启动子位点预测,顺势调控网络流程
牛LATS2_基因启动子克隆及转录调控分析
江苏农业学报(ＪｉａｎｇｓｕＪ.ｏｆＡｇｒ.Ｓｃｉ.)ꎬ２０２３ꎬ３９(３):７５３￣７６１ｈｔｔｐ://ｊｓｎｙｘｂ.ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ张久盘ꎬ宋雅萍ꎬ姜㊀超ꎬ等.牛ＬＡＴＳ２基因启动子克隆及转录调控分析[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０２３ꎬ３９(３):７５３￣７６１.ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１０００￣４４４０.２０２３.０３.０１６牛ＬＡＴＳ２基因启动子克隆及转录调控分析张久盘１ꎬ宋雅萍２ꎬ姜㊀超２ꎬ王㊀锦１ꎬ魏大为２(１.宁夏农林科学院动物科学研究所ꎬ宁夏银川７５０００２ꎻ２.宁夏大学农学院ꎬ宁夏银川７５００２１)收稿日期:２０２２￣０６￣１５基金项目:宁夏自然科学基金项目(２０２１ＡＡＣ０５００７)ꎻ宁夏重点研发计划项目(２０２０ＢＥＢ０４０１１)ꎻ宁夏青年科技人才托举工程项目(ＴＪＧＣ２０１９０７６)作者简介:张久盘(１９８５－)ꎬ女ꎬ河南商丘人ꎬ硕士ꎬ助理研究员ꎬ研究方向为动物遗传育种ꎮ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｚｈａｎｇｊｉｕｐａｎ＠１６３.ｃｏｍ通讯作者:魏大为ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｗｅｉｄａｗｅｉｗｄｗ＠１６３.ｃｏｍ㊀㊀摘要:㊀本研究旨在探究牛ＬＡＴＳ２基因组织表达规律ꎬ利用相对荧光素酶活性数值确定其启动子核心区域并初步鉴定其核心区域关键转录因子ꎬ以阐明牛ＬＡＴＳ２基因的转录调控机制ꎮ利用ＲＴ￣ｑＰＣＲ检测牛ＬＡＴＳ２基因在心㊁脾㊁肝㊁肾㊁肺㊁背最长肌㊁皮下脂肪㊁皱胃㊁大肠及睾丸等中的相对表达量ꎬ构建ＬＡＴＳ２蛋白进化树ꎮ克隆ＬＡＴＳ２基因５ᶄ端非翻译区上游１.７ｋｂ序列ꎬ利用逐段缺失引物ꎬ巢式扩增其７个启动子区不同截断体缺失片段(－１７９２~＋１７９㊁－１４７５~＋１７９㊁－１０９８~＋１７９㊁－７２７~＋１７９㊁－５１５~＋１７９㊁－２４８~＋１７９和－５６~＋１７９)ꎬ并将不同截断体构建至双荧光素酶报告载体ｐＧＬ３￣Ｂａｓｉｃ上ꎮ重组的ＬＡＴＳ２基因启动子双荧光素载体分别转染小鼠成肌细胞(Ｃ２Ｃ１２)和小鼠脂肪细胞(３Ｔ３￣Ｌ１)细胞系ꎬ鉴定其启动子核心区域ꎮ进一步借助在线软件ＪＡＳＰＡＲ(ｈｔｔｐ://ｊａｓｐａｒ.ｇｅｎｅｒｅｇ.ｎｅｔ/)和Ｇｅｎｏｍａｔｉｘ(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｇｅｎｏｍａｔｉｘ.ｄｅ/ｃｇｉ￣ｂｉｎ//ｍａｔ￣ｉｎｓｐｅｃｔｏｒ)分析启动子核心区域序列特征ꎬ并预测关键转录因子结合位点ꎮ结果显示ꎬＬＡＴＳ２基因在肝和背最长肌中表达量极显著高于脾(Ｐ<０ ０１)ꎻＬＡＴＳ２蛋白构建的进化树显示反刍动物单独聚为１支ꎬ表明ＬＡＴＳ２基因在反刍动物进化过程中保守性较高ꎻ蛋白质互作分析筛选出的与ＬＡＴＳ２蛋白互作紧密的前１０种蛋白质均为Ｈｉｐｐｏ信号通路中的关键蛋白质ꎮＬＡＴＳ２基因启动子核心区域位于－２４８~－５６ꎬ预测其启动子核心区域有与肌肉发育相关的转录因子ＴＥＡＤ１㊁ＭＥＦ２Ａ㊁ＦＯＳＬ１㊁ＭｙｏＧ和Ｍｙｏｄ１的结合位点ꎬ表明ＬＡＴＳ２基因在牛肌肉生长发育中扮演重要角色ꎮ以上结果为探究牛ＬＡＴＳ２基因在肌肉生长发育中转录调控机制奠定基础ꎮ关键词:㊀牛ꎻＬＡＴＳ２基因ꎻ组织表达ꎻ启动子ꎻ转录调控中图分类号:㊀Ｓ８２３.８＋１㊀㊀㊀文献标识码:㊀Ａ㊀㊀㊀文章编号:㊀１０００￣４４４０(２０２３)０３￣０７５３￣０９ＰｒｏｍｏｔｅｒｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｂｏｖｉｎｅＬＡＴＳ２ｇｅｎｅＺＨＡＮＧＪｉｕ￣ｐａｎ１ꎬ㊀ＳＯＮＧＹａ￣ｐｉｎｇ２ꎬ㊀ＪＩＡＮＧＣｈａｏ２ꎬ㊀ＷＡＮＧＪｉｎ１ꎬ㊀ＷＥＩＤａ￣ｗｅｉ２(１.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅꎬＮｉｎｇｘｉａＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｄＦｏｒｅｓｔｒｙＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＹｉｎｃｈｕａｎ７５０００２ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＳｃｈｏｏｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅꎬＮｉｎｇｘｉａＵｎｉ￣ｖｅｒｓｉｔｙꎬＹｉｎｃｈｕａｎ７５００２１ꎬＣｈｉｎａ)㊀㊀Ａｂｓｔｒａｃｔ:㊀ＴｈｅｐｕｒｐｏｓｅｏｆｔｈｉｓｓｔｕｄｙｗａｓｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｔｉｓｓｕｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｂｏｖｉｎｅＬＡＴＳ２ｇｅｎｅꎬａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｙｉｔｓｃｏｒｅｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎａｎｄｋｅｙｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓꎬｓｏａｓｔｏｃｌａｒｉｆｙｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｂｏｖｉｎｅＬＡＴＳ２ｇｅｎｅ.ＴｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｂｏｖｉｎｅＬＡＴＳ２ｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｈｅａｒｔꎬｓｐｌｅｅｎꎬｌｉｖｅｒꎬｋｉｄｎｅｙꎬｌｕｎｇꎬｌｏｎｇｉｓｓｉｍｕｓｄｏｒｓｉｍｕｓｃｌｅꎬｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｆａｔꎬａｂｏｍａｓｕｍꎬｌａｒｇｅｉｎｔｅｓｔｉｎｅａｎｄｔｅｓｔｉｓｂｙＲＴ￣ｑＰＣＲꎬａｎｄｔｈｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｔｒｅｅｏｆＬＡＴＳ２ｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ.Ｔｈｅ１.７ｋｂｓｅｑｕｅｎｃｅｕｐｓｔｒｅａｍｏｆｔｈｅ５ᶄ￣ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄｒｅｇｉｏｎｏｆＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｗａｓｃｌｏｎｅｄꎬａｎｄｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｇｉｏｎｓｏｆｓｅｖｅｎｓｅｇｍｅｎｔｓｗｉｔｈ－１７９２－＋１７９ꎬ－１４７５－＋１７９ꎬ－１０９８－＋１７９ꎬ－７２７－＋１７９ꎬ－５１５－＋１７９ꎬ－２４８－＋１７９ａｎｄ－５６－＋１７９ｍｉｓｓｉｎｇｓｅｇｍｅｎｔｓｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄꎬａｎｄｔｈｅｄｕａｌ￣ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｒｅｐｏｒｔｅｒｖｅｃｔｏｒｐＧＬ３￣Ｂａｓｉｃｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｐｒｏｍｏｔｅｒｖｅｃｔｏｒｓｗｅｒｅｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏＣ２Ｃ１２ａｎｄ３Ｔ３￣Ｌ１ｃｅｌｌｌｉｎｅｓꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎬａｎｄｔｈｅｃｏｒｅｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ.Ｗｉｔｈｔｈｅｈｅｌｐｏｆｏｎｌｉｎｅｓｏｆｔｗａｒｅ３５７ＧｅｎｏｍａｔｉｘａｎｄＪＡＳＰＡＲꎬｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｃｏｒｅｐｒｏｍｏｔｅｒｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｔｏｐｒｅｄｉｃｔｔｈｅｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｓｏｆｋｅｙｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｂｏｖｉｎｅＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｉｎｌｉｖｅｒａｎｄｌｏｎｇｉｓｓｉｍｕｓｄｏｒｓｉｍｕｓｃｌｅｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎｓｐｌｅｅｎ(Ｐ<０ ０１).