CAT过氧化氢酶活性测定方法
过氧化氢酶(CAT)活性检测试剂盒说明书 紫外分光光度法
过氧化氢酶(CAT)活性检测试剂盒说明书紫外分光光度法注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
货号:BC0200规格:50T/48S 产品内容：提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存；试剂一：液体60mL×1瓶，4℃保存；试剂二：液体100μL×3瓶，4℃保存。
产品说明：CAT(EC 1.11.1.6)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是最主要的H 2O 2清除酶，在活性氧清除系统中具有重要作用。
H 2O 2在240nm 下有特征吸收峰，CAT 能够分解H 2O 2，使反应溶液240nm 下的吸光度随反应时间而下降，根据吸光度的变化率可计算出CAT 活性。
试验中所需的仪器和试剂：紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水操作步骤：一、粗酶液提取：1、细菌、细胞或组织样品的制备细菌或培养细胞：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500-1000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（功率20%或200w，超声3秒，间隔10秒。
重复30次）；8000g 4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1：5-10的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液），进行冰浴匀浆。
8000g 4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。
二、CAT 测定操作1、分光光度计预热30min 以上，调节波长至240nm 处，蒸馏水调零。
2、CAT 检测工作液的配置：用时在每瓶试剂二（100μL）中加入20ml 试剂一，充分混匀，作为工作液；用不完的试剂4℃保存一周。
3、测定前将CAT 检测工作液37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）水浴10min。
4、取1mLCAT 检测工作液于1mL 石英比色皿中，再加入35μL 样本，混匀5s；室温下立即测定240nm 下的初始吸光值A1和1min 后的吸光值A2。
过氧化氢酶的活性测定
过氧化氢酶的活性测定——高锰酸钾滴定法（滴定法、比色法）【原理】过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。
R(Fe+2)+H2O2==R(Fe+3+OH－)R(Fe+3OH－)2+ H2O2==R(Fe+2)2+2H2O+O2据此，可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。
在反应系统中加入一定量（反应过量）的H2O2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的H2O2 5 H2O2+2 KMnO4+4H2SO4-------- 5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4即可求出消耗的H2O2的量。
【仪器和用具】研钵；三角瓶50ml×4；酸式滴定管（10ml）；恒温水浴；容量瓶25ml×1。
【试剂】10% H2SO4；0.2mol/L磷酸缓冲液pH7.8；0.1mol/L高锰酸钾标准液：称取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，用0.1mol/L草酸溶液标定；0.1mol/L H2O2：市售30% H2O2大约等于17.6mol/L，取30% H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/ KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；0.1mol/L草酸：称取优级纯H2C2O4•2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1L。
【方法】1.酶液提取取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。
2.取50ml三角瓶4个（两个测定两个对照），测定瓶中加入酶液2.5ml，对照瓶中加入高温灭活酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10% H2SO4 2.5ml。
实验九 过氧化氢酶(CAT)活性的测定
( AS 1 + AS 2 ) 2
作
1.写实验报告 写实验报告 2.问题： 问题： 问题
业：
（1）影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些 ）影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些? （2）过氧化氢酶与哪些生化过程有关 ）过氧化氢酶与哪些生化过程有关?
