灭 菌 器
加IPTG和X-GAL
倒平板
α
互 补
利用α互补原理筛选重组体pUC18
筛选结果
蓝菌落代表含有质粒的耐药菌，表达出由完好的α LacZ序列编码 的功能性的 α 片段。
白菌落代表含有质粒的耐氨苄青霉素菌，质粒上α LacZ序列上有 插入片段。
乳糖和诱导物IPTG的化学结构
isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside
多利诞生的过程： 1.取出第一只成年母羊乳腺的普通细胞，分离基因备用。 2.取出第二只母羊未受精的卵细胞，取出基因换上第一只羊乳腺细胞 基因（“掉包”），放电激活该卵细胞，使之象正常受精卵一样进行细 胞分裂，直至一定阶段，胚胎成熟。 3.将成熟的胚胎移植到第三只母羊子宫中发育，妊娠（同正常一样） ，最后产下多利。 这样一只与第一只羊基因百分之百一样的复制品诞生了。
Differences which can lead to star activity include low ionic strength, high pH, and high (> 5% v/v) glycerol concentrations.
High Fidelity (HF) Restriction Enzymes can be used to reduce star activity.
目的基因的高效分泌表达
概念：目的蛋白分泌到细胞周质和目的蛋白转运到细胞周质后再 分泌到细胞外
优点：① 防止宿主菌对表达产物的降解；②有利于蛋白质正确折 叠，形成天然构象③减轻宿主细胞代谢负荷④有利于分离
需要在质粒设计时加入一段信号肽基因
基因克隆操作过程
克 隆 示 意 图
克隆示意图
克隆技术流程
内切酶
“手术刀” “缝纫针” “复印机”
专司切割之职 具有连接之功 行使复制之责
内切酶 连接酶 聚合酶
内切酶
同裂酶(Isoschizomers）
同尾酶
星活性*
所谓星活性又称Star活性。是指由于反应条件不同而产生的切断 与原来认识序列不同的位点的现象，也就是说产生Star活性后， 不但可以切断特异性的识别位点，还可以切断非特异性的位点。 产生Star活性的结果是酶切条诱 导表达蛋白
鉴定方法
鉴 定
PCR
原 位 杂 交
免疫学方法 鸡的β肌球蛋白的克隆和检出
蛋白质的纯化
谢 谢！
多利诞生的过程
为什么震惊和惊呼，我们先了解一下多利诞生的过程以及胚胎细胞克隆 和体细胞克隆的区别这两个基本问题，对我们学习后面内容或许有所帮 助和启发。
分 切 连 转 筛
分
分离（来自生物组织）、扩增（设计引物，PCR扩增） mRNA-------DNA------扩增
引物设计与订购
酶切位点
双酶切、保护碱基、最合适的缓冲液。
引物订购
保护碱基
1.用限制性酶消化 DNA 样品
单酶切
双酶切
选择合适的双酶切缓冲液
2.用限 制性内 切酶消 化质粒
冷循环器
4.用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞
转化细菌有两个基本方法。 一是 化学法，即用CaCl2 处理并加热激以促进DNA进入菌体； 二是电激法，即 施加短脉冲的电荷以促进DNA 吸收。
用氯化钙化学转化
用氯化钙化学转化
电激转化
一个电激转化程序
加 50-200ng DNA 到 40ul 电激感受态细菌中
四、分子克隆的技术支撑
核酸凝胶电泳技术 核酸分子连接技术 细菌转化技术 DNA序列分析技术 寡核苷酸合成技术 基因定点突变技术 聚合酶链反应（PCR）技术 DNA序列测定技术
核酸凝胶电泳
细菌转化技术 （包括感受态细胞制备）
聚合酶链反应（PCR）技术
大规模生产生物活性物质
野生细胞
EcoRⅠ+ Bg lⅡ
双酶切
A TCTAG
AATTC G
GATCT A
GAATTC CTTAAG
AGATCT TCTAGA
Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切
+AATTC G
A TCTAG
T4 DNA连接酶
15ºC
配伍末端的
GAATTC CTTAAG
AGATCT TCTAGA
重组体
连接情况和同一 限制酶切位点连 接相似。
➢ 重组DNA操作一般步骤：
（1）获得目的基因； （2）与克隆载体连接，形成新的重组