Ｒｕｍｉｎａｎｔｓｗｅｒｅｃｌｕｓｔｅｒｅｄｉｎｔｏｏｎｅｂｒａｎｃｈｉｎｔｈｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｔｒｅｅｃｏｎ￣ｓｔｒｕｃｔｅｄａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏＬＡＴＳ２ｐｒｏｔｅｉｎꎬｗｈｉｃｈｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｗａｓｈｉｇｈｌｙｃｏｎｓｅｒｖｅｄｉｎｔｈｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｐｒｏｃｅｓｓｏｆｒｕｍｉｎａｎｔｓ.ＴｈｅｔｏｐｔｅｎｐｒｏｔｅｉｎｓｃｌｏｓｅｌｙｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｗｉｔｈＬＡＴＳ２ｐｒｏｔｅｉｎｓｃｒｅｅｎｅｄｂｙｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｗｅｒｅｔｈｅｋｅｙｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎＨｉｐｐｏｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ.ＴｈｅｃｏｒｅｒｅｇｉｏｎｏｆｔｈｅＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｐｒｏｍｏｔｅｒｗａｓｌｏｃａｔｅｄａｔ－２４８－－５６.Ｉｔｗａｓｐｒｅｄｉｃ￣ｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｏｒｅｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎｏｆｂｏｖｉｎｅＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｈａｄｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｓｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓＴＥＡＤ１ꎬＭＥＦ２ＡꎬＦＯＳＬ１ꎬＭｙｏＧａｎｄＭｙｏｄ１ｒｅｌａｔｅｄｔｏｍｕｓｃｌｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ.ＩｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｐｌａｙｅｄａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｔｈｅｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｅ￣ｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｂｏｖｉｎｅｍｕｓｃｌｅ.Ｔｈｅａｂｏｖｅｒｅｓｕｌｔｓｌａｙａｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｅｘｐｌｏｒｉｎｇｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｂｏ￣ｖｉｎｅＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｉｎｍｕｓｃｌｅｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:㊀ｃａｔｔｌｅꎻＬＡＴＳ２ｇｅｎｅꎻｔｉｓｓｕｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎꎻｐｒｏｍｏｔｅｒꎻｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ㊀㊀骨骼肌是动物躯体最重要的组成部分ꎬ其生长发育直接影响甚至决定家畜的产肉量ꎬ骨骼肌的生物学特性是衡量家畜潜在经济性能的标准[１]ꎬ另外ꎬ骨骼肌是动物体动作和能量代谢的主要参与者ꎬ在机体的代谢平衡维持中起十分重要的作用[２]ꎮ骨骼肌发生发育过程极其复杂精细ꎬ从静息肌卫星细胞的激活㊁成肌细胞的增殖分化ꎬ到肌纤维形成的终末阶段[３￣４]ꎬ全过程除了受遗传㊁环境及营养水平调控外ꎬ更多取决于基因的控制[５]ꎬ且细胞信号分子㊁转录因子㊁非编码ＲＮＡ等诸多调节因子精准地参与其中复杂的网络调控[６￣１１]ꎮ目前ꎬ为促进骨骼肌的生长发育以改善肉质从而实现肉牛的遗传改良ꎬ基因的功能鉴定和筛选已成为一种热门且有效的手段ꎮ哺乳动物中调节细胞生长的Ｈｉｐｐｏ信号通路十分保守ꎬ通过关键因子Ｓａｌｖａｄｏｒ１(Ｓａｖ１)㊁ＭＳＴ１/ＭＳＴ２㊁Ｙｅｐ等相关基因及大肿瘤抑制基因１/２(ＬＡＴＳ１/ＬＡＴＳ２)调控细胞的增殖㊁分化㊁凋亡以及干细胞的自我更新ꎬ从而实现对器官体积大小的控制[１２￣１３]ꎮＬＡＴＳ２基因作为Ｈｉｐｐｏ信号通路的核心成员之一ꎬ与通路中的其他关键因子共同调控动物体器官的生长发育ꎬ主要表现在影响心脏肌肉的发育[１４￣１５]ꎮ目前ꎬ关于ＬＡＴＳ２基因功能研究主要集中在其参与肿瘤细胞发生及调控细胞增殖的机理方面[１６￣１８]ꎬ但ＬＡＴＳ２基因对动物体骨骼肌生长发育中的调控有重要作用且研究较少ꎮ王利宏等[１９]㊁鲍建军等[２０]发现ＬＡＴＳ２基因多态性与湖羊肌肉生长发育有显著关联ꎬ同时还发现ＹＡＰ１基因在正常表型羊和双肌臀羊中的表达存在差异ꎬ且ＬＡＴＳ１/ＬＡＴＳ２基因可与ＹＡＰ１基因互作抑制肌肉生长发育[２１]ꎮ此外ꎬ我们前期研究发现ＬＡＴＳ１基因在牛背最长肌等多个组织中高表达ꎬ且其核心启动区结合了肌肉生长发育相关的Ｍｙｏｄ１和ＭＥＦ２Ａ转录因子并调控其转录活性ꎬ初步阐明了ＬＡＴＳ１基因参与牛的肌肉生长发育转录调控机制[２２]ꎮＬＡＴＳ２基因与ＬＡＴＳ１基因同属ＬＡＴＳ基因家族ꎬ其分子序列及结构相似ꎬ因此我们推测ＬＡＴＳ２在牛肌肉生长发育中扮演重要角色ꎬ但其转录机制不清ꎮ鉴于此ꎬ本研究拟构建ＬＡＴＳ２基因在牛不同肌肉组织或器官中的表达谱ꎬ克隆并鉴定其启动子核心区域ꎬ预测ＬＡＴＳ２基因启动子核心区域的关键转录因子ꎬ以期为探究牛ＬＡＴＳ２基因在肌肉生长发育过程中的转录调控机制奠定基础ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀试验样品采集３头２０月龄秦川牛公牛的肝(右叶)㊁背最长肌㊁睾丸㊁肺(中叶)㊁肾(皮质)㊁皮下脂肪㊁心(心房)㊁皱胃(胃壁)㊁大肠(盲肠段)㊁脾(实质)和颈部静脉血样ꎬ迅速置于液氮带回实验室备用ꎮ１.２㊀主要试剂ｐＭＤ￣１９Ｔ(Ｓｉｍｐｌｅ)载体㊁ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬＰｒｅｍｉｘ㊁基因组ＤＮＡ提取试剂盒㊁ＤＨ５α感受态细胞㊁ＤＮＡ凝胶回收试剂盒㊁限制性内切酶ＫｐｎⅠ和ＸｈｏⅠ㊁Ｔ４ＤＮＡ连接酶㊁ＲＮＡ提取试剂盒㊁反转录及荧光定量试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司ꎻ去内毒质粒提取试剂盒购自ＯｍｅｇａＢｉｏ￣Ｔｅｋ公司ꎻＤｕａｌ￣Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ双荧光素酶报告系统购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司ꎻＤＭＥＭ培养基㊁磷酸缓冲盐溶液(ＰＢＳ)㊁ＯＰＴＩ￣ＭＥＭ㊁Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００Ｒｅ￣ａｇｅｎｔ脂质体转染试剂盒及胎牛血清(ＦＢＳ)购自赛默飞世尔科技公司ꎻ双荧光检测试剂盒购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司ꎻｐＧＬ３￣Ｂａｓｉｃ及ｐＲＬ￣４５７江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第３期ＴＫ载体㊁小鼠成肌细胞(Ｃ２Ｃ１２)和小鼠脂肪细胞(３Ｔ３￣Ｌ１)为本实验室保存ꎮ１.３㊀ＲＴ￣ｑＰＣＲ检测首先提取不同组织或器官总ＲＮＡꎬ并按照反转录试剂盒说明书将各个ＲＮＡ进行反转录ꎬ检测ｃＤ￣ＮＡ质量ꎮ利用Ｐｒｉｍｅｒ５.０软件设计ＲＴ￣ｑＰＣＲ引物ꎬ以ＧＡＰＤＨ作为内参基因(引物见表１)ꎬ使用７５００ＦａｓｔＲｅａｌＴｉｍｅ仪器(美国应用生物系统公司产品)进行定量ＰＣＲꎮ反应总体系为２０ ０μｌꎬ其中上/下游引物各０ ８μｌ(引物浓度为１０μｍｏｌ/Ｌ)㊁ｃＤＮＡ模板２ ０μｌ(模板质量浓度为５０ｎｇ/μｌ)㊁ＰｒｉｍｉｘＥｘＴａｑⅡ１０ ０μｌ㊁ＲＯＸＲｅｆｅｒｅｎｃｅＤｙｅⅡ０ ４μｌꎬ剩余用ｄｄＨ２Ｏ补齐ꎮＲＴ￣ｑＰＣＲ反应程序为:９５ħ预变性３０ｓꎻ９５ħ变性５ｓꎬ６０ħ退火３４ｓꎬ循环４０次ꎬ生物学重复３次ꎬ采用２－әәＣｔ法处理分析相对表达量数据[２３]ꎬ数据采用ＳＰＳＳ２０.０软件进行单因素差异性分析ꎮ１.