BD2增强巨细胞病毒DNA疫苗的免疫效果研究
DNA疫苗免疫佐剂的研究进展
DNA疫苗免疫佐剂的研究进展摘要: DNA疫苗是一种很有希望的免疫方法，经多途径接种质粒DNA能引起有效的免疫应答，重复给予不会产生抗载体免疫。
然而，质粒DNA疫苗在小型实验动物中诱导的免疫应答远强于在人类和其他非人灵长类动物中。
已设计多种佐剂通过直接刺激免疫系统或增强DNA表达来提高疫苗的免疫原性，这些佐剂包括细胞因子、免疫协同刺激分子、补体分子、脂质体、核酸、聚合物佐剂等。
此文对DNA疫苗佐剂的研究进展作一综述。
关键词:疫苗；DNA；佐剂；免疫；细胞因子；聚合物20世纪90年代以来，DNA疫苗的快速发展给疫苗研究带来了新的变革，已逐步显示出巨大的应用潜力。
然而，DNA疫苗也存在着明显的不足，即DNA疫苗刺激机体产生免疫应答的能力往往比常规疫苗接种引起的免疫反应弱，这就给DNA疫苗的研究提出了新的挑战。
因此，新型疫苗佐剂已成为当今倍受关注的研究热点。
免疫佐剂是指与抗原同时或预先应用，能促进、延长或增强对疫苗抗原特异性免疫应答的物质。
DNA疫苗又称基因疫苗或核酸疫苗，是将编码某种抗原蛋白的基因置于真核表达元件的控制之下，构成重组DNA质粒，当将重组DNA质粒直接导入受者体内后，宿主细胞通过自身转录翻译系统合成抗原蛋白，进而刺激机体产生特异性体液和细胞免疫应答。
DNA疫苗常见的接种途径为肌肉注射，在小动物模型中质粒DNA经静脉、腹腔、舌下、阴道和鼻内接种均能诱导抗原特异性免疫应答；口服能耐受降解的质粒DNA也可引起免疫应答；DNA 疫苗经淋巴组织内接种显示安全，且诱导的免疫应答明显强于肌肉注射。
基因枪可增强质粒DNA导人皮肤，已应用于AIDS、麻疹等多种疫苗接种系统。
与肌肉注射相比，基因枪接种诱导的免疫应答有所提高。
DNA疫苗在小型实验动物中可诱导有效的细胞免疫应答，但在人体临床试验中效却不明显[1]。
DNA疫苗的免疫原性受到接种途径的限制，因吸收差、表达效率低和降解快，质粒DNA只能诱导有限的体液和细胞免疫反应[2]。
DNA疫苗在动物医学上的研究进展
得 了一定 的进展 。 １ 应用于家禽的 Ｄ Ａ疫苗 Ｎ
２１ 伪狂犬病病毒（ Ｒ ． Ｐ Ｖ） Ｇ ｒｔ等的研究表 明， ｅ ｓ ｄ
检测到抗体 ｅｄ 等又对 ＰＶ糖蛋白基因的Ｄ Ａ Ｇ ｒｔ ｓ ｒ Ｎ 疫 苗与常规灭活疫 苗和减 毒疫苗 的免疫效果进行 了广泛的比较 ， 发现 Ｄ Ａ疫苗 比灭活疫苗效果好 ， Ｎ 但比弱毒苗效果差 ２ 猪呼吸 与繁 殖障碍综合 征 （ Ｒ Ｓ Ｍｅｇ ． ２ ＰＲ ） ｎ 等 （９５ 将 Ｐ Ｒ Ｖ的主要囊膜蛋白 Ｇ ５ １９ ） ＲＳ Ｐ 基因克 隆入 巨细胞病毒 （ ＭＶ） 在早期启动子的控制之 Ｃ ， 下构建成真核表达质粒而制备 出 Ｄ Ａ疫苗 ，用其 Ｎ 免疫仔猪可诱导产生抗体 ， 攻毒后显示 出良好的保
用含有 Ｐ Ｖ Ｃ或 ｇ 基因的质粒 Ｄ Ａ 免疫接种 Ｒ ｇ Ｄ Ｎ
１ 新城疫病毒 （ Ｄ Ｓｋｇｃｉ （９ ６ 猪 ， ． １ Ｎ Ｖ） ａａｕｈ 等 １９ ） 能诱导抗体的产生 ， 并在免疫后 ９ 个月， 还能
