细胞的冻存及复苏PPT课件
实验6_细胞冻存与复苏
『超低温冰箱』
制冷系统
基本采用复叠式制冷的工作原理，选用两台全封闭 压缩机作为高、低温级压缩机使用
外观
卧式，立式
-86℃超低温冰箱使用
使用90～95%能力，以延长机器寿命；设置使用温 度为-76℃
实验6 细胞冻存与复苏
1- 细胞冻存操作步骤
准备 冻存液（完全培养基配制的10%DMSO 溶液）配制 对数生长期细胞的吹打（消化）、收集、离心和计数（或估算）
1000rpm6min，去上清
用冻存液悬浮细胞使密度在～106/ml 左右 分装到冻存管
用记号笔在冻存管上加写标识（细胞株号+日期+操作者） 无菌分装到1.8ml 冻存管，装量0.5～1.0ml/支 冻存
重新悬浮 用5×体积的完全培养基悬浮细胞，铺放培养孔或培养瓶内，镜检
培养与观察 用记号笔加写标识，镜检观察 置CO2 培养箱内，培养18～24h后镜检细胞活性
3- 工作总结与评价
细胞冻存操作中影响细胞活性的因素分析 细胞复苏操作中影响细胞活性的因素分析 超低温冰箱使用与维护要点分析
影响保温的因素：门霜和冰块 使用过程中，温度升高到-60℃时必须关闭箱门
2- 细胞复苏操作步骤
准备 超净工作台消毒灭菌，无菌器材准备 准备37℃水浴 明确冻存细胞所在冻存管的存放位置，确认冻存18~24h以上
融化 在水浴中充分搅拌使在～1min 融化彻底
离心去除冻存液 无菌操作，10×体积的培养基稀释，1000rpm6miБайду номын сангаас，去上清，分 散沉淀
谢谢观赏
实验十一细胞的冻存与复苏 ppt课件
• 3. 低速离心，1000rpm，10分钟。 • 4. 去上清，加新鲜培养液3ml。 • 5. 将刚复苏的细胞转移至培养瓶中，C02培养箱，
37 ℃培养。
复苏要点
• 快速解冻
– 冻存细胞从液氮中取出后，立即放入37℃水 浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1 分钟内全 部融化（不要超过3 分钟）
实验十一、细胞的冻存与复苏
一、实验目的
1.初步掌握冻存与复苏的原理及其操作过程 2. 继续强化细胞无菌操作理念
二、实验材料与用品
（一）材料：Hela细胞
（二）试剂 培养液：1640培养液+15%小牛血清；胰蛋白酶消 化液：0.25%；冻存液、液氮
三、实验原理
• 细胞冻存的原理：当细胞冷到零度以下，可以产 生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓 度升高，并在细胞内形成冰晶。
–细胞对冷冻保护剂特别敏感，解冻后的细胞应先通 过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长 培养液的培养瓶。
四、实验步骤
一、细胞冻存方法
• 1.预先配制冻存液： 含10-30%血清培养基，10% DMSO。 • 2.取对数生长期细胞，胰酶消化后，加全培养基终止消化，
1000rpm离心收集细胞，加入适量冻存液, 用吸管吹打制成 细胞悬液（1×106 ～ 5 ×106细胞/ml) • 3.加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷 冻日期。 • 4.冷冻过程要缓慢。4℃ 30－60 分钟→-20℃ 30 分钟 →80℃ 16－18 小时（或过夜）→液氮长期保存
透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程， 能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少 胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。 • 常用细胞冷冻保存液 10％DMSO ＋ 20％血清＋基础培养液 10％甘油＋ 20％血清＋基础培养液
细胞的冻存及复苏
冷冻速率：慢冻
复苏速率：快融
冷冻保护剂：渗透性和非渗透性 冷冻保存温度：－196 ℃（液氮）
冷冻保存方法
1．非玻璃化冷冻 非玻璃化冻存是利用各种温级的冰箱分阶段降 温至-70 ℃ ～-80 ℃ ，然后直接投入液氮进行保 存；或者是利用电子计算机程控降温仪以及利用 液氮的气、液，按一定的降温速率从室温降至1000C以下，再直接投入液氮保存的方法 该种方法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形 成
细胞冻存与复苏的关键因素
要获得好的冻存与复苏效果，必须了解如下几 个问题：冷冻速率、复苏速率、冷冻保护剂，冷 冻保存温度。
细胞冻存与复苏的关键因素 冷冻速率
冷冻速率：降温的速度，直接关系到冷冻效果， 对一种细胞进行冷冻保存之前，首先需要测定其 最适冷冻速率，以保证获得最高的冷冻存活率。
细胞冻存与复苏的关键因素 冷冻速率
细胞冻存与复苏ຫໍສະໝຸດ 细胞的冻存和复苏 1.细胞冻存
细胞冻存与细胞传代保存相比优势在于：一，可以减少 人力、经费投入，减少污染，减少细胞生物学特性变化； 二，有利于保存那些不立即使用的细胞系或者将细胞系 转给其他使用者。
细胞的冻存和复苏 1.细胞冻存
目前，动物细胞一般保存于液氮（-196℃）。
细胞的冻存和复苏 2.细胞复苏