４㊀生物信息学分析结合ＮＣＢＩ数据库(ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ)及ＵＣＳＣ(ｈｔｔｐｓ://ｇｅｎｏｍｅ.ｕｃｓｃ.ｅｄｕ/)网站参考牛基因组信息ꎬ确定ＬＡＴＳ２基因启动子区域ꎮ利用Ｕｎｉｐｒｏｔ(ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｕｎｉｐｒｏｔ.ｏｒｇ/)和ＭＥＧＡ５.０(ｈｔ￣ｔｐｓ://ｗｗｗ.ｍｅｇａｓｏｆｔｗａｒｅ.ｎｅｔ/ｉｎｄｅｘ.ｐｈｐ)构建出ＬＡＴＳ２蛋白进化树ꎬ使用ＥｘｃｅｒｔＳｙＰｒｏｔＰａｒｍ(ｈｔ￣ｔｐｓ://ｗｅｂ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ/ｐｒｏｔｐａｒａｍ/)在线程序进行蛋白质序列分析ꎬ使用Ｓｔｒｉｎｇ(ｈｔｔｐ://ｓｔｒｉｎｇ￣ｄｂ.ｏｒｇ/)预测与ＬＡＴＳ２蛋白互作的蛋白质ꎮ１.５㊀启动子克隆及逐段缺失片段扩增根据牛ＬＡＴＳ２基因启动子序列信息ꎬ设计其启动子全长扩增引物ＬＡＴＳ２￣ＰＦ/ＰＲ(表１)ꎬ引物长度为１９７２ｂｐꎬ包括－１７９２~＋１７９序列ꎮ以基因组ＤＮＡ为模板ꎬ参考ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬＰｒｅｍｉｘ操作手册进行ＰＣＲꎬ总体系２０ ０μｌꎬ其中ꎬ４ ０μｌｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅꎬ１０ ０μｌ２ˑＰｒｉｍｅＳＴＡＲＧＸＬＢｕｆｆｅｒꎬ上/下游引物各０ ８μｌ(浓度为１０μｍｏｌ/Ｌ)ꎬ１ ０μｌＰｒｉｍｅ￣ＳＴＡＲＧＸＬＤＮＡ聚合酶ꎬ底物１ ０μｌ(质量浓度为５０ｎｇ/μｌ)ꎬ２ ４μｌｄｄＨ２ＯꎮＰＣＲ扩增程序使用３步法:９８ħ１０ｓꎬ６０ħ２０ｓꎬ６８ħ１５ｓꎬ循环３５次ꎮＰＣＲ扩增产物用１％琼脂糖凝胶电泳检测ꎬ预期片段纯化回收后与ｐＭＤ￣１９Ｔ(Ｓｉｍｐｌｅ)载体连接ꎬ转化后筛选阳性克隆进行测序鉴定ꎮ根据测序结果ꎬ设计５ᶄ端逐段缺失片段的上游引物(Ｆ１~Ｆ７)和１条固定的下游引物(Ｒ)ꎬ在引物５ᶄ端添加ＫｐｎⅠ和ＸｈｏⅠ双酶切位点(表１)ꎬ以ＬＡＴＳ２基因－１７９２~＋１７９序列为模板进行缺失片段的ＰＣＲ扩增反应(扩增体系㊁程序同上)ꎬ将扩增片段分别连接ｐＭＤ￣１９Ｔ(Ｓｉｍｐｌｅ)载体进行测序鉴定ꎮ得到的逐段缺失片段分别命名为:ＬＡＴＳ２￣Ｐ１㊁ＬＡＴＳ２￣Ｐ２㊁ＬＡＴＳ２￣Ｐ３㊁ＬＡＴＳ２￣Ｐ４㊁ＬＡＴＳ２￣Ｐ５㊁ＬＡＴＳ２￣Ｐ６和ＬＡＴＳ２￣Ｐ７ꎮ表１㊀引物信息Ｔａｂｌｅ１㊀Ｐｒｉｍｅｒｓｕｓｅｄｉｎｔｈｅｓｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ项目㊀引物名称㊀㊀㊀引物序列(５ᶄң３ᶄ)退火温度(ħ)扩增片段长度(ｂｐ)扩增区域收录号荧光定量ＰＣＲＧＡＰＤＨ￣ＦＧＡＰＤＨ￣ＲＣＣＡＡＣＧＴＧＴＣＴＧＴＴＧＴＧＧＡＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴＧＡ６０.０８０３２０~５２１ＮＭ＿００１０３４０３４.２ＬＡＴＳ２￣ＦＬＡＴＳ２￣ＲＡＧＧＡＣＧＧＣＡＧＴＧＡＧＧＡＣＡＧＣＧＣＡＴＣＧＧＡＡＣＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＴＧ６０.０１３１３２１３~３３４４ＸＭ＿０２５００００９２.１启动子区域克隆ＬＡＴＳ２￣ＰＦＬＡＴＳ２￣ＰＲＡＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＣＣＡＡＴＡＡＴＧＣＡＣＡＧＡＡＡＴＣＣＣＡＡＣＴＡＡＣＴ６５.５１９７２－１７９２~＋１７９ＮＣ＿０３７３３６.１ＬＡＴＳ２￣Ｆ１ＧＧＧＧＴＡＣＣＣＧＡＣＴＧＡＧＣＧＡＣＴＧＡＡＣＴＧＡＡＧ６１.０１９７２－１７９２~＋１７９ＮＣ＿０３７３３６.１ＬＡＴＳ２￣Ｆ２ＧＧＧＧＴＡＣＣＴＡＡＧＴＧＧＡＴＣＧＣＣＡＧＴＧＴＴＧＣ６０.５１６５５－１４７５~＋１７９ＮＣ＿０３７３３６.１ＬＡＴＳ２￣Ｆ３ＧＧＧＧＴＡＣＣＣＴＴＣＣＣＣＴＡＡＧＡＡＣＧＡＡＣＡＣＣＣ６１.５１２７８－１０９８~＋１７９ＮＣ＿０３７３３６.１ＬＡＴＳ２￣Ｆ４ＧＧＧＧＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＧＡＡＴＧＴＣＡＡＴＣＴＴＧＧＡＴ６４.０９０７－７２７~＋１７９ＮＣ＿０３７３３６.１ＬＡＴＳ２￣Ｆ５ＧＧＧＧＴＡＣＣＧＧＧＡＧＴＧＣＴＴＧＡＴＡＣＴＧＡＧＡＡ６２.５６９５－５１５~＋１７９ＮＣ＿０３７３３６.１ＬＡＴＳ２￣Ｆ６ＧＧＧＧＴＡＣＣＴＣＡＣＴＡＣＴＣＣＣＣＡＣＡＧＡＧＡＡＣ６０.０４２８－２４８~＋１７９ＮＣ＿０３７３３６.１ＬＡＴＳ２￣Ｆ７ＧＧＧＧＴＡＣＣＡＣＡＴＴＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＴＣＧＧ５９.５２３６－５６~＋１７９ＮＣ＿０３７３３６.１ＬＡＴＳ２￣ＲＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＣＡＣＡＧＡＡＡＴＣＣＣＡＡＣＴＡＡＣＴＮＣ＿０３７３３６.１Ｆ为上游引物ꎬＲ为下游引物ꎬ斜体碱基表示ＫｐｎⅠ(ＧＧＧＧＴＡＣＣ)和ＸｈｏⅠ(ＣＣＧＣＴＣＧＡＧ)酶切位点ꎮ５５７张久盘等:牛ＬＡＴＳ２基因启动子克隆及转录调控分析１.６㊀双荧光素报告载体构建使用内切酶ＫｐｎⅠ和ＸｈｏⅠ将ＬＡＴＳ２￣Ｐ１~ＬＡＴＳ２￣Ｐ７片段和ｐＧＬ３￣Ｂａｓｉｃ载体在３７ħ条件下酶切１ｈꎬ酶切完成后进行目的片段纯化回收ꎮ进一步将ＬＡＴＳ２￣Ｐ１~ＬＡＴＳ２￣Ｐ７片段分别和ｐＧＬ３￣Ｂａｓｉｃ载体用Ｔ４ＤＮＡ连接酶(１６ħ条件下)连接１ｈꎮ将产物转化至ＤＨ５α感受态细胞培养后筛选阳性克隆并鉴定ꎬ进一步使用去内毒质粒提取试剂盒提取质粒ꎬ备用ꎮ１.７㊀细胞培养、转染及测定酶活性复苏Ｃ２Ｃ１２和３Ｔ３￣Ｌ１ꎬ培养基为１０％胎牛血清(ＦＢＳ)＋９０％ＤＭＥＭ培养基ꎬ待其生长状态良好且密度达到７０％~８０％后进行传代培养ꎮ传代生长后选择形态良好的细胞进行２４孔板铺板ꎬ按照Ｌｉｐｏ￣ｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００Ｒｅａｇｅｎｔ脂质体转染试剂盒说明书ꎬ分别将构建好的双荧光素报告载体ＬＡＴＳ２￣ｐＧＬ３￣Ｐ１~ＬＡＴＳ２￣ｐＧＬ３￣Ｐ７８００ｎｇ重组质粒和２０ｎｇ内参质粒ｐＲＬ￣ＴＫ共转染至Ｃ２Ｃ１２和３Ｔ３￣Ｌ１ꎬ进行３次重复ꎬ阴性对照为ｐＧＬ３￣Ｂａｓｉｃ质粒ꎮ在转染４８ｈ后进行细胞收集ꎬ利用双荧光检测试剂盒进行荧光素酶和海肾荧光素酶活性测定ꎬ计算二者的比值ꎬ确定ＬＡＴＳ２基因的启动子核心区域ꎮ１.８㊀关键转录因子预测通过ＪＡＳＰＡＲ(ｈｔｔｐ://ｊａｓｐａｒ.ｇｅｎｅｒｅｇ.ｎｅｔ/)和Ｇｅｎｏｍａｔｉｘ(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｇｅｎｏｍａｔｉｘ.ｄｅ/ｃｇｉ￣ｂｉｎ//ｍａｔ￣ｉｎｓｐｅｃｔｏｒ)在线软件分析启动子核心区域序列ꎬ预测阈值设置为９０％以上ꎬ选取２个网站预测结果的共同部分ꎬ筛选ＬＡＴＳ２基因的启动子核心区域关键的转录因子结合位点ꎮ１.９㊀数据分析数据结果以平均值ʃ标准差表示ꎬ数据显著性检验使用ＳＰＳＳ１８.０软件进行单因素方差分析(Ｐ<０ ０１为差异极显著ꎻＰ<０ ０５为差异显著)ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀ＬＡＴＳ２基因组织表达规律㊀㊀ＲＴ￣ｑＰＣＲ结果(图１)显示ꎬＬＡＴＳ２基因在肝㊁背最长肌㊁睾丸㊁肺㊁肾㊁皮下脂肪㊁心㊁皱胃㊁大肠和脾中均检测出表达信号ꎬ以脾中的表达量作为对照ꎬ该基因在肝和背最长肌中的表达极显著地高于脾(Ｐ<０ ０１)ꎬ其次在睾丸中高表达(Ｐ<０ ０５)ꎬ在肺㊁肾㊁皮下脂肪㊁心㊁皱胃㊁大肠和脾中表达量较低ꎮ∗表示差异显著(Ｐ<０ ０５)ꎻ∗∗表示差异极显著(Ｐ<０ ０１)ꎮ图１㊀ＬＡＴＳ２基因在牛不同组织或器官中的ｍＲＮＡ相对表达量Ｆｉｇ.１㊀ＴｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓｏｒｏｒｇａｎｓｏｆｃａｔｔｌｅ２.２㊀牛ＬＡＴＳ２基因的结构特征及进化树构建ＬＡＴＳ２基因位于第１２号染色体ꎬ全长５１０９６ｂｐꎬ包括９个外显子和８个内含子ꎬ共转录３０４８ｂｐ的ｍＲＮＡ序列ꎬ可编码１０１５个氨基酸(图２)ꎬＬＡＴＳ２蛋白分子式为Ｃ４８８２Ｈ７６２８Ｎ１４１８Ｏ１４２５Ｓ３５ꎬ其相对分子质量为１１０１１０ꎬ等电点(ｐＩ)为８ ８４ꎮ㊀㊀以ＬＡＴＳ２蛋白序列为对象ꎬ利用ＭＥＧＡ５.０软件构建牛㊁绵羊㊁山羊㊁马㊁猪㊁小鼠等物种的系统进化树(图３)ꎮ构建出的系统进化树表明ＬＡＴＳ２蛋白在牛㊁绵羊㊁山羊㊁马㊁猪㊁小鼠等物种中进化较为保守ꎬ反刍动物在进化过程中单独聚为１支ꎬ上述结果表明ＬＡＴＳ２具有重要功能且在反刍动物进化过程中极度保守ꎮ２.３㊀牛ＬＡＴＳ２蛋白互作分析使用Ｓｔｒｉｎｇ(ｈｔｔｐ://ｓｔｒｉｎｇ￣ｄｂ.ｏｒｇ/)预测与ＬＡＴＳ２蛋白互作的蛋白质ꎬ得到图４所示的蛋白质互作网络ꎮ网络中与ＬＡＴＳ２蛋白互作紧密的前１０种蛋白质分别为ＹＡＰ１㊁ＭＯＢ１Ａ㊁ＭＯＢ１Ｂ㊁ＳＡＶ１㊁ＡＭＯＴＬ２㊁ＷＷＣ１㊁ＷＷＴＲ１㊁ＡＭＯＴ㊁ＡＭＯＴＬ１㊁ＮＦ２ꎬ分析其信息ꎬ与ＫＥＧＧ收录的Ｈｉｐｐｏ信号通路成员及Ｂｉｏｇｒｉｄ收录的与ＹＡＰ１互作的蛋白质进行比对后ꎬ发现筛选出的上述蛋白质均为Ｈｉｐｐｏ信号通路中的关键蛋白质ꎮ２.