操作步骤：
3．测定
25℃预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的 H2O2 ，每加完一管立即记时，并迅速倒入 石英测2min，记录数据。
4.按下式计算酶活性。
结果计算： 结果计算： 1min内 以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）。 减少0.1的酶量为1个酶活单位（ 0.1的酶量为 过氧化氢酶活性(u/gFW/min)= 过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=
A240 = AS0∆A240 × VT
0.1 × V 1 × t × FW
式中： 式中： 加入煮死酶液的对照管吸光值； AS0—加入煮死酶液的对照管吸光值； 加入煮死酶液的对照管吸光值 样品管吸光值； AS1, AS2—样品管吸光值； 样品管吸光值 Vt—粗酶提取液总体积 ml）； 粗酶提取液总体积（ Vt 粗酶提取液总体积（ml）； 测定用粗酶液体积（ V1—测定用粗酶液体积（ml）； 测定用粗酶液体积 ml）； FW—样品鲜重 样品鲜重（ FW 样品鲜重（g）； 0.1—A 每下降0.1 个酶活单位（ 0.1为 0.1 A240每下降0.1为1个酶活单位（u）； 加过氧化氢到最后一次读数时间（ t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。 加过氧化氢到最后一次读数时间 min）。
操作步骤：
1 ． 称 取 植 物 材 料 0.3g ， 加 入 ， mo1 (pH7 0.1mo1/L 磷 酸 缓 冲 液 (pH7.0) ml(分三次加入 分三次加入， 6ml( 分三次加入 ， 最后两次用于 洗研钵) 在研钵中研磨成匀浆， 洗研钵)，在研钵中研磨成匀浆， 6000r 离心15 分钟， 15分钟 以 6000r ／ min 离心 15 分钟 ， 倾 出上清液。 出上清液。
过氧化氢酶(CAT)活性测定
过氧化氢酶(CAT)活性测定高锰酸钾滴定法(李合生．植物生理生化实验原理和技术[M]．北京：高等教育出版社．2000．165-167)一、原理过氧化氢酶(catalase，CA T)普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，它属于血红蛋白酶，含有铁，能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。
22R(Fe OH3+－) R(Fe2+2 2)2+2 H O2＋O2因此，可以根据H2O2的消耗量或者O2的生成量测定该酶活力的大小。
在该体系中加入一定量(反应过量)的H2O2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液(在酸性条件下)滴定多余的H2O2，即可求出消耗的H2O2的量。
5H2O2+2KMnO4+4H2SO45O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4二、材料、仪器设备及试剂(一)材料植物器官(花瓣、叶片等)(二)仪器设备冰箱、离心机、微量加样器(1ml、20μl、100μl)、移液管、精密电子天平、试管、研钵、剪刀、镊子、三角瓶、恒温水浴、容量瓶、酸式滴定管(三)试剂(1)10% H2SO4(2)0.2mol/L PH7.8磷酸缓冲液(3)0.1mol/L高锰酸钾标准液：称取KMnO4(AR)3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000mL，再用0.1mol/L草酸溶液标定(4) 0.1mol/L H2O2：取30% H2O2(大约等于17.6 mol/L)5.68mL，稀释至1000mL，用0.1mol/L高锰酸钾标准液(在酸性条件下)进行标定(5) 0.1mol/L草酸：称取优级纯H2C2O4.2H2O12.607g，用蒸馏水溶解后，定溶1000mL。
三、试验步骤(一)酶液提取取植物材料2.5g，加入PH7.8的磷酸缓冲液少量，研磨成匀浆，转移至25mL容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定溶，4000r/min离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。
SOD、CAT、POD等的活性测试方法
SOD、CAT、POD等的活性测试方法SOD、CAT、POD测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4?12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4?2H2O（分子量156.01）31.2g。
分别用蒸馏水定容到1000ml。
0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。
（2）14.5mM甲硫氨酸溶液：取2.1637g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至1000ml。
（3）30μM EDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。
（4）60μM核黄素溶液：取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。
（5）2.25mM 氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.1840g NBT用PBS定容至100ml，避光保存。
酶液制备：取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入2ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。