用鸡做模型 ， 试验 了编码新城疫病毒 Ｆ 基因的质粒 Ｄ Ａ疫苗的免疫 ，结果证明 ，免疫 ９周后体内有 Ｎ 抗体的试验鸡都能抵抗致死剂量 Ｎ Ｖ 强毒的攻 Ｄ 击。 姜永厚等 （０ １ 成功构建了表达鸡新城疫病 ２０ ） 毒 Ｆ基因和鸡 Ｉ－ Ｌ２的重组质粒 。 １ 禽流感病毒 （ Ｉ Ｏ ｌ ． ２ Ａ Ｖ） ｈ ｅ等 （９３ ｌ １９ ）用流 感病毒的核心抗原 （ Ｐ 基因制成 Ｄ Ａ疫苗 ， Ｎ ） Ｎ 并 在 小 鼠 中取得 了较好 的保 护效果 。Ｒ ｂ ｓｎ等 ｏｉ ｏ ｎ （９ ３ １９ ）以禽流感病毒 Ｈ Ｎ ７ ７株血凝素 （ Ａ）基 Ｈ 因的质粒 Ｄ Ａ由不同免疫途径接种鸡 ，免疫鸡可 Ｎ 对致死剂量的 Ｈ Ｎ 株病毒产生 ５％的保护率 。 Ｔ７ ０ 陈 化兰等 （９８ 报道 ， ７ １９ ） Ｈ 亚型血凝素基因 Ｄ Ａ疫 Ｎ
巨细胞病毒性肺炎儿童体内淋巴细胞亚群的变化特点探讨
巨细胞病毒性肺炎儿童体内淋巴细胞亚群的变化特点探讨巨细胞病毒性肺炎（CMV肺炎）是一种由巨细胞病毒引起的肺部感染。
此病常见于移植者和免疫缺陷患者，但在儿童中也有发病率。
研究表明，CMV肺炎的发病与淋巴细胞亚群变化密切相关。
本文旨在探讨儿童体内淋巴细胞亚群变化的特点。
一、CD4+T细胞减少CD4+T细胞是免疫系统中的重要成分，负责调节T、B细胞的免疫应答。
在CMV肺炎儿童中，CD4+T细胞数量显著减少，且此减少不恢复，可能成为疾病的持续风险因素。
其原因是CMV病毒特异性CD4+T细胞活化，并失去对其他微生物的响应能力，间接导致免疫调节功能的丧失。
二、CD8+T细胞增加CD8+T细胞是体内保护机构中的关键成分，主要功能是直接清除感染的细胞。
在CMV肺炎儿童中，CD8+T细胞数量明显增加。
而且，由于CMV病毒存活于体内，此状态可能成为长期维持CD8+T细胞增加的重要原因。
三、自然杀伤细胞活化自然杀伤细胞（NK细胞）是免疫系统中的另一重要组成部分，主要靶向感染和肿瘤细胞，并通过杀伤和分泌细胞因子来发挥免疫作用。
研究表明，CMV病毒感染会导致NK细胞活化和增加。
在CMV肺炎儿童中，体内的NK细胞明显活化，其活性与病情的严重程度呈正相关。
四、CD4+/CD8+比例减小CD4+/CD8+比例是衡量免疫系统平衡与否的重要指标。
在健康人群中，此比例保持在1∶2左右。
而在CMV肺炎儿童中，由于CD4+T细胞的减少和CD8+T细胞的增加，CD4+/CD8+比例明显减小。
此现象可能影响T细胞的效应，导致疾病持续或复发。
五、B细胞功能变化B细胞是体内抗体的主要来源，对身体的防御起到关键作用。
在CMV肺炎儿童中，B细胞显著减少，其功能也发生变化，主要表现为抗体产量减少和类别限制。
这将导致免疫反应的限制和不充分，易使病情进一步加重。
总之，CMV肺炎儿童体内淋巴细胞亚群的变化特点主要表现为CD4+T细胞减少、CD8+T细胞增加、NK细胞活化、CD4+/CD8+比例减小和B细胞功能变化。
《2024年Bdh2基因敲除的小鼠胚胎干细胞的生物特性研究》范文
《Bdh2基因敲除的小鼠胚胎干细胞的生物特性研究》篇一一、引言近年来，随着基因编辑技术的发展，基因敲除技术已成为研究基因功能的重要手段。
Bdh2基因作为一种重要的代谢酶基因，其敲除对小鼠胚胎干细胞（ESC）的生物特性产生何种影响，成为了当前研究的热点。