４㊀ＬＡＴＳ２基因启动子核心区域鉴定通过ＰＣＲ扩增到牛ＬＡＴＳ２基因启动子１.７ｋｂ序列ꎬ根据逐段缺失引物进行ＰＣＲ扩增ꎬ获得７个逐段缺失的ＬＡＴＳ２基因启动子片段(逐段缺失片段扩增电泳见图５)ꎮ进一步连接ｐＧＬ３￣Ｂａｓｉｃ载体ꎬ构建得到了逐段缺失重组质粒ꎬ将其命名为:ｐＬＡＴＳ２－１７９２~＋１７９㊁ｐＬＡＴＳ２－１４７５~＋１７９㊁ｐＬＡＴＳ２－１０９８~＋１７９㊁ｐＬＡＴＳ２６５７江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第３期图２㊀牛ＬＡＴＳ２基因结构示意图Ｆｉｇ.２㊀ＴｈｅｓｃｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｏｆｂｏｖｉｎｅＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅ图３㊀基于牛ＬＡＴＳ２蛋白序列构建进化树Ｆｉｇ.３㊀ＥｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｔｒｅｅｂａｓｅｄｏｎｂｏｖｉｎｅＬＡＴＳ２ｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅ图４㊀牛ＬＡＴＳ２蛋白相互作用预测Ｆｉｇ.４㊀ＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｗｉｔｈＬＡＴＳ２ｉｎｃａｔｔｌｅ－７２７~＋１７９㊁ｐＬＡＴＳ２－５１５~＋１７９㊁ｐＬＡＴＳ２－２４８~＋１７９和ｐＬＡＴＳ２－５６~＋１７９ꎮ测序鉴定后ꎬ使用Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００Ｒｅａｇｅｎｔ脂质体分别将ｐＧＬ３￣Ｂａｓｉｃ质粒和７个重Ｍ:ＤＬ４５００ＤＮＡｍａｒｋｅｒꎻ泳道１~７分别为ＬＡＴＳ２－１７９２~＋１７９㊁ＬＡＴＳ２－１４７５~＋１７９㊁ＬＡＴＳ２－１０９８~＋１７９㊁ＬＡＴＳ２－７２７~＋１７９㊁ＬＡＴＳ２－５１５~＋１７９㊁ＬＡＴＳ２－２４８~＋１７９㊁ＬＡＴＳ２－５６~＋１７９扩增片段电泳图ꎬ片段长度分别为１９７２ｂｐ㊁１６５５ｂｐ㊁１２７８ｂｐ㊁９０７ｂｐ㊁６９５ｂｐ㊁４２８ｂｐ㊁２３６ｂｐꎮ图５㊀牛ＬＡＴＳ２基因启动子逐段缺失片段扩增电泳图Ｆｉｇ.５㊀ＧｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆｂｏｖｉｎｅＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｐｒｏｍｏｔｅｒ组质粒转染至３Ｔ３￣Ｌ１和Ｃ２Ｃ１２细胞系ꎬ检测启动子的活性ꎮ相对荧光素酶活性数值(图６)显示ꎬＬＡＴＳ２基因７５７张久盘等:牛ＬＡＴＳ２基因启动子克隆及转录调控分析启动子区域的１ ７ｋｂ序列在Ｃ２Ｃ１２和３Ｔ３￣Ｌ１细胞系中均有较高的转录活性ꎮ当缺失－１０９８~－７２７片段后ꎬｐＬＡＴＳ２－７２７~＋１７９较ｐＬＡＴＳ２－１０９８~＋１７９酶活性在Ｃ２Ｃ１２细胞系中显著下降(Ｐ<０ ０５)ꎻ进一步缺失启动子片段－２４８~－５６ꎬ发现ｐＬＡＴＳ２－５６~＋１７９较ｐＬＡＴＳ２－２４８~＋１７９酶活性在Ｃ２Ｃ１２和３Ｔ３￣Ｌ１细胞系中均极显著下降(Ｐ<０ ０１)ꎬ分别下降了７９ ４％和７５ ６％ꎮ上述研究结果表明ꎬＬＡＴＳ２基因启动子区域的１ ７ｋｂ序列活性较高ꎬ具备调控基因转录活性的功能ꎻ－２４８~－５６为ＬＡＴＳ２基因启动子核心区域ꎻＬＡＴＳ２基因在Ｃ２Ｃ１２细胞系的转录活性高于３Ｔ３￣Ｌ１ꎮ２.５㊀启动子核心区域的关键转录因子鉴定利用Ｇｅｎｏｍａｔｉｘ和ＪＡＳＰＡＲ软件对ＬＡＴＳ２基因启动子区和核心区域(－２４８~－５６)进行分析并对潜在的关键转录因子进行预测ꎬ结果(图７)显示ꎬＬＡＴＳ２基因启动子核心区域包含转录增强因子ＴＥＦ１(ＴＥＡＤ１)㊁肌肉细胞特异性增强因子２Ａ(ＭＥＦ２Ａ)㊁ＦＯＳ样抗原１(ＦＯＳＬ１)㊁肌细胞生成素(Ｍｙｏｇ)和生肌决定因子(Ｍｙｏｄ１)ꎬ初步推测转录因子ＴＥＡＤ１㊁ＭＥＦ２Ａ㊁ＦＯＳＬ１㊁Ｍｙｏｇ和Ｍｙｏｄ１可能对ＬＡＴＳ２基因的转录活性有重要的调控作用ꎮ左边为ＬＡＴＳ２基因启动子双荧光素逐段缺失片段示意图ꎬ右边为酶活性检测数值ꎮＬｕｃ表示双荧光素酶报告载体ꎮＣ２Ｃ１２表示小鼠成肌细胞ꎻ３Ｔ３￣Ｌ１表示小鼠脂肪细胞ꎮ∗表示差异显著(Ｐ<０ ０５)ꎻ∗∗表示差异极显著(Ｐ<０ ０１)ꎮ图６㊀ＬＡＴＳ２基因启动子核心区域缺失片段报告载体相对荧光素酶活性Ｆｉｇ.６㊀ＲｅｌａｔｉｖｅｌｕｃｉｆｅｒａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｃｏｒｅｐｒｏｍｏｔｅｒｄｅｌｅｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｒｅｐｏｒｔｅｒｖｅｃｔｏｒ３㊀讨论骨骼肌是动物躯体最重要的组成部分ꎬ占胴体质量的４０％左右ꎬ其发育程度直接影响甚至决定家畜的产肉量ꎬＬＡＴＳ２基因对细胞的增殖㊁凋亡以及骨骼肌的形成有重要的调控作用ꎬ而调控机制并不清楚ꎮ已有文献报道ꎬＬＡＴＳ１基因[２１]㊁ＬＡＴＳ２基因[１９]与湖羊肌肉生长发育显著相关ꎮ因此ꎬ本试验开展了牛ＬＡＴＳ２基因有关研究ꎬ成功克隆了牛ＬＡＴＳ２基因启动子ꎬ检测了启动子活性并鉴定到启动子核心区域ꎬ预测到该基因启动子核心区域中的重要转录因子ꎬ为探究牛ＬＡＴＳ２基因在肌肉生长发育中的转录调控机制奠定基础ꎮ本研究中ꎬ牛ＬＡＴＳ２基因在肝㊁背最长肌㊁睾丸㊁肺㊁肾㊁皮下脂肪㊁心㊁皱胃㊁大肠和脾等不同组织或器官中均有表达ꎬ在肝中的表达量最高ꎬ背最长肌其次ꎬ在心㊁肺㊁皮下脂肪㊁肾㊁皱胃㊁大肠和脾等组织或器官中相对表达量较低ꎮ上述研究结果表明ＬＡＴＳ２基因在牛不同组织或器官中的相对表达量有差异ꎬ该基因的高表达可能影响肝以及肌肉组织的８５７江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第３期下划线为引物序列ꎬ方框表示相对应的转录因子结合位点ꎬ箭头指示转录起始位点ꎮＦＥＡＤ１:转录增强因子ＴＥＦ１ꎻＭＥＦ２Ａ:肌肉细胞特异性增强因子２ＡꎻＦＯＳＬ１:ＦＯＳ样抗原１ꎻＭｙｏｇ:肌细胞生成素ꎻＭｙｏｄ１:生肌决定因子ꎮ图７㊀牛ＬＡＴＳ２基因启动子核心区域的转录因子预测Ｆｉｇ.７㊀ＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｉｎｔｈｅｃｏｒｅｒｅｇｉｏｎｏｆｂｏｖｉｎｅＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｐｒｏｍｏｔｅｒ正常发育ꎬ这同ＬＡＴＳ２基因表达量与湖羊肌肉生长发育显著相关[１９]的结果一致ꎮ系统进化树结果显示ꎬＬＡＴＳ２基因在反刍动物进化过程中保守性较高ꎻ预测出的前１０种互作蛋白质均为Ｈｉｐｐｏ信号通路中重要的转录调控因子ꎮＨｉｐｐｏ通路的核心是一个激酶级联反应ꎬ其中ꎬＳＡＶ１和ＭＯＢ１形成一种复合体并在细胞质中被磷酸化来调控ＬＡＴＳ１/２表达ꎬ待ＬＡＴＳ１/２被激活后ꎬ其激酶反过来去磷酸化并抑制转录共激活因子ＹＡＰ和ＴＡＺꎮ去磷酸化的ＹＡＰ/ＴＡＺ进入细胞核后与ＴＥＡＤ１￣４等多种转录因子发生互作ꎬ从而抑制凋亡的基因表达并诱导细胞增殖[２４￣２５]ꎮ研究发现ＬＡＴＳ１/２和Ｍｓｔ１/２可通过ＫＩＢＲＡ㊁ＮＦ２㊁ＲＡＳＳＦ等多种上游信号分子调控Ｈｉｐ￣ｐｏ信号通路的活性ꎬ如ＡＭＯＴ等因子通过结合ＬＡＴＳ１/２将ＹＡＰ/ＴＡＺ等因子紧密连接在细胞质中ꎬＹＡＰ/ＴＡＺ的磷酸化可进行细胞信号调控ꎮＹＡＰ/ＴＡＺ和ＬＡＴＳ１/２的稳定性可通过蛋白质泛素化进行调控[２６]ꎮ综上ꎬＬＡＴＳ２基因在细胞信号转导及细胞增殖分化中起重要作用ꎮ通过启动子逐段缺失载体活性检测ꎬ发现牛ＬＡＴＳ２基因启动子核心区域位于－２４８~－５６ꎬ进一步预测牛ＬＡＴＳ２基因启动子核心区域有ＴＥＡＤ１㊁ＭＥＦ２Ａ㊁ＦＯＳＬ１㊁Ｍｙｏｇ和Ｍｙｏｄ１等转录因子结合位点ꎮ研究结果表明ꎬＴＥＡＤ１可调控肌肉特异性基因ＴＮＮＴ２㊁Ｍｈｃ㊁α￣ａｃｔｉｎ[２７]和ＣＯＬ１Ａ１[２８]的表达ꎬ在心肌㊁骨骼肌㊁平滑肌的发育方面有至关重要的调控作用[２７￣２９]ꎮＴＥＡＤ１蛋白还可以与Ｈｉｐｐｏ信号通路中ＹＡＰ蛋白形成蛋白质复合物ꎬ从而抑制细胞增殖㊁促进细胞凋亡[３０]ꎮＭＥＦ２Ａ作为肌肉发生的重要核心因子ꎬ对骨骼肌和心肌细胞的增殖和分化有重要调控作用[３１]ꎬ同时能够促进生长因子㊁肌球蛋白重链及胶原对损伤骨骼肌的修复[３２]ꎻ该因子能够特异性识别并结合大多数肌肉基因启动子中的Ａ/Ｔ序列ꎬ从而增强相关基因的表达[３３]ꎮＦＯＳＬ１是转录因子ＡＰ￣１复合体的组分之一ꎬ参与细胞的增殖和分化ꎬ抑制细胞凋亡ꎬ可介导Ｋｒａｓ通路调控细胞周期蛋白质ꎬ诱导骨骼的发育[３４]ꎮＭｙｏｇ和Ｍｙｏｄ１作为调控肌肉细胞增殖㊁分化及肌纤维形成的关键基因[３５]ꎬ突变会显著影响肌肉纤维和肉质特性[３６]ꎮ其中ꎬＭｙｏｄ１对发育初级阶段肌肉的可塑性和再生起关键作用[３５]ꎬ当Ｍｙｏｄ１与ＰＡＸ７共表达时ꎬ可激活基底膜静息的肌肉卫星细胞使其增殖[３７]ꎻＭｙｏｇ通过调节肌肉肌酸激酶影响骨骼肌的发生发育[３８]ꎬ研究结果表明ꎬ敲除小鼠Ｍｙｏｇ基因后骨骼肌发育受损ꎬ出生后肌肉会出现萎缩现象[３９]ꎮ以上研究结果表明ꎬＴＥＡＤ１㊁ＭＥＦ２Ａ㊁ＦＯＳＬ１㊁Ｍｙｏｇ和Ｍｙｏｄ１转录因子在个体生长发育以及肌肉形成过程中起重要作用ꎬ结合本研究关于转录因子结合位点的预测ꎬ我们可以推断出上述５种转录因子对ＬＡＴＳ２基因的转录可能起重要调控作用ꎮ但对于这一推断将来还需要结合定点突变㊁凝胶迁移(ＥＭＳＡ)㊁染色质免疫共沉淀(ＣｈＩＰ)等技术手段进行深入研究ꎮ４㊀结论牛ＬＡＴＳ２基因启动子核心区域位于－２４８~－５６ꎬ启动子核心区域预测到ＴＥＡＤ１㊁ＭＥＦ２Ａ㊁９５７张久盘等:牛ＬＡＴＳ２基因启动子克隆及转录调控分析ＦＯＳＬ１㊁Ｍｙｏｇ和Ｍｙｏｄ１转录因子结合位点ꎮＬＡＴＳ２基因的组织表达规律㊁启动子核心区域的转录因子结合位点预测及ＬＡＴＳ２蛋白互作分析结果均表明ＬＡＴＳ２基因在牛肌肉生长发育中扮演重要角色ꎮ以上结果为探究牛ＬＡＴＳ２基因在肌肉生长发育中的转录调控机制奠定基础ꎮ参考文献:[１]㊀ＢＥＲＲＹＤＰꎬＷＡＬＬＥꎬＰＲＹＣＥＪＥ.