mRNA差别显示技术演示文稿
mRNA差异显示技术概述
抑 制有 关 的基 因鉴定 与克 隆 中 ，这种 方法 称 为差异
显 示 反转 录聚合 酶链 式反 应 （ Ｄ Ｔ Ｐ Ｒ） Ｄ Ｒ —Ｃ 。
１ ｍＲ ＮＡ差 异显 示技术 的原 理
ｍ Ｎ 差异 显 示技 术 和 Ｒ Ａ 随机 引 物 聚合 酶 Ｒ Ａ Ｎ
链 式 反 应 （ Ａ — Ｃ 都 是 基 于 这 样 一 种 假设 ：只 Ｒ Ｐ Ｐ Ｒ）
中采用的只是随机的寡聚脱氧核糖核苷酸作为引物， 而 ｍ Ｎ 差 异显 示 技 术 则是 根 据成 熟 的 ｍＲ Ａ ３ Ｒ Ａ Ｎ
端具 有 ８ ～ ０ ｐ的起保 护 作 用 的 ｐｌ（ 尾 巴这 ０ ２０ｂ ｏｙＡ）
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［１ 王先远， 兰兴 ． 氨酸对烧伤大 鼠细胞因子的影 响ｆ． １】 高 精 Ｊ 营养 ］
学 报 ，１９ ， ８ ４ ： ９ — ９ ． ９６ １（）３２３７
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人类 基 因组协 会公 布 的最新 数据表 明 ，人类 和 其他 高 等 生 物基 因组 可 能包 含 约 ３ ０ ００ ０蛋 白编 码 基 因 ，其 中 仅 约 １ ％被 认 为 是 在 不 同发 育 阶 段 、 ５
ddRT-PCR(差示反转录PCR) PCR实验技术
ddRT-PCR(差示反转录PCR,又mRNA差别显示技术) mRNA差别显示技术也称为差示反转录PCR（Differential Display of reverse Transcriptional PCR）简称为ddRT-PCR。
它是将mRNA反转录技术与PCR技术二者相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术。
目前已广泛应用于分离鉴定组织特异性表达的基因。
差别基因表达（differential gene express）是细胞分化的基础。
mRNA 差别显示技术正是对组织特异性表达的基因进行分离的一种快速而行之有效的方法。
该方法的基本原理是首先选取不同的组织样品或不同发育阶段的同一组织样品或同一组织样品经不同药物处理诱导的样品，经总RNA提取后，进行mRNA反转录合成cDNA。
此cDNA的合成是采用Oligo（dT）12 MN为引物，其中M为A，C，G中的任意一种，N为A，C，G或T中的任意一种，所以共有12种oligo（dT）12 MN引物，其中M称为锚定碱基，起增大引物Tm值的作用，N称为分类碱基，对反转录进行分类。
用这12种引物分别对同一总RNA 样品进行cDNA合成，即进行12次不同的反转录反应，从而使反转录的cDNA具有12种类型，也就是对cDNA进行12种归类（目前较为流行的方法是进行4种归类，即M为简并碱基的形式存在），在此基础上对每一类cDNA进行随机引物和反转录引物PCR扩增，通过对组织样品的同一类cDNA的PCR选择性扩增产物凝胶电泳分析，从而反映出不同样品间基因的时间和空间上组织特异性的表达。
如此众多种类的mRNA反转录产物经PCR选择扩增后其类型依然为数众多，很难用电泳系统加以快速准确地分离。
因而需要对反转录产物cDNA进行归类处理，减轻不同PCR产物电泳分离的难度，提高分离的准确率。
（见示意图）一、实验流程：。
mRNA差异显示技术_PCR技术及其在动物营养研究中的运用
科技视野
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饲料广角 !""!年第 " 期
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区分出突变模板 ! 还可以在靶序列中央插入或缺 失几个碱基的 !"# 片段作为竞争序列 !插入或缺 失序列的长度以扩增后能使两种产物在琼脂糖凝 胶电泳上分开为宜 !不能太长 !以免竞争模板的扩 增效率与待测模板不一致 " 这两种方法都能很好 地保证两种模板具有相同的扩增效率 ! 但也存在 着明显的不足 " 根据竞争模板与待测模板长度的 细微差别来区别扩增产物 ! 虽能使两种模板的扩 增效率趋于一致 !但是在变性 #退火 $的过程中 ! 会 产生异源双链和同源双链两种产物 ! 在通常的非 变性电泳的条件下 !不能使它们分离开 !这降低了 竞争性 $%& 的敏感性 ! 增加了衡量的难度 % 在竞 争模板中引入新的酶切位点虽然避免了上述问 题 !但费用高 !费时费力 " 用与靶序列非同源的序 列作为竞争模板 !可以避免异源双链的形成 ! 但是 会出现两种模板扩增效率不同的情况 ! 同样会影 响定量的准确性 " 为克服这一缺点 !!’()*+ , 等在 进行兔颗粒细胞芳香酶 -!"# 的定量研究中 ! 引 入了校正系数 !极大地提高了测量的准确性 " 组织中无变化 " 这些都表明锌缺乏促进白细胞介 素03! 诱导金属硫蛋白质基因的表达 "