在体外培养工作中，常要将体外培养物进行冷冻保 存，在需要时再复温融解进行体外培养（复苏）。
细胞冻存与复苏的原理
• 为使细胞复苏时存活率最高 • 最佳的冻存条件： 尽可能地降低细胞内的晶体形
成，减小细胞内水凝固所形成的高浓度溶质对细 胞造成的损伤。 • A) 缓慢冷冻 • B) 用亲水的低温保护剂排除水分 • C)在尽可能低的温度保存细胞 • D)快速复苏
冷冻保存方法
细胞的冻存与复苏
细胞的冻存与复苏为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。
冻存的温度一般用液氮的温度为－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冷冻后，最终保存于液氮中。
在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。
冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。
复苏一般采用快速融化方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解，然后将细胞转入培养器皿中进行培养。
一、细胞的冻存（一）仪器、用品与试剂细胞培养箱、液氮罐、普通冰箱、－80℃超低温冰箱、离心机、冻存管、离心管、冻存盒、倒置显微镜、吸管、废液缸、添加有0.02%EDTA 的0.25%胰蛋白酶消化液、细胞冻存液（10ml体系：含7ml培养基、2ml FBS、1ml 甘油或DMSO）、细胞培养基（如添加有10％FBS的RPMI1640）等。
（二）方法1、取旺盛生长的、已基本上快要长满细胞的培养瓶，小心吸干瓶内培养液。
给每个培养瓶中加入1-2ml胰蛋白酶消化液，37℃消化细胞。
2、待大部分细胞从瓶壁脱落下来后，加入3-5ml细胞培养基终止消化。
3、1000rpm 离心5分钟，收集细胞沉淀。
4、加入适量细胞冻存液，调整细胞密度在1-10×106个/ml。
5、将上述细胞悬液小心分装入冻存管中，拧紧冻存管盖子，标注清楚细胞名称、冻存日期等内容。
6、置4℃普通冰箱中预冷30min或者1h。
7、将冻存管放入冻存盒中，立即转移入－80℃超低温冰箱过夜。
8、将冻存管转移入液氮罐中，在记录本上记录清楚细胞冻存管的位置、名称等信息。
（三）注意事项1、冻存细胞的生长状态要好，建议在冻存前24小时内对培养基进行换液，冻存前培养瓶中细胞的密度不宜过高。
2、冻存液的配方可根据细胞种类之不同进行适当调整，血清的浓度可以更高一些，甘油和DMSO的浓度也可在5-20%之间调整。
细胞的冻存与复苏
细胞的冻存与复苏一.实验原理体外培养的细胞随着传代次数的增加，在体外环境中生存时间的增长，其各种生物特性都将逐渐发生变化，且细胞的传代培养过程中，培养器具、培养液等都需大量的耗费，因此及时进行细胞冻存十分必要。
细胞冻存通常指将细胞冷冻储存在-196℃的液氮中，理论上可以储存无限长的时间。
如果不加保护剂直接对细胞进行冷冻，会导致细胞内外的水份迅速形成冰晶，并对细胞的结构造成损害。
目前冻存细胞时多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，缓慢冷冻时可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成而造成的细胞损伤，且不会对细胞造成毒性。
细胞的复苏是指将冻存的细胞从液氮中取出融解，使其活力恢复的过程。
细胞复苏应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
二.试剂器材1.完全培养基2.PBS3.DMSO4.0.25%胰酶(贴壁细胞需要)5.0.4%台盼蓝溶液(取台盼蓝0.4g，溶于100ml生理盐水或PBS中，经0.22μm滤膜过滤除菌，分装于1.5ml无菌离心管中，室温保存备用)6.冻存培养液(取完全培养基9.0ml，逐滴加入DMSO 1.0ml)7.细胞培养瓶8.15ml离心管9.冻存管10. 水浴锅其他器材：移液器、移液器吸头(10μl、100μl、1ml)、温度计、镊子、血球计数板、计数器、废液缸、离心管架、涡旋振荡器等。
三.操作步骤细胞冻存冷冻前24-48hr更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期；配制含10%DMSO、10%小牛血清的冻存培养液置于4℃下待用；贴壁细胞：用胰蛋白酶把贴壁生长的细胞消化下来，制备成单细胞悬液，200-400g离心5min收集细胞；悬浮细胞：直接将细胞移至离心管中，200-400g离心5min收集细胞；弃去上清，用冻存液混悬起沉淀细胞，取少量细胞悬浮液计数细胞浓度及冻前存活率；加冻存液调整细胞浓度至(1-10)×106/ml；将细胞分装入冻存管中，每管1-1.5 ml，标明细胞的名称、冻存时间及操作者；将上述冻存管在4℃下放置30min；然后移入-20℃冰箱30min；置于-80℃冰箱过夜；再置于液氮罐中长期保存。
细胞复苏与冻存
慢冻快溶
细胞复苏的操作步骤：
1：从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入37度水浴中，一般用烧杯倒入蒸馏水，然后放入水浴锅中预热，防止水浴锅中水污染细胞，将冻存管竖起，快速摇晃，直至冻存液完全融化。