Ｇｅｎｅｔｉｃｓａｎｄｇｅｎｏｍｉｃｓｏｆｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｉｎｄａｉｒｙａｎｄｂｅｅｆｃａｔｔｌｅ[Ｊ].Ａｎｉｍａｌ:ＡｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅꎬ２０１４ꎬ８(１):１０５￣１２１. [２]㊀ＨＪＯＲＴＨＭꎬＰＯＵＲＴＥＹＭＯＵＲＳꎬＧÖＲＧＥＮＳＳＷꎬｅｔａｌ.Ｍｙｏ￣ｓｔａｔｉｎｉｎｒｅｌａｔｉｏｎｔｏｐｈｙｓｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｄｙｓｇｌｙｃａｅｍｉａａｎｄｉｔｓｅｆｆｅｃｔｏｎｅｎｅｒｇｙｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎｈｕｍａｎｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌ[Ｊ].ＡｃｔａＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａꎬ２０１６ꎬ２１７(１):４５￣６０.[３]㊀ＦＲＯＮＴＥＲＡＷＲꎬＯＣＨＡＬＡＪ.Ｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅ:ａｂｒｉｅｆｒｅｖｉｅｗｏｆｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎ[Ｊ].ＣａｌｃｉｆｉｅｄＴｉｓｓｕｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌꎬ２０１５ꎬ９６(３):１８３￣１９５.[４]㊀ＴＡＪＢＡＫＨＳＨＳ.Ｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｖｅｒ￣ｓｕｓｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｔｅｒｎａｌＭｅｄｉｃｉｎｅꎬ２００９ꎬ２６６(４):３７２￣３８９.[５]㊀ＢＯＵＫＨＡＡꎬＢＯＮＦＡＴＴＩＶꎬＣＥＣＣＨＩＮＡＴＯＡꎬｅｔａｌ.Ｇｅｎｅｔｉｃｐａ￣ｒａｍｅｔｅｒｓｏｆｃａｒｃａｓｓａｎｄｍｅａｔｑｕａｌｉｔｙｔｒａｉｔｓｏｆｄｏｕｂｌｅｍｕｓｃｌｅｄＰｉ￣ｅｍｏｎｔｅｓｅｃａｔｔｌｅ[Ｊ].ＭｅａｔＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０１１ꎬ８９(１):８４￣９０. [６]㊀ＷＥＩＤＷꎬＦＥＮＧＬＳꎬＺＨＡＮＧＷＺꎬｅｔａｌ.ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎｏｆｂｏｖｉｎｅＳＩＸ４:ｒｏｌｅｓｏｆＥ￣ｂｏｘａｎｄＭｙｏＤｉｎｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｂａｓａｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ[Ｊ].ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉ￣ｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓꎬ２０１８ꎬ４９６(１):４４￣５０. [７]㊀ＷＥＩＤＷꎬＭＡＸＹꎬＺＨＡＮＧＳꎬｅｔａｌ.ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎｏｆｔｈｅｂｏｖｉｎｅＳＩＸ１ｇｅｎｅ:ｒｏｌｅｓｏｆＭｙｏＤꎬＰＡＸ７ꎬＣＲＥＢａｎｄＭｙｏＧ[Ｊ].ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｐｏｒｔｓꎬ２０１７ꎬ７(１).ＤＯＩ:１０.１０３８/Ｓ４１５９８￣０１７￣１２７８７￣５.[８]㊀ＷＥＩＤＷꎬＧＵＩＬＳꎬＲＡＺＡＳＨＡꎬｅｔａｌ.ＮＲＦ１ａｎｄＺＳＣＡＮ１０ｂｉｎｄｔｏｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎｏｆｔｈｅＳＩＸ１ｇｅｎｅａｎｄｔｈｅｉｒｅｆｆｅｃｔｓｂｏｄｙｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓｉｎＱｉｎｃｈｕａｎｃａｔｔｌｅ[Ｊ].ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｐｏｒｔｓꎬ２０１７ꎬ７(１).ＤＯＩ:１０.１０３８/Ｓ４１５９８￣０１７￣０８３８４￣１.[９]㊀ＲＡＺＡＳＨＡꎬＫＡＳＴＥＲＮꎬＫＨＡＮＲꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｒｏｌｅｏｆｍｉｃｒｏＲ￣ＮＡｓｉｎｍｕｓｃｌｅｔｉｓｓｕｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｉｎｂｅｅｆｃａｔｔｌｅ[Ｊ].Ｇｅｎｅｓꎬ２０２０ꎬ１１(３).ＤＯＩ:１０.３３９０/ｇｅｎｅｓ１１０３０２９５.[１０]ＹＵＥＢＬꎬＬＩＨꎬＬＩＵＭꎬｅｔａｌ.ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｌｎｃＲＮＡ￣ｍｉＲ￣ＮＡ￣ｍＲＮＡｎｅｔｗｏｒｋｔｏｒｅｖｅａｌｐｏｔｅｎｔｉａｌｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｃｅＲＮＡｓｉｎｂｏｖｉｎｅｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓꎬ２０１９ꎬ１０.ＤＯＩ:１０.３３８９/ｆｇｅｎｅ.２０１９.０００９１.[１１]ＦＵＹＹꎬＬＩＳꎬＴＯＮＧＨＬꎬｅｔａｌ.ＷＤＲ１３ｐｒｏｍｏｔｅｓｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉ￣ａｔｉｏｎｏｆｂｏｖｉｎｅｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅ￣ｄｅｒｉｖｅｄｓａｔｅｌｌｉｔｅｃｅｌｌｓｂｙａｆｆｅｃｔｉｎｇＰＩ３Ｋ/ＡＫＴｓｉｇｎａｌｉｎｇ[Ｊ].ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌꎬ２０１９ꎬ４３(７):７９９￣８０８.[１２]ＬＩＡＮＬꎬＫＩＭＪꎬＯＫＡＺＡＷＡＨꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｒｏｌｅｏｆＹＡＰｔｒａｎｓｃｒｉｐ￣ｔｉｏｎｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｓｔｅｍｃｅｌｌｓｅｌｆ￣ｒｅｎｅｗａｌａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ￣ｔｉｏｎ[Ｊ].Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔꎬ２０１０ꎬ２４(１１):１１０６￣１１１８. [１３]ＺＨＡＮＧＬꎬＹＵＥＴꎬＪＩＡＮＧＪ.Ｈｉｐｐｏｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙａｎｄｏｒｇａｎｓｉｚｅｃｏｎｔｒｏｌ[Ｊ].Ｆｌｙ(Ａｕｓｔｉｎ)ꎬ２００９ꎬ３(１):６８￣７３.[１４]ＹＩＪꎬＬＵＬꎬＹＡＮＧＥＲＫꎬｅｔａｌ.Ｌａｒｇｅｔｕｍｏｒｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｈｏｍｏｌｏｇｓ１ａｎｄ２ｒｅｇｕｌａｔｅｍｏｕｓｅｌｉｖｅｒｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｍａｔｕ￣ｒａｔｉｏｎｔｈｒｏｕｇｈａｎｔａｇｏｎｉｓｍｏｆｔｈｅｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒｓＹＡＰａｎｄＴＡＺ[Ｊ].Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙꎬ２０１６ꎬ６４(５):１７５７￣１７７２.