本文以Bdh2基因敲除的小鼠胚胎干细胞为研究对象，深入探讨其生物特性的变化。
二、材料与方法1. 材料本实验所需的小鼠胚胎干细胞来源于Bdh2基因敲除的小鼠模型。
此外，还需要相关试剂、仪器等。
2. 方法（1）细胞培养：使用特定培养基培养小鼠胚胎干细胞，维持其正常生长与增殖。
（2）基因敲除：利用CRISPR-Cas9系统进行Bdh2基因敲除，建立Bdh2基因敲除的ESC细胞模型。
（3）生物特性检测：通过多种实验手段，如细胞增殖实验、细胞周期分析、基因表达分析等，检测Bdh2基因敲除后小鼠胚胎干细胞的生物特性变化。
三、实验结果1. 细胞增殖实验Bdh2基因敲除后，小鼠胚胎干细胞的增殖能力显著提高，与野生型细胞相比，其生长速度更快。
2. 细胞周期分析通过细胞周期分析发现，Bdh2基因敲除的ESC细胞在G1期停留时间较短，S期和G2期停留时间较长，表明其细胞周期发生改变。
3. 基因表达分析对Bdh2基因敲除后的小鼠胚胎干细胞进行基因表达分析，发现与代谢相关的基因表达发生明显变化，尤其是与脂肪酸代谢相关的基因表达上调。
4. 代谢特性变化Bdh2基因敲除的ESC细胞的代谢特性发生显著变化，如脂肪酸氧化能力增强，糖酵解速率降低等。
四、讨论根据实验结果，我们可以得出以下结论：Bdh2基因敲除的小鼠胚胎干细胞在生物特性上发生了显著变化。
首先，其增殖能力增强，这可能与Bdh2基因在细胞增殖过程中的调控作用有关。
其次，细胞周期发生改变，这可能是导致细胞增殖能力增强的原因之一。
此外，代谢特性也发生明显变化，如脂肪酸氧化能力增强，这可能与Bdh2基因在脂肪酸代谢中的调控作用有关。
巨细胞病毒感染症的科普知识
巨细胞病毒感染的症状是什么 ？
巨细胞病毒感染的症状是什么？
常见症状
大多数健康成年人感染CMV后可能没有明显 症状，但一些人可能会出现类似流感的症状 ，如发热、乏力、肌肉疼痛等。
在免疫系统较弱的患者中，CMV可能导致严 重的肺炎、肝炎或视网膜炎等。
巨细胞病毒感染的症状是什么？ 新生儿感染
器官移植患者需遵循医生的预防方案。
如何诊断巨细胞病毒感染？
如何诊断巨细胞病毒感染？
诊断测试
CMV感染可以通过血液检测、尿液检测或组 织活检等方式进行诊断。
PCR（聚合酶链反应）测试是检测CMV DNA的 常用方法。
如何诊断巨细胞病毒感染？ 临床评估
医生会根据患者的症状、病史和实验室检查 结果综合评估。
治疗需根据患者的具体情况制定个体化方案。
巨细胞病毒感染的治疗方法有哪些？ 免疫支持
提高免疫力的措施，如合理饮食、适度锻炼、充 足睡眠等，可以帮助患者更好地抵御病毒。
免疫抑制患者需特别注意免疫支持。
巨细胞病毒感染的治疗方法有哪些？ 随访与评估
治疗后需定期随访，观察症状改善及病毒载量变 化。
医务人员会根据随访结果调整治疗方案。
新生儿感染CMV可能导致听力丧失、智力障 碍和其他发育问题。
定期听力筛查对早期发现至关重要。
巨细胞病毒感染的症状是什么？ 并发症
在免疫抑制患者中，CMV感染可能引发多脏 器损伤，包括肺部、肝脏及消化道等。
及早诊断和治疗可以降低并发症的风险。
如何预防巨细胞病毒感染？
如何预防巨细胞病毒感染？ 基本预防措施
CMV感染广泛存在，但多数健康人群不会出现明 显症状。
什么是巨细胞病毒感染症？