DNA分子； （3）用重组DNA分子转化受体细胞，
并能在受体细胞中复制和遗传； （4）对转化子筛选和鉴定； （5）对获得外源基因的细胞或生物体
通过培养，获得所需的遗传性状或 表达出所需要的产物。
获得需要的目的基因（外源基因）
表达型基因工程的载体----以PET32为例
多克隆位点
宿主
要考虑宿主菌对密码子的偏爱性 大肠杆菌不同密码子的偏爱性问题，将64组密码子分为强、中
、弱密码子
目的产物
目的基因不溶性的高效表达 过程：目的基因编码的真核蛋白质与宿主基因编码的原核多肽或或其
它基因编码的具有其它功能的多肽和结合在一起，这种结合在一起的 形成的不溶性无活性的包涵体，又叫为融合蛋白。 举例：胰岛素与β-半乳糖苷酶形成包涵体 优点：避免细菌蛋白酶破坏，提高目的基因表达产物产量。 缺点：需要经过溶解和复性才能获得有活性的 适合：不需要翻译后修饰的蛋白质产物
逆转录酶
使真核基因的制备成为可能。
（1）真核基因组庞大而复杂，不易制得基因图谱。
（2）即使有了基因图谱，因为真核基因有内含子，不能 在原核表达系统剪接出mRNA，没有成熟的mRNA就不 能得到相应得产物。
（3）经过逆转录mRNA→cDNA (comple就方便得多。
分离工程
分
离
酶
工
程
酶工程
野生细胞
基因工程 蛋白质工程 途径工程
工程细胞
发酵工程 细胞工程
生物活性物质
用携带了外源基因的农杆菌Ti质粒转化植物原生 质体，发育成具有新性状的完整植株——转基因植物。
基因工程的工具酶
“手术刀” “缝纫针” “复印机”
专司切割之职 具有连接之功 行使复制之责
内切酶 连接酶 聚合酶
细胞内总DNA的提取分离程序
紫外分光光度计测定DNA溶液的纯度和浓度。
基因工程的工具酶
“手术刀” “缝纫针” “复印机”
专司切割之职，内切酶 具有连接之功，连接酶 行使复制之责，DNA聚合酶
(“交通工具车子”)——载体
有了切割与缝合（ligase）基因DNA的工具，还得 有一个“车子”将重组DNA送到宿主细胞中去。
DNA
3.连接样品DNA和质粒DNA的消化产物
连接前最好要定量
连接比例摩尔比例为：
插入片度：质粒=10:1---5:1为佳。
质粒几十个ng为佳。
双酶切
Eco RⅠ切割位点 Bg lⅡ切割位点
G A A T T C C T T A A G
A G A T C T T C T A G A
AATTC G
限制性内切酶酶切
3‘OH 5’P
CIAP去除5‘磷酸
3’ OH5’OH
转化E.Coli
筛选重组子，测序
重 组 体 筛 选
谢谢
密度 6. 在宿主细胞选择、质粒构建、培养基设计都应该考虑有利于产物
的分离提纯
概述 基因克隆工具酶 基因克隆载体 目的基因的分离 基因克隆操作过程 目的基因在宿主中的表达
外源DNA
5‘P 3‘OH
限制性内切酶酶切
3‘OH 5’P
5’P 3‘OH
T4连接酶连接
5’OH
3’ OH
载体多克隆 位点
DNA聚合酶
Taq酶
用Taq酶扩增DNA时常使片段3‘端凸出一个A。
Pfu酶
产生平末端产物。
连接酶
T4 DNA Ligase (invitrogen) 16°C过夜或者室温1-2个小时了连接即可。
基因工程的载体---用于扩增
克隆载体必备条件
（1）具有复制起点 （2）具有抗菌素抗性基因 （3）具有若干限制酶单一识别位点 （4）具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数。
目的基因高效表达规律
1. 目的蛋白无须变形和复性就具有生物活性的表达方式 2. 对于翻译后需要修饰蛋白质结构，能够进行目的蛋白结构修饰的
表达方式 3. 能够将目的蛋白分泌到细胞周质、特别是分泌到细胞外的分泌型
表达方式 4. 降低不含目的基因细胞的比例，保持目的基因的稳定性，使目的
基因在宿主细胞内长时间超持和表达 5. 通过选择好的培养方法和能够进行高密度培养的细胞，提高细胞
X-gal
X-Gal是β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的显色底物，在 β-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物。常用于β-半乳糖苷酶的原位染色检测