>/-8/ ?@A*’’/B(C 和 &DE+)F G@%D*A/CA 用 竞 争
性 $%& 技术研究日粮中添加锌和单核细胞中金 属硫蛋白质 5&"# 水平的关系 ! 结果表明金属硫 蛋白质 5&"# 是监测人体中锌水平的合适变量 " 人体中锌的含量很难检测 ! 日粮锌对金属硫蛋白 质基因表达的调节属转录调节 ! 因此它可以作为 相关功能的评价参数 " 他们用竞争性 $%& 技术对 添 加 锌 试 验 组 和 对 照 组 3HI 内 的 单 核 细 胞 中 金 属硫蛋白质 5&"# 水平进行定量研究 ! 发现与对 照组相比 ! 在添加锌的第 :I! 试验组动物单核细 胞中金属硫蛋白质 5&"# 水平显著提高 ! 这种升 高持续到第 3HI! 而血浆中锌的水平在第 :I 比对 照组提高了 JKL ! 在第 1HI 又显著下降 ! 此时 ! 其 锌的含量是对照组的 4KL ! 这表明单核细胞中金 属硫蛋白质 5&"# 的水平与锌的添加相关 ! 且比 血浆锌含量更适于表示人体内锌的水平 "
荧光标记mRNA差异显示技术
荧光标记mRNA差异显示技术mRNA差异显示技术（differential display，DD）是用于研究基因的差异表达的新方法。
该技术自1992年被首次报道后，即以其不可替代的优势被广泛应用于生物医学领域。
在应用过程中不断得到改进，并产生了诸多衍生技术如RPA（RNA finger printing by arbitrarily primed PCR）、GDD （genomic DD）等。
本文简要介绍在本试验室荧光标记差异显示技术（fluorescent DD，FDD）的应用及体会。
1.材料与方法1.1 标本人单核细胞系U937，细胞密度2×108/L，分对照组（N）、处理Ⅰ组（T1）、处理Ⅱ组（T 2），N用1640培养基及10%胎牛血清培养，T1用IF N-γ104U/L LPS 1μg/L、T2用IFN- γ10 U/L LPS l0μg/L分别刺激7h.1.2 主要试剂与仪器TRIzol试剂（GIBCO BRL）、Fluoro DD试剂盒（Genomyx）、Supersript Ⅱ逆转录酶（GIBCO BRL）、Ampli Taq DNA聚合酶（GIBCO BRL）、RNase-free DNaseI（Promega）；Genomyx LR 、 Genomyx SC、DNAT hermal Cycler（Perkin Elmer）1.3 总RNA的制备按试剂盒提供的方法分别提取三种细胞的总RNA,以RNase-free DNase I（终浓度80 000 U/L）除去其中污染的 DNA,经甲醛变性凝胶电冰鉴定其完整性，并以紫外分光光度计检测其纯度1.4 mRNA差异显示1.4.1 逆转录反应选择锚定引物[T7（dT12）AP(anchored prime rs，AP)]，序列为5'ACGACTCACT ATAGGGCTTTTTTTTTTTTMN3'，其中M=A/G/C。
mRNA展示技术ppt课件
人们已利用这种新的技术鉴定了许多功能性 多肽，包括 RNA 结合肽、TNF-α 结合因 子等，建立了以 mRNA 体外展示技术筛选 与抗肿瘤药物的重要靶酶———胸苷酸合 成酶mRNA高度亲和多肽的方讨
Structure of mRNA-linker
体积25ul,其中含10xPCR缓冲液2.5 u凝胶载体上，然后加入 400ul
洗涤5~6遍后，加入洗脱液(无酵母 tRNA) 及
mRNA展示技 术
应用：
CAT(Cambridge Antibody Technology) 应用体外展示技术制备单克隆抗体用于疾 病的治疗：
D2E7 ABT-874 CAT-192and GC1008
CAT-5001 (formerly SS1P)
目前应用的组合多肽/蛋白质库技术包括 噬菌体展示技术(phage display) 酵母双杂交 与核糖体展示技术(ribosome display，RD) mRNA体外展示技术( mRNA display)