《2024年Bdh2基因敲除对小鼠胚胎干细胞向中胚层及原始红细胞分化过程的影响》范文
《Bdh2基因敲除对小鼠胚胎干细胞向中胚层及原始红细胞分化过程的影响》篇一一、引言在生物医学研究中，Bdh2基因作为一类重要的调控因子，在胚胎发育和细胞分化过程中起着关键作用。
本篇论文旨在探讨Bdh2基因敲除对小鼠胚胎干细胞向中胚层及原始红细胞分化过程的影响。
通过对Bdh2基因敲除小鼠胚胎干细胞的研究，我们可以更深入地理解该基因在细胞分化过程中的作用机制，并为疾病治疗和干细胞治疗提供理论依据。
二、材料与方法2.1 实验材料本实验选用Bdh2基因敲除小鼠胚胎干细胞作为研究对象，同时以野生型小鼠胚胎干细胞作为对照。
实验过程中需使用相关试剂、培养基等材料。
2.2 实验方法（1）细胞培养：在特定条件下培养Bdh2基因敲除小鼠胚胎干细胞和野生型小鼠胚胎干细胞。
（2）分化诱导：通过调整培养条件，诱导干细胞向中胚层及原始红细胞方向分化。
（3）基因表达检测：利用PCR、Western Blot等技术检测相关基因的表达情况。
（4）细胞形态观察：通过显微镜观察细胞形态变化，分析Bdh2基因敲除对细胞分化的影响。
三、实验结果3.1 细胞分化过程观察在诱导分化过程中，我们发现Bdh2基因敲除小鼠胚胎干细胞在向中胚层及原始红细胞分化的过程中出现了一定程度的异常。
具体表现为分化速度减慢，分化程度降低。
3.2 基因表达分析通过PCR和Western Blot等技术检测相关基因的表达情况，我们发现Bdh2基因敲除后，与中胚层及原始红细胞分化相关的基因表达水平发生了改变。
其中，部分基因表达上调，部分基因表达下调。
3.3 细胞形态观察通过显微镜观察细胞形态变化，我们发现Bdh2基因敲除后，小鼠胚胎干细胞的形态发生了改变，与正常细胞相比，其细胞大小、形态及排列等方面均存在差异。
这些变化可能与Bdh2基因敲除导致的细胞分化异常有关。
四、讨论本实验结果表明，Bdh2基因敲除对小鼠胚胎干细胞向中胚层及原始红细胞分化过程产生了影响。
这可能是由于Bdh2基因在细胞分化过程中扮演着重要的调控作用，其表达异常可能导致相关基因的表达水平发生改变，从而影响细胞的分化过程。
DMT佐剂增强DNA疫苗免疫原性和抗结核分枝杆菌感染保护效果研究.doc
DMT佐剂增强DNA疫苗免疫原性和抗结核分枝杆菌感染保护效果研究【背景目的】尽管卡介苗(BCG)广泛应用于结核病(tuberculosis,TB)的预防已有近100年的历史,但TB仍然是造成人类死亡的重大感染性疾病之一。
卡介苗可有效预防儿童的原发感染,但是其效应随着时间的推移逐渐减弱。
因此,迫切需要一种更有效的疫苗来预防TB。
DNA疫苗对TB有预防和治疗效应,具有热稳定性、易生产及易储存等优点。
但是其自身较弱的免疫原性阻碍了DNA疫苗的发展。
DMT是由二甲基双十八烷基铵(dimethyldioctadecylammonium,DDA)和两种模式识别受体激动剂单磷酰脂质A(Monophosphoryl lipid-A,MPLA)及人工合成的海藻糖6,6’—二分枝菌酸(Trehalose-6,6-dibehenate,TDB)组成的,一种可强力诱导免疫小鼠产生Th1型偏向免疫反应的脂质体佐剂。