[１５]ＦＵＲＴＨＮꎬＡＹＬＯＮＹ.ＴｈｅＬＡＴＳ１ａｎｄＬＡＴＳ２ｔｕｍｏｒｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ:ｂｅｙｏｎｄｔｈｅＨｉｐｐｏｐａｔｈｗａｙ[Ｊ].ＣｅｌｌＤｅａｔｈ＆Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎꎬ２０１７ꎬ２４(９):１４８８￣１５０１.[１６]姚春和ꎬ张荣.ｍｉＲ￣３７２靶向ＬＡＴＳ２对结肠癌ＳＷ６２０细胞增殖㊁迁移侵袭的影响[Ｊ].广西医科大学学报ꎬ２０２１ꎬ３８(１０):１９０６￣１９１１.[１７]ＭＣＮＥＩＬＬＨꎬＲＥＧＩＮＥＮＳＩＡ.Ｌａｔｓ１/２ｒｅｇｕｌａｔｅＹａｐ/Ｔａｚｔｏｃｏｎｔｒｏｌｎｅｐｈｒｏｎｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｆｏｒ￣ｍａｔｉｏｎ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｏｆＮｅｐｈｒｏｌｏｇｙꎬ２０１７ꎬ２８(３):８５２￣８６１.[１８]冯瑞军ꎬ郑远航ꎬ盛智梅.外泌体ｍｉＲ￣５７４￣５Ｐ通过下调大肿瘤抑制基因２促进胶质瘤增殖㊁侵袭和迁移[Ｊ].中国生物化学与分子生物学报ꎬ２０２１ꎬ３８(１１):１５２０￣１５２７.[１９]王利宏ꎬ王庆增ꎬ鲍建军ꎬ等.Ｈｉｐｐｏ信号通道中Ｌａｔｓ２基因表达与湖羊肌肉生长发育的关系[Ｊ].南京农业大学学报ꎬ２０１８ꎬ４１(３):５１９￣５２５.[２０]鲍建军ꎬ苏㊀锐ꎬ王庆增ꎬ等.Ｓｍａｄｓ与Ｈｉｐｐｏ通道中ＹＡＰ１基因在湖羊肌肉组织中时空表达研究及关联分析[Ｊ].中国农业科学ꎬ２０１６ꎬ４９(１１):２２０３￣２２１３.[２１]张玉龙.Ｈｉｐｐｏ信号通道中Ｌａｔｓ１基因对湖羊肌肉生长性状遗传调控的初步研究[Ｄ].扬州:扬州大学ꎬ２０１３.[２２]ＷＥＩＤꎬＲＡＺＡＳＨＡꎬＷＡＮＧＸꎬｅｔａｌ.Ｔｉｓｓｕｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙ￣ｓｉｓꎬｃｌｏｎｉｎｇꎬａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅ５ᶄ￣ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｒｅｇｉｏｎｏｆｔｈｅｂｏｖｉｎｅＬＡＴＳ１ｇｅｎｅ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０２２ꎬ９.ＤＯＩ:１０.３３８９/ｆｖｅｔｓ.２０２２.８５３８１９.[２３]ＬＩＶＡＫＫＪꎬＳＣＨＭＩＴＴＧＥＮＴＤ.Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｅｌａｔｉｖｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓ￣ｓｉｏｎｄａｔａｕｓｉｎｇｒｅａｌ￣ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲａｎｄｔｈｅ２－әәＣｔｍｅｔｈｏｄ[Ｊ].Ｍｅｔｈｏｄｓꎬ２００１ꎬ２５(４):４０２￣４０８.[２４]ＢＡＤＯＵＥＬＣꎬＭＣＮＥＩＬＬＨ.ＳｎａｐＳｈｏｔ:ｔｈｅｈｉｐｐｏｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈ￣ｗａｙ[Ｊ].Ｃｅｌｌꎬ２０１１ꎬ１４５(３).ＤＯＩ:１０.１０１６/ｊ.ｃｅｌｌ.２０１１.０４.００９. [２５]ＺＨＡＯＢꎬＴＵＭＡＮＥＮＧＫꎬＧＵＡＮＫＬ.Ｔｈｅｈｉｐｐｏｐａｔｈｗａｙｉｎｏｒ￣ｇａｎｓｉｚｅｃｏｎｔｒｏｌꎬｔｉｓｓｕｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎａｎｄｓｔｅｍｃｅｌｌｓｅｌｆ￣ｒｅｎｅｗａｌ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０１１ꎬ１３(８):８７７￣８８３.[２６]ＯᶄＨＡＹＲＥＭꎬＤＥＧＥＳＥＭＳꎬＧＵＴＫＩＮＤＪＳ.ＮｏｖｅｌｉｎｓｉｇｈｔｓｉｎｔｏＧｐｒｏｔｅｉｎａｎｄＧｐｒｏｔｅｉｎ￣ｃｏｕｐｌｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒｓｉｇｎａｌｉｎｇｉｎｃａｎｃｅｒ[Ｊ].ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０１４ꎬ２７:１２６￣１３５.[２７]ＬＩＵＦꎬＷＡＮＧＸꎬＨＵＧꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＴＥＡＤ１ｒｅｐｒｅｓｓｅｓｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｂｙａｂｏｌｉｓｈｉｎｇｍｙｏｃａｒｄｉｎｆｕｎｃｔｉｏｎ[Ｊ].ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２０１４ꎬ２８９(６):３３０８￣３３１６.[２８]ＡＭＢＲＯＳＩＮＯＣꎬＩＷＡＴＡＴꎬＳＣＡＦＯＧＬＩＯＣꎬｅｔａｌ.ＴＥＦ￣１ａｎｄＣ/ＥＢＰβａｒｅｍａｊｏｒｐ３８αＭＡＰＫ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｉｎ０６７江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第３期ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ[Ｊ].ＴｈｅＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌꎬ２００６ꎬ３９６(１):１６３￣１７２.[２９]ＷＥＮＴꎬＬＩＵＪＨꎬＨＥＸＱꎬｅｔａｌ.ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＴＥＡＤ１ｉｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒｖａｓｃｕｌａｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｂｙｐｒｏｍｏｔｉｎｇｖａｓｃｕｌａｒｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ[Ｊ].ＣｅｌｌＤｅａｔｈ＆Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎꎬ２０１９ꎬ２６(１２):２７９０￣２８０６.[３０]ＨＵＲＡＳＫＩＮＤꎬＥＩＢＥＲＮꎬＲＥＩＣＨＥＬＭꎬｅｔａｌ.Ｗｎｔ/β￣ｃａｔｅｎｉｎｓｉｇｎａｌｉｎｇｖｉａＡｘｉｎ２ｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄꎬｔｏｇｅｔｈｅｒｗｉｔｈＹＡＰ/ＴａｚａｎｄＴｅａｄ１ꎬａｃｔｉｖｅｉｎＩＩａ/ＩＩｘｍｕｓｃｌｅｆｉｂｅｒｓ[Ｊ].Ｄｅｖｅｌｏｐ￣ｍｅｎｔꎬ２０１６ꎬ１４３(１７):３１２８￣３１４２.[３１]ＮＩＮＧＬꎬＮＥＬＳＯＮＢＲꎬＢＥＺＰＲＯＺＶＡＮＮＡＹＡＳꎬｅｔａｌ.Ｒｅｑｕｉｒｅ￣ｍｅｎｔｏｆＭＥＦ２ＡꎬＣꎬａｎｄＤｆｏｒｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ[Ｊ].ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａꎬ２０１４ꎬ１１１(１１):４１０９￣４１１４.[３２]ＳＣＨＩＡＦＦＩＮＯＳꎬＤＹＡＲＫＡꎬＣＡＬＡＢＲＩＡＥ.ＳｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｍａｓｓｉｓｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｂｙｔｈｅＭＲＦ４￣ＭＥＦ２ａｘｉｓ[Ｊ].ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＣｌｉｎｉｃａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎａｎｄＭｅｔａｂｏｌｉｃＣａｒｅꎬ２０１８ꎬ２１(３):１６４￣１６７. [３３]ＴＡＹＬＯＲＭＶꎬＨＵＧＨＥＳＳＭ.Ｍｅｆ２ａｎｄｔｈｅｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｄｉｆ￣ｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｐｒｏｇｒａｍ[Ｊ].ＳｅｍｉｎａｒｓｉｎＣｅｌｌ＆ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏ￣ｇｙꎬ２０１７ꎬ７２:３３￣４４.[３４]ＶＡＬＬＥＪＯＡꎬＰＥＲＵＲＥＮＡＮꎬＧＵＲＵＣＥＡＧＡＥꎬｅｔａｌ.