基本原理：借助一种蛋白质合成 抑制剂嘌呤霉素(puromycin)来 形成mRNA- 蛋白质融合体，从 而实现基因表型 (RNA)与蛋白质 表型(多肽) 的结合. 嘌呤霉素是 一种模拟子的3’端，当 mRNA 翻译完成时，嘌呤霉素进入核糖 体的 A 位点接纳新生肽，抑制蛋 白质翻译，在多肽与嘌呤霉素的 O- 甲基酪氨酸之间形成稳定的 酰胺键，生成肽酰嘌呤霉素复物， 而使mRNA3 ’端和蛋白质的羧基 端通过嘌呤霉素分子共价地联系 在一起。
DNA展示技术
mRNA体外展示又称mRNA- 蛋白质融合体 展示(mRNA-protein fusion display)，是 近年来发展的一种高效多肽选择技术。 它可以由大容量的多肽库中(1013 ~1015 个分子)获得具有特定生物学功能的多肽分子. 与噬菌体和核糖体展示技术相比，mRNA 体 外展示技术具有多肽库容量大、筛选方法简 便等优点，特别适用于获得小分子功能性多 肽
mRNA差异显示技术解读
八.DDRT-PCR的技术改进
针对以上不足,特别是假阳性率高的缺点，从以下几个方面 做了大量改进：
引物设计 反应条件的优化 显示方法 假阳性鉴定
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引物设计
mol等将12种锚定引物变为4种，并发现G的扩增 效果最好
王夏等在T12MN之前加上了一段T7启动子序列， 提高了PCR反应的严谨性 Liang发现9~10个mer长度的随机引物比较适宜
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三、mRNA差异显示技术的原理：
mRNA差异显示技术的主要原理是利用 cDNA反转录技术,PCR扩增和高分辨率聚丙 烯酰胺凝胶电泳技术，来显示PCR产物的差 异。其中，反转录技术中使用了一系列能与 mRNA的Poly（A）尾巴相结合的锚定寡聚 脱氧核苷酸引物OligoT12MN。锚定引物与 mRNA的Poly（A）+的两个碱基，在反转录 酶的作用下可以启动mRNA群体反转录。
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mRNA差异显示技术简略流程图
六. DDRT-PCR的优点
以RT-PCR和DNA凝胶电泳为基础 灵敏度高，仅需0.2μg的总RNA 可以同时比较多个样品间基因表达的 差异 可以同时检测到“上调”及“下调” 的基因 时间短，实验过程中可步步验证比较 可进行多基因家族的表达分析
主要用于医学研究的癌症、神经、 骨科、病理、生殖等领域 动植物遗传、育种，动物营养及微 生物等领域
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五. DDRT-PCR一般操作步骤
总RNA的提取与反转录 RT-PCR
聚丙烯酰胺凝胶电泳及差异DNA条带的回收
PCR在扩增及其产物的回收
测序和数据库比对分析
实时定量PCR
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mRNA差别显示技术[DDRT-PCR]
![mRNA差别显示技术[DDRT-PCR]](https://img.taocdn.com/s3/m/52d5e58a1711cc7930b716b2.png)
mRNA差别显示技术[DDRT-PCR]随着PCR技术的发展，人们在此基础上建立起了一系列基于基因分离的新技术新方法。
如mRNA差别显示技术（DDRT-PCR）、以及进一步改进的代表性差示分析（RA D），抑制性扣除杂交（SSH）和交互扣除RNA差别显示技术（RSDD）。
差别显示ＰＣＲ是根据绝大多数真核细胞mRNA3’端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）结构，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸为引物将不同的 mRNA反转录成cDNA。
该方法的创始人Liang P和Pardee A根据Poly A序列起点前2个碱基除AA外只有12种可能性的特征，设计合成了12种下游引物，称3′-锚定引物，其通式为5’-T11MN；同时为扩增出polyA 上游500bp以内所有可能性的mRNA序列，在5′端又设计了20种10bp长的随机引物。
这样构成的引物对进行PCR扩增能产生出20000条左右的 DNA条带，其中每一条都代表一种特定mRNA种，这一数字大体涵盖了在一定发育阶段某种细胞类型中所表达的全部mRNA。