为阐明DMT的作用机制,提高DNA疫苗的免疫效应,本研究拟构建一种新的可分泌表达融合蛋白CMFO(包括四种结核分枝杆菌抗原Rv2875,Rv3044,Rv2073c和Rv0577)的真核表达质粒pCMFO。
在细胞水平证实其分泌表达。
然后,分别制备pCMFO/DDA和pCMFO/DMT两种DNA-脂质体复合物,并对其理化性质进行分析。
在C57BL/6小鼠模型中观察和比较两种疫苗的免疫原性和抗感染保护效应。
【方法】1.pCMFO质粒的构建:将CMFO核酸序列插入p VAX1载体,构建pVAX1-CMFO(pCMFO)重组质粒。
在293T细胞中验证pCMFO质粒的分泌表达。
2.pCMFO/DDA和pCMFO/DMT的制备:薄膜法制备DDA和DMT佐剂,然后分别将DDA和DMT与pCMFO混合制备pCMFO/DDA和pCMFO/DMTDNA-脂质体复合物。
3.脂质体及DNA-脂质体复合物的表征:分别检测DDA、DMT、pCMFO/DDA和pCMFO/DMT的粒径、多分散性(PDI)和Zeta电位;透射电子显微镜(TEM)观察其表面形态。
研制具有较高免疫保护作用的DNA疫苗
静思笃行 持中秉正
3.1
3.研究SjserpinDNA疫苗作用机 制
Sjserpin在小鼠局部肌肉组织内的表达 每组各取2只小鼠在第一次免疫后10 d再以同剂量加强免疫一次，4d 后 剖杀小鼠，取两腿股四头肌做冰冻切片，Sjserpin的组化检测首 先在每张冰冻切片上加入日本血吸虫重感染兔血清．4℃过夜后加二 抗羊抗兔IgG-HRP，反应后经DAB显色，显微镜下观测结果。
静思笃行 持中秉正
经费预算 支出项目 试剂 动物 合计 金额（千元） 3 0.5 3.5 计算根据及理由 购买Taq酶，DNA T4聚合酶， 酶标抗体，试剂盒等 实验BALB/C小鼠和血吸虫 尾蚴
静思笃行 持中秉正
敬请老师和各位同学批评指正！
静思笃行 持中秉正
研制具有较高免疫保护作用的SjserpinDNA疫苗
静思笃行 持中秉正
立项依据
目前我国仍有108个县有血吸虫病流行，69.5万人感染血吸虫病，并且随着近年来 长江洪水泛滥和退耕还湖又有重新升高的趋势[1]。多年来，控制血吸虫病以化疗 为主．辅以易感地带灭螺的综合性防治措施，取得较好的效果。但由于在流行区化 疗停止后再感染迅速出现和长期、反复、大规模使用吡喹酮化疗，血吸虫对吡喹酮 的潜在耐药性，迫切需要发展血吸虫疫苗以补充血吸虫病的防治措施[2]。DNA疫 苗作为一种新型的疫苗，已在包括寄生虫感染在内的多个领域内开展了广泛研究 [3]．但是现行的酶抗原，血吸虫肌球蛋白组抗原，血吸虫膜相关蛋白，血吸虫钙 相关蛋白，血吸虫线粒体相关蛋白和信号蛋白，血吸虫性别相关蛋白等制作出的 DNA疫苗的免疫保护效果仅有小幅增加[4]。最新研究表明，来自哺乳动物内部的 消化酶：胰蛋白酶和胰弹性蛋白酶(PE)很容易被抑制[5],以纤溶酶原激活物抑制因 子2为代表了一种细胞抑制剂（serpin）可以通过一种独立的途径（不经过内质网 和高尔基体）分泌到细胞外[6]。据文献[7]报道多房棘球绦虫六钩蚴入侵人体阶段， 分泌的serpin，能够阻断宿主消化酶的酶解攻击，这样，Sjserpin就可以在免疫系 统做为一个靶位，引发免疫反应[8]。 因此，本实验将能够表达serpin的血吸虫的 一段cDNA进行PCR扩增，制作出SjserpinDNA疫苗，并对小鼠保护性免疫进行检 测，进而为人类血吸虫防治提供新思路。 静思笃行 持中秉正