2、酶活性测定（1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液0.6ml，磷酸缓冲液5.4ml，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀；（2）分别取3ml反应混合液和30μl酶液于试管中（3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min；同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30μl PBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。
CAT酶活性测定
植物组织中过氧化氢酶的活性测定—紫外吸收法【原理】H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。
根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。
【仪器与用具】紫外分光光度计；冷冻离心机；研钵；容量瓶；刻度吸管；恒温水浴；分析天平【试剂】1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液2. 0.2mol/L H2O2溶液：30% H2O2 溶于磷酸缓冲液中，定量至250ml。
3.0.05 mol/LTris-Hcl缓冲液（）【材料】正常生长或经逆境处理的新鲜植物组织【方法步骤】1.酶液提取：称取剪碎混匀的植物样品（如叶片等）1.00g置与预冷的研钵中，加入适量预冷的磷酸缓冲液和少量石英砂冰浴研磨成匀浆后，转入10ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到10ml。
取提取液5ml于离心管中，在4℃、15000g下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。
4℃下保存备用。
活性测定（1）取10ml具塞试管，加2ml酶提取液于沸水浴中加热煮死，冷却备用。
（2）取10ml具塞试管，3支为测定管（3个重复），1支为对照，按下表加入试剂：表40-2 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表将上述4支试管于25℃水浴中预热3min后,逐管加入L的H2O2溶液，每加完一管立即在紫外分光光度计上测定A240（蒸馏水调零），每隔30s读数一次，共测3min,记录4支试管的测定值。
（需用石英比色杯）3.结果计算：以1min内A240降低（三支测定管的平均值）的酶量为1个酶活单位（u），先求出3支测定管各自1min内A240降低值，按下式计算CAT活性。
过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=FW t V .V A T⨯⨯⨯⨯124010∆式中 ∆A 240 = A S0－—A S0—加入煮死酶液的对照管吸光值；A S1, A S2,As 3—样品测定管吸光值； Vt —酶提取液总体积（ml ）； V 1—测定时用酶液体积（ml ）； FW —样品鲜重（g ）；—A 240每下降为1个酶活单位（u ）； t —加过氧化氢到最后一次读数时间（min ）。
过氧化氢酶(CAT)酶活测定方法
过氧化氢酶酶活测定方法
一配溶液:
1. 1.5% NaBO3·4H2：
称取1.5g NaBO3·4H2O溶于100ml纯水
2. 0.067M 磷酸盐缓冲：
称取磷酸氢二钠 2.398g溶于100ml纯水，另称取磷酸二氢钠 1.05g 溶于100ml 纯水中，按配方配置成PH为6.8的PBS
3. 1M硫：
10.87ml浓硫酸加入200ml纯水中
4. 0.05M高锰：
0.79g高锰酸钾溶于100ml纯水中。
5. HCl溶液：调PH
二仪器：37°水浴箱，，滴定管，PH试纸，移液器，15ML的离心管，烧杯三步骤：
1.预先用HCL将pH调至6.8的1.5%NaBO3·4H2O 8mL加入含有1.5mL
0.067M ph6.8的磷酸盐缓冲液的烧杯中。
2.在37℃下保持20min后，实验组加入0.5ml酶，对照组加入等量的缓冲
液，混合摇匀。
3．5分钟后，加入到10ml1M硫酸中
4. 在烧瓶中用0.05M高锰酸钾滴定。
5. 结果表示为硼酸单位/每克酶
四计算公式：
酶活力=(V blank—V sample)×0.05×稀释倍数/(样品浓度×0.5) ×(1000/5min)×1000(U/g)
1。
果蔬CAT过氧化氢酶测定方法
果蔬CAT过氧化氢酶测定方法过氧化氢酶是一种存在于许多生物体中的酶，能够将过氧化氢转化为水和氧气。
它在果蔬中的测定方法主要是通过检测其催化过氧化氢分解反应的速率来确定其活性水平。
下面将详细介绍果蔬CAT过氧化氢酶测定方法。
CAT活性的测定方法有许多种，比较常用的方法主要包括荧光法、吸收光谱法和高效液相色谱法。
这里将重点介绍吸收光谱法和高效液相色谱法。
吸收光谱法是通过测定CAT在特定波长的吸光度变化来计算其活性。
具体步骤如下：1.制备样品：将需要测定CAT活性的果蔬样品如苹果、西红柿等取样，剥去外皮并搅碎成泥状。
加入适量的缓冲液，使得样品浓度适当。
2.破碎细胞：将样品放入破碎细胞器中，用超声波或搅拌器将样品破碎，使细胞内的酶释放出来。
3.离心：将破碎后的样品进行离心，除去细胞碎片和其他杂质。
4.准备试剂：制备过氧化氢溶液和过氧化氢酶溶液，分别用于添加到样品中。
5.反应：将等量的样品、过氧化氢溶液和过氧化氢酶溶液混合，开始反应。
在特定波长下，间隔一段时间后，测量吸光度的变化。
6.计算活性：通过吸光度的变化计算出CAT的活性值，单位为单位时间内分解过氧化氢的酶活性。
高效液相色谱法也被广泛应用于CAT活性的测定。
具体步骤如下：1.制备样品：同样，将需要测定CAT活性的果蔬样品剥去外皮并搅碎成泥状。
加入适量的缓冲液，使得样品浓度适当。
2.破碎细胞：将样品放入破碎细胞器中，用超声波或搅拌器将样品破碎，使细胞内的酶释放出来。
3.离心：将破碎后的样品进行离心，除去细胞碎片和其他杂质。
4.蛋白质沉淀：将样品中的蛋白质沉淀出来，去除其他有干扰的物质。
5.准备色谱柱：将样品中的蛋白质溶液加入高效液相色谱仪的色谱柱中。
