测序技术与基因组测序

第二代HT-NGS技术平台
目前， Roche，Illumina, SOLiD三种领先的第 二代HT-NGS技术(Fig. 1)在商业上已可应用，更 多有效的方法的开发速度也在不断加速。 2008年,美国国家人类基因组研究所(NHGRI)启动 资金来进行极具革命性的基因组测序技术项目， 旨在花费1000美元甚至更少来测序人类基因组。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
多重聚合酶技术
在这种技术中,几百个测序模板放置在薄层琼脂糖 面板上，序列被平行确定。这方法显示增加几个 数量级的样本数量,可以同时分析。它的优势是大 量减少反应体积,需要较少量的试剂和由此产生的 成本更低。 随着试剂体积的显著减少,单位体积成本低10倍, 该公司希望很快达到目标为每个基因组1000美元 。
SMRT™ 测序仪
SMRT测序仪的原理即通过由成千上万零级波导 组成的测序芯片上合成方法进行单分子实时测序 (ZMWs)。DNA片段的测序反应由单个DNA聚合 酶分子参与，该酶位于每个零模波导的底部，以 至于每个DNA聚合酶都存在于零级波导的可检测 区(Fig. 2)。
单分子实时测序仪(RNAP)
Heliscope™ 单分子测序仪
对单个DNA分子测序技术首次由 Braslavsky 于 2003年引入，并于2007年作为第一代商业单分子 DNA测序系统被生物科学所认可。 Heliscope测序仪的原理基于“准确的单分子测序 技术”（部生成的DNA片段（Ozsolak等 2010），然后与流通池内poli（T）的寡核苷酸的 DNA片段杂交，同时再平行反应测序。
不同的单分子DNA测序方法,即RNA聚合酶(RNAP), 已经被提出（Greenleaf and Block 2006）该方法中 RNA聚合酶被连接到一个聚苯乙烯珠，而DNA片段 的末端被连接到另一个珠。每个珠被放在光陷阱和一 对光陷阱悬浮珠。RNA聚合酶和DNA片段相互作用 ，转录沿着模板进行，改变两个珠子间DNA的长度。 这导致两个珠子间的位移可以在埃的精度范围内进行 标注，从而导致单碱基分辨率在单分子DNA水平上。 通过调整四个位移的记录，四种核苷酸之中每一个具 有较低浓度的一种，类似于用桑格测序中的引物和校 准使用已知序列的侧翼序列的未知片段，有可能推断 出序列信息。
实时单分子DNA测序平台 VisiGen生物技术开发
VisiGen生物技术()介绍了 一个特制的DNA聚合酶,它对于改性的核苷酸而言 相当于一个带有供体荧光染料的‘实时传感器’ ，当掺入合成时核苷酸与聚合酶活性位点结合 ( 图2)。所有参与合成的四种核苷酸被修改，每一 个都有不同的受体染料。在合成时,当正确的核苷 酸被发现,它被选择并进入酶的活性部位,供体染料 标记的聚合酶密切接近带有受体染料的核苷酸， 能量被从供体传递到受体染料产生升高的荧光共 振能量转移(FRET)光信号(Selvin 2000)。
HT-NGS技术的诞生
2000年,乔纳森· 罗思伯格创立了454生命科学公司, 该公司 进一步发展成为第一个商业化的有效的平台,即GS 20。该 仪器得以进一步发展成为为市场上第一代NGS系统。 在接下来的几年里,罗氏应用从454生命科学公司获得的技 术，并进一步拓展出454仪器的新类型,即GS FLX titanium。 斯德哥尔摩瑞典团队首次提出一种新的测序方法，该方法 基于在聚合酶介导的脱氧核糖核苷酸合成过程中释放的焦 磷酸盐的化学检测来进行测定 (Nyren et al. 1993, Nyren 2007)，并且可以通过对释放的焦磷酸盐的检测进行即时 测序 (Ronaghi et al. 1998)。 2007年HT-NGS技术被选为对哺乳动物基因组学研究有重 大影响的方法并开辟出新机遇 。
离子流测序技术
在最新的进展，第一PostLightTM测序技术（离子流 ）已经被介绍(/)。这种 技术创建了一个在化学和数字信息间的直接连接,支 持快速、简单、可大规模扩展的测序。它利用简单的 核酸沃森化学令人难以置信的强大的、专有的半导体 技术——摩尔定律(Moore 1965)。离子流原理半导体 技术是基于一个良好特征的生化过程，其中一个核苷 酸通过聚合酶掺入一条DNA链, 导致释放氢离子作为 一种副产品(图2)。例如,如果核苷酸A是添加到DNA 模板并掺入到一条DNA链，然后一个氢离子将被释放 。离子电荷会改变溶液的pH值,可以直接由没有扫描 、相机和光学设备的离子传感器检测到。
第三代HT-NGS技术平台
前面讨论的第二代HT-NGS技术，原理基于PCR扩增DNA 片段，进而使光信号足够强可用CCD照相机来进行碱基 检查。尽管PCR扩增已经彻底改变了DNA分析,但在某些 情况下它可能引起碱基序列的错误或支持某些序列长度过 长,从而在扩增前存在各种基因片段的相对频率和吸光度 发生改变。为了克服这个问题 并将其最终小型化到纳米 级水平及最小的可使用的生化药品，如果序列可以从单个 DNA分子直接测定,而不需要PCR扩增这将是可以实现的 ，并且其潜在的丰度水平的失真也是可以避免的。对单个 DNA分子进行测序这一技术现被称为“第三代HT-NGS技 术 (Schadt et al. 2010)。 掠过先前的扩增步骤边合成边 测序的理念目前是大多数公司所追求的。