差别显示技术自1992年建立后，一直在不断进行着改进。
如在1994年，Ito等对3′端锚定引物的设计由固定两个碱基变为一个碱基固定的引物，这就使原来12种引物减至3种即可(5′Ｔ12Ｇ，5′Ｔ12Ａ，5′Ｔ12Ｃ)，这样做减少了每个mRNA样品对逆转录反应种类的需要，并且把由于简并性引起的某些ＲＮＡ的代表性差和RNA数量过多现象降低到最低程度；在随后的两年中，研究人员有在3′端引物和5′随机引物末端分别加上了限制性内切酶识别位点 (如Hind III酶切位点)，使得5′端引物条数改为8条，长度为13bp，而3′端引物则由18个碱基组成。
这样形成的24种引物对，经计算机同源性分析表明同样能覆盖全部mRNA，使实验简化，同时由于引物变长，使cDNA扩增更为有效。
有的实验室采用把Bakman公司的kit，其引物5′端为26bp，3′ 端为31bp，并加上了T3和T7两端的测序引物，由仪器切割差异条带后，再次扩增，并通过荧光标记，用计算机统计出结果。
mrna差异表达
mrna差异表达
mRNA差异表达是指在不同条件或不同组织中，基因的mRNA表达水平存在显著差异。
mRNA差异表达分析可以帮助我们理解基因在生物学过程中的调控和功能。
以下是一般进行mRNA差异表达分析的步骤：
1. 数据获取：首先需要获得待分析的RNA测序数据，常见的有RNA-seq和microarray等技术。
2. 数据预处理：对原始数据进行质量控制和去除噪声，包括去除低质量的序列、去除接头序列、过滤掉含有未知碱基的读段等。
3. 序列比对：将预处理后的reads与参考基因组进行比对，确定每个read的起始位置。
4. 基因表达量计算：通过计算每个基因上reads的数量或覆盖度来估算基因的表达量。
5. 统计分析：通过统计学方法比较不同样本之间的基因表达水平差异，常用的方法包括DESeq、edgeR等。
6. 差异基因筛选：根据统计学的显著性水平和折叠变化值，筛选出具有显著差异表达的基因。
7. 生物信息学分析：对差异表达基因进行功能注释、通路分析和聚类分析等，以揭示差异基因的生物学意义。
总结起来，mRNA差异表达分析是一种通过测序技术获取基因表达水平的信息，并通过统计学方法对不同条件或组织中基因表达差异进行分析和解释的方法。
这种分析有助于我们深入了解基因调控和功
能在不同生物过程中的作用。
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RNA指纹
RNA 首先在逆 转录酶的作用下使 RNA 逆转录为DNA， 之后以其DNA 为模 板，通过以DNA指纹 技术建立指纹图谱进 行分析。
DNA指纹
某些DNA序列的差异 可通过限制性酶切片段长 度的改变反映出来，此即 限制性片段长度多态性 (RFLP)。其主要原因是由 于DNA序列个别碱基的突 变而引起某个限制性内切 酶识别位点的获得或丢失， 表现为不同长度的酶切片 段．
基因差异表达
基因表达调控的一种方 式。指在对信号或诱导物做 出应答时，选择表达不同的 基因，或使基因的表达水平 有所不同。
DD的发明及其基础
• 由Liang于1992年创立
– 是分离差异表达基因强有力的工具 – 在随后几年里， Liang等在技术方面做
了大量改进，使技术更适用、更简便
• 基于RT-PCR理论，依赖于3种 技术
反转录PCR
反转录PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）又称为逆转录PCR。其原理是：提取组织 或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT) 或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进 行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA 检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分 析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取 目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 RT- PCR （Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）即 逆转录PCR，是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩 增反应（PCR）相结合的技术。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛 ，可用于检测细胞/组织中基因表达水平，细胞中RNA病毒的 含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。