2：将细胞悬液移入离心管，缓慢加入4ml 培养液，离心1000转每分钟，离五分钟。
3：将离心后的上清液吸出，加入PBS 清洗一下细胞，减少DMSO 对细胞的毒性作用，缓慢捶打均匀，然后离心。
4：将上清吸出，用培养液混匀沉淀的细胞，调整细胞密度，将细胞悬液吸入培养瓶中，再加入新的培养液培养，等细胞贴壁后即换液，以去掉死细胞。
细胞冻存的步骤：
1：将细胞从培养瓶上消化下来，然后加入培养液，混匀后计数，要按照每管冻存管中含有2×10 6个细胞。
2：然后将细胞悬液吸入5ml 离心管中，离心
3：将上面液体吸走，然后按计算结果加入DMEM 缓慢混匀。
4：冻存液的配制，1ml ；600ul10％DMEM 细胞悬液+300ul 血清+100ulDMSO ，
5：然后将混好的液体吸入2ml 冻存管中，冻存，先放入4度冰箱中，然后再放入-20度，最后放入液氮中保存。
细胞的冻存复苏和运输.ppt
将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳 将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1～2 ℃的速度，在40分 钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。
Hale Waihona Puke 冻存和复苏的原则：慢冻快融
复苏方法
（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38 ℃水浴中， 使其融化（1分钟左右）。
冻存和复苏的原则：慢冻快融
当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细 胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶，冰晶导致细胞 损伤甚至死亡。
甘油或二甲基亚砜可使冰点降低，在缓慢冻结条件下，可
使细胞内水分逐步透出，避免大的冰晶；相反，结晶就大，大结 晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。
复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶
的重结晶。融化速度快，还可使迅速通过最易受损的-5－0度
冻存和复苏的原则：慢冻快融
冻存方法
1）预先配制冻存液： 含10%－20％血清的培养基＋ 10% DMSO或甘油
2）取对数生长期细胞，经胰酶消化（或离心）后， 加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液 （1×106 ～ 5 ×106细胞/ml)
❖ 目前冷冻保护剂可分为渗透性和非渗透性两类。 ❖ 具有渗透性的冷冻保护剂可以渗透到细胞内，一般是一
些小分子的物质，主要有甘油、DMSO、乙二醇、丙二 醇、乙酰胺、甲醇等，。 ❖ 非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内，一般是些大分 子物质，主要有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二 醇、羟乙基淀粉等。
（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。 （3）低速（800－1000rpm）离心10分钟。 （4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。每日
细胞复苏学习幻灯
冻存细胞解冻学习幻灯
张永华 北京永泰免疫应用科技有限公司
冻存细胞解冻的原则
在实际操作中，冻存细胞要进行复苏， 在实际操作中，冻存细胞要进行复苏，再 培养传代。复苏细胞一般采用快速融化法。 培养传代。复苏细胞一般采用快速融化法。 以保证细胞外结晶快速融化， 以保证细胞外结晶快速融化，以避免慢速 融化水分渗入细胞内， 融化水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶 损胞冻存管从加有液氮的保温桶中用镊 子夹牢，快速在37度水浴锅中摆动，使冻 子夹牢，快速在37度水浴锅中摆动，使冻 存液迅速解冻融化。注意在这过程中尽量 使冻存管盖位于水面上。 待冻存管中大部分内容物已呈液态时，将 冻存管表面消毒后移入生物安全柜。
注意事项 在细胞复苏操作时， 在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞 速度要快，可不时摇动冻存管， 速度要快，可不时摇动冻存管，使之尽快 通过最易受损的温度段（ ）。这 通过最易受损的温度段（-5～0℃）。这 样复苏的冻存细胞存活率高， 样复苏的冻存细胞存活率高，生长及形态 良好。 良好。 从液氮罐中取出冻存管， 从液氮罐中取出冻存管，有时因冻存管未 封严，浸入了液氮， 封严，浸入了液氮，取出后因冻存管内液 氮迅速气化而发生爆炸， 氮迅速气化而发生爆炸，因此应带有防护 眼睛和手套。 眼睛和手套。
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冷冻保存方法