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BD2增强巨细胞病毒DNA疫苗的免疫效果研究
摘要：表达巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）即刻早期蛋白（IE-1）的DNA疫苗能抵抗巨细胞病毒的感染。
β防御素2型（BD2）能激活未成熟的树突状细胞，调节机体免疫反应。
以小鼠为动物模型，探讨小鼠13D2（mBD2）增强鼠巨细胞病毒（murine cytomegalovirus，MCMV）IE-1 DNA疫苗的佐剂效果。
将表达IE-1的质粒（pIE-l）与表达mBD2的质粒（pBD2）混合免疫小鼠，2周后用致死量的同源MCMV攻击小鼠。
通过检测发现，混合免疫pIE-l和pBD2的小鼠与单独免疫IE-1相比，血清中IE -1特异性抗体含量升高，脾脏CD8+T 细胞所分泌的IFN-y水平上升，小鼠体重丢失明显下降，病毒攻击后小鼠存活率也有所提高。
这些结果表明，BD2可以作为一种分子佐剂增强IE-1 DNA疫苗的免疫效果。
关键词：巨细胞病毒；即刻早期蛋白；DNA疫苗；p防御素2型
巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）是一类双链DNA病毒，属于β疱疹病毒亚科。
CMV可致多种哺乳动物感染，引起中枢神经系统、泌尿生殖系统等损伤。
人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）在人群中普遍易感，但一般没有明显的临床症状，而在免疫低下的AIDS患者、免疫抑制的器官移植患者或婴幼儿中，HCMV可引起严重的临床症状甚至导致死亡[1，2]。
目前还没有HCMV疫苗在临床上使用，有效预防感染的HCMV疫苗是当前的研究热点。
已经进入临床2期试验的HCMV疫苗只有两种：联合新型MF59佐剂的包膜糖蛋白gB亚单位疫苗和pp65与gB DNA二价疫苗[3，4]。
巨细胞病毒即刻早期蛋白（IE-1）DNA疫苗作为研究对象之一，单独免疫机体时不能提供很好的保护。
因此，寻找一种合适有效的佐剂来增强其免疫效果很有必要。
防御素作为机体防御系统的成分，是一类富含精氨酸和半胱氨酸的小分子多肽。
防御素除了抗病原微生物和抗毒素作用外，还具有抗病毒作用，能在对抗单纯疱疹病毒、流感病毒、艾滋病病毒等包膜病毒感染中发挥作用[5，6]。
此外防御素还具有免疫调节作用，小鼠BD2 （mBD2）能通过TLR4受体来促进未成熟树突状细胞的成熟；人β防御素3型（hBD3）能通过TLR1和TLR2诱导CD80、CD86和CD40在髓样树突状细胞表面的表达[7]。
防御素除了与趋化因子受体及Toll样受体共同作用外，还能诱导表达大量的细胞因子和促炎因子如TNF-a、IFN-y、IL-2、IL-8和IL-18等，进而调节免疫应答[8，9]。
为探明BD2对IE-1 DNA疫苗免疫效价的影响，以小鼠为动物模型，将表达mBD2的质粒（pBD2）与表达IE-1的质粒（pIE-l）混合免疫BALB/c小鼠，通过检测小鼠的血清抗体、脾脏IFN-γ、存活率、体重丢失及器官病毒滴度来评价BD2对IE-1 DNA疫苗的佐剂效果。