基本原理是，几乎所有的真核基因mRNA分子的3’-末端， 都带有一个多聚的腺苷酸结构，即通常所说的poly(A)尾巴。 因此，在RNA聚合酶的作用下，可按mRNA为模板，以 oligo(dT)为引物合成出cDNA拷贝。根据mRNA分子3’-末端 序列末端结构的分析可以看到，在这段poly(A)序列起点碱 基之前的一个碱基，除了为A的情况之外，只能有C、G、T三 种可能。根据这种序列结构特征，P. Peng等人设计合成三 种不同的下游引物，它由11个或12个连续的脱氧核苷酸加上 一个3’-末端锚定脱氧核苷酸组成，用5’-T11G、5’-T11C、 5’-T11A表示，这样每一种此类人工合成的寡核苷酸引物都 将能够把总mRNA群体的1/3分子反转录成mRNA-cDNA杂交分子。 于是，采用这三种引物，可以将整个mRNA群体在cDNA水平上 分成三个亚群体。然后用一个上游的随机引物和与反转录时 相同的oligo(dT)引物对这个ｃＤＮＡ亚群体进行ＰＣＲ扩 增，因为这个上游的引物将随机结合在cDNA上 ,因此来自不 同ｍＲＮＡ的扩增产物的大小是不同的，可以在测序胶上明 显分辨开来，从而筛选出不同样品间基因差异表达的DNA片 段。
mRNA差别显示技术演示文稿
mRNA差别显示技术
主要内容
• 概述 • 定义及原理 • 应用及优缺点 • 展望
一. 概述
高等生物大约有3~5 万个不同的基因，在每一个正常的 体细胞中都含有相同的基因组拷贝，但在不同的组织细胞 中仅有10%~20%的少部分基因被选择性表达，这种选择性表 达是在发育过程中细胞分化的根本原因，是调控细胞生命 活动过程的核心机制。因此，比较不同组织之间，或相同 组织在不同生理条件下，或胚胎在不同的发育阶段的基因 表达差异，可分离并克隆出这些特异性表达的基因。近年 来，该领域的研究取得了很大进展， 扣除杂交 （subtractive hybridization, SH）、基因芯片技术 （DNA chip technique）、基因表达的系统分析(serial analysis of gene expression, SAGE)、噬菌体全套抗体 库技术(phage display antibody repertoire library technique)和双向电泳技术(two-dimensional gel electrophoresis)先后成功地建立。
Hale Waihona Puke 5’ T12MN(M为A、G、C， 5’ T12MN 3’
N为A、T、G、C) 锚定引物
5’
3‘
M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n 3’ Poly(A) RNA
水稻品种DNA指纹
基本原理
利用所有真核基因的mRNA 的3’端都有一段多聚 腺苷酸poly(A)尾结构的特点，将不同来源的总mRNA反 转录合成cDNA,此cDNA 合成是采用oligo(dT)12MN 为 引物，其中M为A,C,G中的任意一种，N为A,C,G 或T 中 的任意一种，共有12 种oligo(dT)12MN 引物，其中M 为锚定碱基可增大引物的Tm值，N 称为分类碱基，对 反转录进行分类。用这12 种引物分别对同一总mRNA 样品进行cDNA 合成，即进行12 次不同的反转录反应 ，得到12种类型的cDNA，从而也将总mRNA分为12 个亚 群。在此基础上对每一类cDNA进行随机引物和相应的 反转录引物PCR扩增，由于扩增的cDNA片段被放射性同 位素标记，因而利用放射自显影技术通过对不同组织 样品的同一类cDNA 的PCR 选择性扩增产物进行凝胶电 泳分析，从而反映出不同样品间基因的时间和空间上 的组织特异性的表达。
– 1）RT-PCR技术 – 2）以特定引物进行的PCR技术
– 3）DNA电泳技术
二.基本概念
mRNA差别显示技术也称为差示反 转录PCR（Differential Display of reverse Transcriptional PCR）简 称为ddRT-PCR。它是将mRNA反转录技 术与PCR技术二者相互结合发展起来 的一种RNA指纹图谱技术。目前已广 泛应用于分离鉴定组织特异性表达的 基因。