Ａｎｉｎｔｅ￣ｇｒａｔｉｖｅａｐｐｒｏａｃｈｕｎｖｅｉｌｓＦＯＳＬ１ａｓａｎｏｎｃｏｇｅｎｅｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｙｉｎＫＲＡＳ￣ｄｒｉｖｅｎｌｕｎｇａｎｄｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｎｃｅｒ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＣｏｍｍｕｎｉｃａ￣ｔｉｏｎｓꎬ２０１７ꎬ８.ＤＯＩ:１０.１０３８/ｎｃｏｍｍｓ１４２９４.[３５]ＺＡＭＭＩＴＰＳ.ＦｕｎｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍｙｏｇｅｎｉｃｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｆａｃｔｏｒｓＭｙｆ５ꎬＭｙｏＤꎬＭｙｏｇｅｎｉｎａｎｄＭＲＦ４ｉｎｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅꎬｓａｔｅｌｌｉｔｅｃｅｌｌｓａｎｄｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓ[Ｊ].ＳｅｍｉｎａｒｓｉｎＣｅｌｌ＆ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０１７ꎬ７２:１９￣３２.[３６]ＣＯＬＥＳＣＡꎬＷＡＤＥＳＯＮＪꎬＬＥＹＴＯＮＣＰꎬｅｔａｌ.Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｒａｔｅｓｏｆｂｏｖｉｎｅｐｒｉｍａｒｙｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓｒｅｌａｔｅｔｏｌｉｖｅｗｅｉｇｈｔａｎｄｃａｒｃａｓｅｗｅｉｇｈｔｉｎｃａｔｔｌｅ[Ｊ].ＰＬｏＳＯｎｅꎬ２０１５ꎬ１０(４).ＤＯＩ:１０.１３７１/ｊｏｕｒ￣ｎａｌ.ｐｏｎｅ.０１２４４６８.[３７]ＢＵＣＫＩＮＧＨＡＭＭꎬＲＩＧＢＹＰＷ.Ｇｅｎｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｎｅｔｗｏｒｋｓａｎｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｔｈａｔｃｏｎｔｒｏｌｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓ[Ｊ].Ｄｅｖｅｌｏｐ￣ｍｅｎｔａｌＣｅｌｌꎬ２０１４ꎬ２８(３):２２５￣２３８.[３８]ＸＵＤＱꎬＷＡＮＧＬꎬＪＩＡＮＧＺＺꎬｅｔａｌ.ＡｎｅｗｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉｃｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｃａｔａｌｐｏｌｒｅｖｅａｌｅｄｂｙｅｎｈａｎｃｉｎｇＭｙｏＤ/ＭｙｏＧ￣ｍｅｄｉａ￣ｔｅｄｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓ[Ｊ].ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓꎬ２０１８ꎬ２０９:３１３￣３２３. [３９]ＢＯＤＩＮＥＳＣꎬＬＡＴＲＥＳＥꎬＢＡＵＭＨＵＥＴＥＲＳꎬｅｔａｌ.Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａ￣ｔｉｏｎｏｆｕｂｉｑｕｉｔｉｎｌｉｇａｓｅｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅａｔｒｏｐｈｙ[Ｊ].Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ２００１ꎬ２９４(５５４７):１７０４￣１７０８.(责任编辑:陈海霞)１６７张久盘等:牛ＬＡＴＳ２基因启动子克隆及转录调控分析。
启动子分析-----------转录因子结合位点
启动子分析-----------转录因子结合位点启动子分析-----------转录因子结合位点启动子是DNA分子可以与RNA聚合酶特异结合的部位，也就是使转录开始的部位。
在基因表达的调控中，转录的起始是个关键。
常常某个基因是否应当表达决定于在特定的启动子起始过程。
启动子一般可分为两类:(1)一类是RNA聚合酶可以直接识别的启动子。
这类启动子应当总是能被转录。
但实际上也不都如此，外来蛋白质可对其有影响，即该蛋白质可直接阻断启动子，也可间接作用于邻近的DNA结构，使聚合酶不能和启动子结合。
(2)另一类启动子在和聚合酶结和时需要有蛋白质辅助因子的存在。
这种蛋白质因子能够识别与该启动子顺序相邻或甚至重叠的DNA顺序。
因此，RNA聚合酶能否与启动子相互作用是起始转录的关键问题，似乎是蛋白质分子如何能识别DNA链上特异序列。
例如，RNA聚合酶分子上是否有一个活性中心能够识别出DNA双螺旋上某特异序列的化学结构?不同启动子对RNA聚合酶的亲和力各不同。
这就可能对调控转录起始的频率，亦即对基因表达的程度有重要不同。
DNA链上从启动子直到终止子为止的长度称为一个转录单位。
一个转录单位可以包括一个基因，也可以包括几个基因。
启动子预测软件大体分为三类，第一类是启发式的方法，它利用模型描述几种转录因子结合部位定向及其侧翼结构特点，它具有挺高的特异性，但未提供通用的启动子预测方法；第二类是根据启动子与转录因子结合的特性，从转录因子结合部位的密度推测出启动子区域，这方法存在较高的假阳性；另一类是根据启动子区自身的特征来进行测定，这种方法的准确性比较高。
同时，还可以结合是否存在CpG岛，而对启动子预测的准确性做出辅助性的推测。
启动子预测软件有：PromoterScan ; Promoter 2.0 ;NNPP ;EMBOSS Cpgplot ; CpG Prediction启动子及转录因子结合位点数据库及预测工具冷泉港启动子分析程序介绍/links/ch_09_t_6.html在线预测和分析基因启动子（promoter）一般在公共数据库中，如NCBI、UCSC、Ensembl给出的人类基因序列都没有对基因进行详细的标注。
生物信息学中的基因调控网络分析与预测
生物信息学中的基因调控网络分析与预测第一章引言生物信息学是通过运用计算科学的方法研究生物学问题的一门学科。
在这个快速发展的领域中，基因调控网络分析与预测是一项重要且具有挑战性的任务。
基因调控网络代表了基因之间的相互作用和调控关系，它们对于理解生物体内基因调控的机制具有重要意义。
本文将介绍基因调控网络分析的相关概念和方法，并探讨如何通过这些方法预测基因调控网络。
第二章基因调控网络的构建2.1 基因-转录因子关系的识别在构建基因调控网络之前，首先需要识别基因与转录因子之间的相互作用关系。
这可以通过实验方法或计算方法来实现。
常见的实验方法包括染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）和染色质构象法（3C）。
计算方法主要基于基因和转录因子的表达谱数据，通过寻找相关性来建立关联模型。
2.2 基因调控元件的预测基因调控元件是指参与基因调控的DNA序列区域，包括启动子、增强子等。
通过预测基因调控元件的位置和功能，可以帮助我们理解基因调控的机制。
常用的方法包括转录因子结合位点的预测和甲基化位点的预测。
第三章基因调控网络的分析3.1 网络拓扑结构的分析基因调控网络可以看作是一个复杂系统，在分析时可以运用网络科学的方法。
通过研究网络的拓扑结构（如节点度、介数中心性等），我们可以揭示网络的基本特性，如小世界性、无标度性等。
3.2 基因调控网络的模块化基因调控网络通常是由多个互联的模块组成的。
模块是一组相互作用紧密的基因或转录因子，它们在功能上具有一定的相似性。
通过识别和分析模块，我们可以更好地理解基因调控的功能和机制。
第四章基因调控网络的预测4.1 基因调控网络重建基因调控网络的重建是利用已有的实验数据和计算方法，通过建立数学模型来模拟和预测基因之间的调控关系。
常用的方法包括基于表达谱数据的拓扑重建和基因调控元件的预测。
4.2 基因调控网络模型的优化构建基因调控网络模型需要经过多次迭代和优化，以提高模型的准确性和预测性能。
启动子互作蛋白技术路线
启动子互作蛋白技术路线
启动子互作蛋白技术路线是一种用于研究启动子与互作蛋白之间相互作用的技术方法。
在这种技术路线中，研究人员通常会利用启动子结合互作蛋白的方式来探究启动子的功能及其调控机制。
下面我们将介绍启动子互作蛋白技术路线的相关内容。
首先，启动子是一种位于基因上游的DNA序列，能够调控基因的转录活性。
启动子通常与一些互作蛋白结合，从而影响基因的表达。
互作蛋白是一类在细胞内发挥重要功能的蛋白质，它们能够与启动子结合，调控基因的转录活性。
启动子互作蛋白技术路线的关键步骤包括：首先，研究人员需要确定目标启动子及其潜在的互作蛋白。
其次，利用生物信息学工具对启动子和互作蛋白的结合位点进行预测。
接着，进行实验验证，通常包括染色质免疫沉淀、质谱分析、酶联免疫吸附实验等方法来确认启动子与互作蛋白的相互作用。
最后，研究人员可以进一步探究启动子与互作蛋白之间的功能关系，以及它们在基因调控中的作用机制。
通过启动子互作蛋白技术路线，研究人员可以深入了解启动子与互作蛋白之间的相互作用，揭示基因调控的分子机制。
这种技术路线有助于解析基因的表达调控网络，为疾病发病机制的研究提供重要的线索。