2012-11-30
自2001年以来,当以毛细管电泳荧光标记的个体桑 格测序方法为基础的人类基因组测序技术的出现, 下一代测序平台的出现急剧增加了获得DNA序列 的速度,而成本比他们的前辈降低了几个数量级 ( 图3)。这是因为数据生成的基本机制已经发生了 根本性的变化,产生更多序列读取/仪器运行和显著 降低费用。图3说明了HT-NGS信息如何产生既增 强我们的知识又扩大了基因组在生物医学研究的 影响的结果(Mardis 2011)。
摘要：
在这篇综述中，我们描述了HT-NGS的重要特征 ，第一代DNA测序仪，HT-NGS的起源，第二代 HT-NGS平台，第三代HT-NGS平台：包括单分 子Heliscope，SMRT和RNAP测序仪，Nanopore ，Archon Genomics X PRIZE基金会，第二代和 第三代HT-NGS平台的比较，应用，进展和测序 技术对人类和动物基因组研究的未来前景。
测序技术及基因组测序
报告组成员：杜聪聪 韩 栋 余 轩 韩 东 汇 报 人： 韩 栋
摘要：
目前在人类和动物基因组学的研究领域，HT-NGS技术已 成为最热门的话题,与最复杂的基于Sanger方法的的毛细 管测序仪技术相比，它可以产生100倍以上甚至更多的数 据。随着高通量测序仪器的不断发展和现代生物信息学工 具的快速进步，仅用1000美元来进行个体基因组测序的预 定目标，在不久的将来似乎可以实现。自2005年以来的相 当短的时间范围内，HT-NGS技术正在通过染色质免疫沉 淀联合DNA微阵列（ChIP-chip）或测序（ChIP-seq）， RNA测序（RNA-seq），全基因组基因分型，全基因组结 构变异，基因组的从头装配和重装配，突变检测和载体筛 的测序和个体基因组学 而变革人类和动物基因组研究。
关键词：
基因组芯片技术 芯片测序技术 从头装配 高 通量新一代测序技术 个体基因组学 重测序技 术 RNA测序技术
引言
人类基因组草案的完成只是现代DNA测序时代的 开始。 成熟的HT-NGS技术在一定程度上满足我们预期 的高效测序和低花费需要，在哺乳动物基因组研 究中具有潜在的应用价值。 HT-NGS技术是当今基因组研究中最大的挑战之 一。 完全理解人类基因组变异的经济特征,对疾病的遗 传易感性 ,和药物反应的基因治疗将成为接下来 十年基因组学研究的核心目标。
iv) higher consensus accuracy to enable rare variant detection, v) small amounts of starting material (theoretically only a single molecule may be required for sequencing), vi) low cost, wheresequencing the human genome at high fold coverage for less than $1000 is now a reasonable goal for the community.
纳米孔DNA测序仪
这项技术是由研究通过各种人造纳米孔的DNA的 易位发展而来的。用纳米孔的DNA测序仪依赖于 通过一个纳米孔核苷酸电信号的转换，这是一个α溶血素孔隙用环糊精分子共价连接于核苷酸的结 合位点。这项技术的原理是基于当一个DNA分子 穿过纳米孔时离子电流的调制，从而揭示分子的 特征和参数（直径，长度和构象）（图2）。在测 序过程中离子电流通过被核苷酸堵塞的纳米孔径 ，即，先前被核酸外切酶从与环糊精相互作用的 DNA链裂解的。当前块这一时期对于每一个碱基 和DNA序列的确定是特有的(Astier etal. 2006; Rusk 2009)。
引言
2011年是人类基因组测序十周年纪念。在这十年期间， 基因组测序领域取得了惊人的成就：包括人类基因组的解 码，新时期人类基因组研究程序方面技术的大幅进步，针 对个性化基因的研究，稀有变异体的发现及其基因的研究 ，利用基因测序来了解基因序列对癌症、哺乳动物进化和 人口结构的影响等。 基因组学领域技术的不断进步使人类的视野和期望得以提 升，尤其是HT-NGS技术的广泛应用。 随着具有潜力的HT-NGS技术和组装方法的发展加快了新 型基因组被测定的速度。现在可以组装新的大型基因组, 一个很好的例子就是源于大熊猫中的基因的装配(Li et al. 2010b)，该新型基因组小片段序列的读取就利用了新一代 DNA测序技术。
2012-11-30
第二代和第三代HT-NGS平台的比较
the third HT-NGS technologies may offer the following advantages over second HT-NGS technologies: i) higher throughput, ii) faster turnaround time (e.g., sequencing metazoan genomes at high fold coverage in minutes), iii) longer read lengths to enhance de novo assembly and enable direct detection of haplotypes and even whole chromosome phasing,