1．非玻璃化冷冻 非玻璃化冻存是利用各种温级的冰箱分阶段降
温至-70 ℃ ～-80 ℃ ，然后直接投入液氮进行保 存；或者是利用电子计算机程控降温仪以及利用 液氮的气、液，按一定的降温速率从室温降至1000C以下，再直接投入液氮保存的方法 该种方法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形 成
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细胞冻存与复苏的关键因素
复苏速率
复苏速率：在细胞复苏时温度升高的速度。复温 速率不当也会降低冻存细胞存活率。一般来说， 复温速度越快越好，速度过慢，细胞内往往重新 形成较大冰晶而造成细胞损伤。复温时造成的细 胞损伤非常快，往往在极短的时间内发生。
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细胞冻存与复苏的关键因素 冷冻保护剂
冷冻保护剂：可以保护细胞免受冷冻损伤的物质 分为渗透性和非渗透性两类。 不同的冷冻保护剂有不同的优、缺点。目前一般 多联合使用两种以上冷冻保护剂组成保护液。
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细胞冻存与复苏的关键因素
保存温度
冷冻保存温度：能长期保存细胞的超低温度，在 此温度下，细胞生化反应极其缓慢甚至停止，但 经过长期保存，在复苏后仍能保持正常的结构和 功能。 液氮温度（-196℃）是 目前最佳的冷冻保存温度。
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冷冻速率：慢冻 复苏速率：快融 冷冻保护剂：渗透性和非渗透性 冷冻保存温度：－196 ℃（液氮）
细胞冻存与复苏
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细胞的冻存和复苏
1.细胞冻存
细胞冻存与细胞传代保存相比优势在于：一，可以减少 人力、经费投入，减少污染，减少细胞生物学特性变化； 二，有利于保存那些不立即使用的细胞系或者将细胞系 转给其他使用者。
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细胞的冻存和复苏 1.细胞冻存
目前，动物细胞一般保存于液氮（-196℃）。
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细胞的冻存和复苏 2.细胞复苏
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细胞复苏方法
1、液氮中取出冷冻管→27~38℃水浴中，约 1min融化 2、室温下5min，用25 ℃左右血清培养液稀释 至原体积的4倍。 3、500r / min，低速离心10min。 4、去上清液，加新鲜培养液培养。
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在体外培养工作中，常要将体外培养物进行冷冻保 存，在需要时再复温融解进行体外培养（复苏）。
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细胞冻存与复苏的原理
• 为使细胞复苏时存活率最高 • 最佳的冻存条件： 尽可能地降低细胞内的晶体形
成，减小细胞内水凝固所形成的高浓度溶质对细 胞造成的损伤。
• A) 缓慢冷冻 • B) 用亲水的低温保护剂排除水分 • C)在尽可能低的温度保存细胞 • D)快速复苏
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冷冻保存方法
2．玻璃化冷冻 玻璃化冻存则是指利用多种高浓度的冷冻保护剂 联合形成的玻璃化冷冻保护液保护悬浮细胞，直 接投入液氮进行冻存的方法。以该种方法冻结的 细胞悬液没有冰晶的形成。 玻璃化冻存法对细胞活性的保存具有较好的效果， 不需要复杂的仪器设备，具有液氮储存设备即可 使用。目前，该方法已在胚胎冷冻方面得到广泛 应用，但很少应用于一般细胞的冻存。
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Байду номын сангаас
细胞冻存与复苏的关键因素
要获得好的冻存与复苏效果，必须了解如下几 个问题：冷冻速率、复苏速率、冷冻保护剂，冷 冻保存温度。
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细胞冻存与复苏的关键因素 冷冻速率
冷冻速率：降温的速度，直接关系到冷冻效果， 对一种细胞进行冷冻保存之前，首先需要测定其 最适冷冻速率，以保证获得最高的冷冻存活率。
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细胞冻存与复苏的关键因素
冷冻速率
不同的冷冻速率使细胞内发生不同的生理变化，也可以 产生不同的损伤。冷冻速度过慢时，细胞脱水严重，超 过一定程度时即失去活性。同时引起细胞外溶液部分结 冰，未结冰的溶液中溶质浓度增高产生溶质损伤。当冷 冻速度过快时，细胞内水分来不及外渗，会形成冰晶， 造成细胞膜及细胞器的破坏，产生细胞内冰晶损伤。