同时，启动子互作蛋白技术路线的应用还可以拓展到药物研发领域，帮助筛选靶向启动子的药物，从而实现个性化治疗的目标。
总的来说，启动子互作蛋白技术路线是一种重要的研究方法，能够深入探究启动子与互作蛋白的互动机制，为基因调控研究和药物研发提供重要的支持。
通过不断优化这一技术路线，我们有望揭示更多基因的调控机制，为疾病的治疗和预防提供更多的科学依据。
基因调控网路的建立及其分析方法
基因调控网路的建立及其分析方法基因调控网络的建立及其分析方法随着科技进步，生物学领域的研究也越来越深入。
基因调控网络就是近年来生物学研究的热点之一。
基因调控网络是指基因之间互相作用，通过调控基因的表达来完成生物机体的生长、发育和代谢等生理功能的一种复杂的网络结构。
在基因调控网络中，基因的表达受到多种因素的调节，如DNA甲基化、组蛋白修饰、转录因子结合等，因此，建立基因调控网络的同时，也需要研究这些因素对基因调控的影响，以便更好地理解生物体内复杂的调控机制。
基因调控网络的建立主要包含以下几个步骤：1. 基因表达数据的获取基因表达数据是建立基因调控网络的基础。
现代技术的高速发展，许多基因表达数据集已经公开可用。
例如，NCBI的Gene Expression Omnibus数据库提供了全球范围内的基因表达数据，研究人员可以免费下载并使用这些数据集。
2. 基因共表达分析基因共表达分析是一种将不同的基因按照其表达相似性划分成不同的表达模式的方法。
对于共表达模块内的基因，它们的表达模式高度相关，意味着它们在生物体内具有相似的功能或复杂的互作关系。
因此，基于共表达的方法是建立基因调控网络的有效工具。
3. 转录因子预测转录因子是一种重要的基因调控分子，它通过与特定的DNA序列结合来调节目标基因的表达。
因此，预测与基因共表达模块相关的转录因子是建立基因调控网络的关键步骤。
目前，有许多软件可以用于预测转录因子，例如Pscan和FANTOM。
4. 基因调控关系的预测在充分了解基因共表达模块和与之相关的转录因子后，我们可以对基因调控网络中的基因之间的调控关系进行预测。
这些预测可以通过特定的算法实现，例如Bayesian网络、逻辑回归和支持向量机等。
5. 网络拓扑结构的分析网络拓扑结构是指基因调控网络的分子结构，包括节点数量、连接方式和网络密度等。
基于拓扑结构的分析方法可以帮助我们了解基因调控网络中基因调控关系的性质和特点。
生物信息学分析基因调控网络
生物信息学分析基因调控网络生物信息学是应用数学，计算机科学和生物学相结合的科学。
它旨在研究生物信息的存储、获取、分析和理解。
生物信息学已经成为生物研究中不可或缺的一部分。
最近，生物信息学在研究基因调控网络方面取得了显著进展。
基因调控是指细胞控制基因表达的过程。
基因调控网络形成了许多基因之间的复杂关系，其中每个基因都可以同时调节和被调节。
这些关系可以形成网络，通常称为基因调控网络。
基因调控网络是研究基因调控的主要工具。
基因调控网络由许多元件构成。
其中最基本的元件是基因。
基因的表达由转录因子和染色质状态等调控。
转录因子是一类蛋白质，可以结合到基因的启动子区域上。
染色质状态指染色质上的化学修饰，如乙酰化和甲基化。
为了理解基因调控网络的复杂性，需要大量的实验。
这些实验包括基因敲除、基因表达谱分析和转录因子结合位点鉴定等。
这些实验产生的数据量是巨大的，不能仅凭直觉分析。
因此，需要生物信息学的工具来分析和解释这些数据。
生物信息学的方法在基因调控网络中应用非常广泛。
例如，生物信息学可以用来寻找转录因子结合位点。
转录因子结合位点是一种位于基因启动子上的序列，可以与转录因子结合并调控基因表达。
通过生物信息学的方法，可以在基因组中鉴定转录因子结合位点。
生物信息学还可以用来研究转录因子的功能。
例如，可以对转录因子家族进行分析，以确定相似性和功能关系。
在某些情况下，可以构建转录因子家族的进化树以推断转录因子的进化历史。
此外，生物信息学还可以用来预测基因调控路径。
基因调控路径是指基因调控网络中一个基因到另一个基因的序列。
这些路径代表了基因调控网络中的信息流。
通过生物信息学的方法，可以预测基因调控路径，以帮助理解基因调控网络中的信息流。
最近，深度学习技术已经被应用于基因调控网络的分析。
深度学习是一种人工智能的技术，它使用神经网络来模拟人类的大脑。
通过深度学习的方法，可以自动地从基因表达谱数据中学习基因调控网络的结构。
在基因调控网络的研究中，生物信息学的作用不容忽视。
基因启动子分析基本流程
http://www.helixnet.cn “螺旋讲堂”2008年第十一课----“基因启动子分析基本流程” 螺旋 亲爱的螺友们，大家好！欢迎光临螺旋讲堂，很高兴有机会和大家相聚螺旋网，让我们一同在讨论中学习，在交流中成长！
分子生物学发展迅猛，新方法新技术新发现层出不穷，但是我想,我们的基础研究从某种意义上来说，可以简单的分为两大部分，一个是基因的表达，另一个是基因的功能。当然，这个基因的概念现在已经不仅仅是指编码蛋白的DNA序列了。
我们这期主要探讨基因的表达。而转录调控在基因表达中占有很重要的地位。基因的转录调控机制非常复杂，这些理论有机会我们再详细探讨，这里就不多介绍了，我们主要谈一下对于一个新的基因，如何开始他的转录调控研究，第一步到底该怎么做呢？
这里提供一些简单的入门级别的方法，希望对大家有用。相信还有更多更好更实用的方法，也希望螺友们能够拿出来和大家分享，共同进步！
本次讲座共分为五个部分主要是讲第一部分,因为这个一般的文献和书籍都很少有详细说明.
一：克隆目的基因基本启动子序列 我们都知道，基因的基本启动子一般是在基因转录起始位点上游，当一个基因在没有确定其转录起始位点的时候，我们假定NCBI上提交的序列就是他的完整转录本，那么他的第一个碱基就是他的转录起始位点。而基因的基本启动子一般就是在转录起始位点的上游2000bp左右和下游200bp左右，当然,这个是一般情况,具体问题还要具体分析.尤其现在发现一般的基因都是有几个转录起始位点的.
我们通过该基因mRNA序列和基因组序列BLAST，就能够在染色体上找到这段基因组序列。我这里用human的AGGF1基因做个例子给大家具体演示一下. “螺旋讲堂”2008年第十一课----“基因启动子分析基本流程” 1 首先需要在NCBI里面查找到AGGF1基因的mRNA序列,这个我想大家都应该很清楚,如下图.
http://www.helixnet.cn “螺旋讲堂”2008年第十一课----“基因启动子分析基本流程” 2 然后就是用这段mRNA序列和人类的基因组序列BLAST
基因调控元件的识别和功能分析
基因调控元件的识别和功能分析基因调控是指通过转录因子与调控元件的相互作用，调节基因的表达水平和时空特异性。
基因调控元件是指在基因组中起调控作用的DNA区域，包括启动子、增强子和抑制子等。
识别和功能分析基因调控元件对于理解基因调控网络的功能和调控模式具有重要意义。
本文将介绍基因调控元件的识别方法和功能分析技术。
一、基因调控元件的识别方法基因调控元件的识别方法主要分为实验方法和计算方法两类。
实验方法：1. 电泳移动位移（EMSA）：基于DNA和转录因子之间的特异性结合反应，可以通过凝胶电泳观察转录因子与调控元件的结合情况。
2. DNA足迹分析：通过转录因子与DNA结合形成保护区域，保护区域不受核酸酶降解，在电泳中形成“足迹”，可以确定转录因子与调控元件的结合位点。
3. 染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）：通过将转录因子与DNA交联并沉淀，然后通过测序技术鉴定转录因子结合的DNA序列。
计算方法：1. 启动子预测：通过基于转录因子结合位点和启动子序列的计算模型，预测可能的启动子区域。
2. DNA序列比对：通过比对不同物种或同一物种不同基因间的DNA序列，鉴定高度保守的区域，可能为调控元件。
3. 机器学习算法：利用大规模的实验数据和DNA序列特征，构建机器学习模型进行调控元件的预测和分类。
二、基因调控元件的功能分析基因调控元件的功能分析可以通过转录后修饰、突变和瞬时表达实验等方法进行。
1. 转录后修饰：通过测定某个调控元件的转录后修饰状态，如甲基化、乙酰化等，来评价其功能。
2. CRISPR/Cas9基因组编辑：利用CRISPR/Cas9技术对调控元件进行定点突变，观察突变对基因表达的影响，推断其功能。
3. 瞬时表达实验：构建含有调控元件启动子和荧光报告基因的重组质粒，转染细胞进行瞬时表达实验，观察报告基因的表达水平，以评价调控元件的功能。
以上是基因调控元件识别和功能分析的主要方法。
随着高通量测序技术和人工智能技术的不断发展，基因调控元件的识别和功能分析也在不断深入和完善。
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真核细胞基因表达受到转录因子的精确调控，转录因子的结合位点预测是生物信息学中的研究热点。
转录因子结合位点的预测方法主要有：基于一致性序列的方法，基于位置权重矩阵的方法，利用物种之间保守性的遗传印记方法以及利用基因芯片的方法，当然也可以是多种方法的综合应用。
现有方法的基础都是利用已知的转录因子结合位点来预测未知的，都受已知转录因子结合位点的数量和质量的限制。
由于目前对真核生物顺式调控模块积累的实验数据还太少，相应的数据库资源也不多。
因此大规模地从文献中搜集挖掘转录因子结合位点，构建顺式调控模块相关的数据库，对实验和计算都有重要的意义。