1 材料与方法
1.1 病毒与小鼠
MCMV的Smith株由本实验室保存，小鼠体内扩增传代。
实验中所用小鼠为6～8周龄的SPF级BALB/c雌性小鼠（由湖南师范大学生命科学学院SPF级动物房饲养）。
1.2质粒构建
实验中所用的pIE-l DNA疫苗由本实验室人员构建，系将MCMV Smith株IE1基因插入pcDNA3.1真核表达载体中得到[10]。
小鼠β防御素2型（mBD2）基因由上海生物制品所提供（GenBank登录号为No. AJ011800）。
利用Primer 5.0进行引物设计，由上海生工生物公司合成。
其中正向引物mBD2-F：CGgaattcCTCT-CTGGAGTCTGAGTGCC，反向弓l物mBD2-R：GC-LctagaTTTATTGAAACATCAATTACACATC.mBD2的PCR反应体系为：高灭纯水16.8 μL，Pfu Buffer2.5 μL，dNTP 2.5 μL，cDNA模板1 μL，mBD2sense primer 1 μL，mBD2 anti-sense primer lμ1，Pfu酶0.2 μL。
PCR反应条件：变性94 °C 30 s，退火55 度C 30 s，延伸72 度C 45 s，30个循环。
PCR产物回收后，插入pCDNA3.1真核表达载体，构建pcDNA3.1-mBD2的重组质粒（以下简称pBD2）。
1.3免疫与攻毒
实验共分为4个组，其中3组分别免疫50μg pIE-l、10μg pBD2和50 μg pIE-l +10 μgpBD2，剩下一组不免疫作为阴性对照。
免疫的方法均为肌肉注射辅以电穿孔法l¨I。
免疫两周后，用致死量（3xLDso）MCMV腹腔感染小鼠。
攻毒后的21 d内观察小鼠体征变化，并记录每组小鼠体重丢失情况和死亡情况。
1.4 IE-1特异性抗体检测
免疫两周后，剪尾取血收集血清样本，ELISA法检测IE1特异性抗体含量。
96孔板中反应物依次加入：1）含IE1蛋白的包被液；2）连续2倍稀释的血清；3）生物素标记的羊抗鼠IgG抗体；4）碱性磷酸酶标记的链菌蛋白；5）pNPP 显色液；6）酶标仪中测出波长为405～450 nm处的吸光值。
以对照组血清吸光值的x+2s作为实验组血清抗体阳性的临界值。
1.5脾脏细胞分泌IFN-y检测
免疫10 d后，无菌操作摘取小鼠脾脏，分离脾脏淋巴细胞用于检测IFN-γ的量。
使用深圳市达科为生物技术有限公司的Mouse IFN-y Pre-coated ELISPOT kit并按使用说明操作如下：1）96孔ELISPOT包被板的活化；2）每孔按2xl05加入细胞悬液；3）每孔加入4μg的MCMV IE-1抗原的CD8T细胞表位肽168-YPHFMPTNL-176（H2d限制型，由上海生工生物技术公司合成）；4）37 0C，5% C02培养箱孵育20 h；5）冰冷的去离子水裂解细胞；6）加人生物素标记的二抗孵育；7）加入酶联亲和素孵育；8）AEC显色液显色；9）终止显色；10）ELISPOT斑点计数。
读板所得斑点数用于分析脾脏细胞分泌IFN-y的情况，以
此评价小鼠体内细胞免疫水平。