6.诱导反应：添加过氧化氢溶液和过氧化氢酶溶液到色谱柱中，开始诱导CAT的催化反应。
7.分离与检测：在高效液相色谱仪中，通过色谱柱对样品中的CAT和其他物质进行分离，并实时监测其峰值的变化。
8.计算活性：通过峰面积的计算，可以计算出CAT的活性，单位为单位时间内分解过氧化氢的酶活性。
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1．2．2 CAT提取方法
方法①：按文献[3]i己述的方法。
取花瓣1．00 g，加入少量石英砂、质量分数10％的PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，及i00 mg的CaCO3、2．O0 mL水，冰浴研磨；用50 mol／L pH 7．0 的磷酸缓冲液定容至10 mL；过滤；取滤液1．O0 mL，稀释lO、i00、200、500、1 000、2 000倍。
此为CAT粗酶提取液。
方法②：按文献[4]记述的方法。
取花瓣0．500 g，加入10ⅡlL质量分数10％的PVP，及少量石英砂、2 mmol／L的EDTA、2．5 mmol／L的DTT、体积分数0．5％的一巯基乙醇，冰浴研磨；6 000 r／min、4cC离心20 min；取上清液，稀释10、100、200、500、1 000、2 000倍。
此为CAT粗酶提取
液。
1．2．3 CAT 活性测定方法
方法①：文献[1]记述的碘量滴定法。
碘量法利用H20z能将KI中的I一氧化，生成Iz，以淀粉作为滴定终点指示剂，用硫代硫酸钠滴定，计算出生成Iz的量，再换算成所消耗Hz0z 的量。
方法②：文献[3]记述的紫外分光光度碘量法。
该方法利用I 在波长350 nm处有一个吸收高峰，吸光度与I 的含量成正比来计算生成Iz的量。
用UV一120光度计测定样品对波长为350 nm光线的吸光度(OD值，用“0D350”表示)。
方法③：直接紫外分光光度法。
该方法利用H2oz在波长294 nm处有一个吸收高峰[4]，吸光度与lH20 含量成正比来计算。
取CAT粗酶提取液1．00 mL，加入30~mol／L的H202 2．00ⅡlL，迅速混匀，用UV一120光度计测定反应开始后4 min内对波长294 nm光线的吸光度(用“OD ’表示)的数值变化AOD2g4。
以1．00 mL CAT粗酶提取液与2．00mL H20的混合液为空白对照。
CAT与H202反应只在前5 min内呈线性关系，因此要在酶加底物后的30 S内读出原始读数。
1．2．4 数据分析方法
试验数据采用国际通用统计分析软件SAS 6．12进行分析。
利用外标法测定CAT活性。
即配制浓度为0、1、5、10、15、20 p~nol·L 的H202标准溶液；取2．o0ⅡlL各种浓度的H20 溶液，各加入1．00ⅡlL用方法①提取的CAT酶的100倍稀释液，反应4 min后测定CAT活性；用3．00ⅡIL水调0。
结果如表3。
----测定切花中过氧化氢酶活性的3种常用方法的比较、①
陈晓敏②(华南热带农业大学园艺学院海南儋州 571737)
方法二过氧化氢酶的活力测定——紫外吸收法
H 2O
2
在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液
吸光度(A
240
)随反应时间而降低。
根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活力。
三、材料、仪器与试剂
（一）、材料：小麦叶片
（二）、仪器（仪器的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定）
紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml 容量瓶1个；0.5ml 刻度吸管2支，2ml 刻度吸管1支；10ml 试管3支；恒温水浴； （三）、试剂（试剂的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定后并配制）
0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）；0.1mol/L H 2O 2（用0.1mol/L 高锰酸钾标定）。
四、实验操作：
1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g 置研钵中，加入2～3ml 4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml 容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。
混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min ，取上部澄清液在4000rpm 下离心15min ，上清液即为过氧化氢酶粗提液。
5℃下保存备用。
2.测定：取10ml 试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表40-2顺序加入试剂。
22速倒入石英比色杯中，240nm 下测定吸光度，每隔1min 读数1次，共测4min ，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活力。
五、计算
以1min 内A 240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u ）。
过氧化氢酶活力(u/gFW/min)=FW t V .V A T
⨯⨯⨯⨯124010∆
式中 ∆A 240 = A S0－()
A A S S 122+
A S0—加入煮死酶液的对照管吸光值； A S1, A S2—样品管吸光值； Vt —粗酶提取液总体积（ml ）； V 1—测定用粗酶液体积（ml ）； FW —样品鲜重（g ）；
0.1—A 240每下降0.1为1个酶活单位（u ）； t —加过氧化氢到最后一次读数时间（min ）。
六、注意事项
凡在240nm 下有强吸收的物质对本实验有干扰。
七、思考题
1.影响过氧化氢酶活力测定的因素有哪些?
2.过氧化氢酶与哪些生化过程有关?。