454基因组测序技术
Illumina、454、ABI测序仪比较

Illumina 、454 、ABI 测序仪比较Illumina 测序仪Illumina 公司的新一代测序仪Genome Analyzer 最早由Solexa 公司研发,利用其专利核心技术“DNA 簇”和“可逆性末端终结(reversible terminator )”,实现自动化样本制备及基因组数百万个碱基大规模平行测序。
Illumina 公司于2007年花费6亿美金的巨资收购了Solexa ,就是为了促成Genome Analyzer 的商品化。
Genome Analyzer 作为新一代测序技术平台,具有高准确性,高通量,高灵敏度,和低运行成本等突出优势,可以同时完成传统基因组学研究(测序和注释)以及功能基因组学以及功能基因组学 (基因表达及调控,基因功能,蛋白/核酸相互作用)研究。
Genome Analyzer 自上市以来,已经为千人基因组计划立下了赫赫战功。
今年早期,荷兰科学家利用它首次绘出女性的基因组图谱。
而就在前两周,家利用它首次绘出女性的基因组图谱。
而就在前两周,《《Nature 》杂志上一连出现三个人类基因组图谱:炎黄一号-第一个亚洲人图谱;第一个癌症病人图谱;第一个非洲人图谱。
它们全是依赖Genome Analyzer 完成的。
哗,一下就来仨!这和第一个人类基因组图谱的13年形成了多么鲜明的对照。
根据去年底的数据,Genome Analyzer 已售出约200台,估计是市场占有率最广的。
前不久,华大基因再添置了12台,准备放在香港和深圳的实验室,至此华大基因已经有29台Genome Analyzer 。
而著名的麻省理工学院和哈佛大学Broad 研究院拥有47台Illumina 测序仪。
众多实验室之所以选择Illumina ,看中的无疑是Genome Analyzer 的高性价比。
上个月,Illumina 将Genome Analyzer II 升级到Genome Analyzer IIx ,距年底实现单次运行获得95 GB 数据的宏伟目标又近了一步。
第二代测序技术

SO、油包水PCR
SOLiD流程
3、含DNA模板P1磁珠的固定
SOLiD流程
4、SOLiD双碱基编码原理及测序流程
SOLiD流程
4、SOLiD双碱基编码原理及测序流程SOLD流程5. 数据分析原理
Polonator
第二代高通量测序技术简介
四大高通量测序平台
Solexa,454 (GS-FLX),
SOLiD和Polonator
测序原理
合成法测序(Sequencing by Synthesis) 连接法测序(Sequencing by Ligation)
454 (GS-FLX)
Roche:(2005,2007,2008) 原理:在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光 素酶和双磷酸酶的作用下,将每一个dNTP的 聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来, 通过检测化学发光信号的有无和强度,达到 实时检测DNA序列的目的。
Polonator流程
测序原理: Polonator系统高质量测序是一种以连接 反应进行DNA序列分析的技术,该系统采用 结合在磁珠上单分子DNA片段簇为测序模板, 以CY5、Texas Red、CY3、6-FAM四色荧 光标记的9碱基单链荧光探针混合物进行连续 的连接反应为基础,对扩增的DNA片段进行 大规模高通量测序。
454 (GS-FLX)流程
3、测序反应:携带DNA片段的磁珠被放入 PTP板中供测序反应使用。
454 (GS-FLX)流程
4、数据分析:GS FLX系统在10小时的运行 当中可获得100余万个读长,读取超过4-6亿 个碱基信息
Solexa-Illumina Genome Analyzer
至300-800bp间,经末端修复与特异性接头 连接等修饰后变性处理回收单链的DNA 。
新一代测序法简介

新一代测序法简介新一代测序方法是一种直接测序法,它既可以分析基因和DNA的组成(定性分析),也可以测定同一类型基因在表达过程中产生的数量(定量分析),以及不同类型基因或DNA 之间的差别所在(交叉对比分析)。
自2004年,454测序技术发展以来,已经出现的测序产品超过六种之多。
这些产品的技术特点见下表:产家名称产品技术特点优缺点化学反应测序方法误读率样品准备高通量程度Roche(454 Life Science) 焦磷酸标记的链反应焦磷酸基标记<1% 较复杂,需PCR 中等Illumina(Solexa)四色可逆终止码合成法1%—3% 较复杂,需PCR 中—高ABI(SOLID) 双色可逆终止码合成法1%—5% 较复杂,需PCR 中—高Helicos Bioscience 单色可逆终止码合成法2%—8% 简单,无需PCR 高—超高Intelligent Biosystm 四色可逆终止码合成法1%—5% 较复杂,需PCR 中—高Pacific Bioscience 四色焦磷酸基标记焦磷酸基标记3%—8% 简单,无需PCR 高VisiGen 焦磷酸基标记FRET 焦磷酸基标记3%—8% 简单,无需PCR 高在这些技术中,从所分析的样本在测序前是否需要扩增,大致可以分为两类,即克隆扩增型和单分子测序型。
两种类型在测序技术上区别并不大,但对结果的影响却有不小的差别。
主要体现在两个方面:(1)单分子测序更能反应细胞或组织内分子的真实情况,尤其是在需要定量分析的情况下。
而克隆扩增型中的PCR反应使得样品中DNA分子的扩增机会并不完全均等,这会对基因表达的定量分析造成影响;(2)单分子测序具有通量更高的优势。
克隆扩增使得同一类型的分子数目急剧上升,在提高同类型分在在固相表面出现的几率同时,也降低了不同类型分子出现的机会。
面重点介绍Pacific Biosciences公司推出的Single Molecule Real Time (SMRT™) DNA Sequencing(单分子实时DNA测序)。
454测序技术基本原理

454测序技术基本原理454测序技术是一种基于DNA串联式测序的高通量测序技术。
该技术利用PCR扩增的方式将DNA分子固定在微球上,然后将这些微球均匀地分散在pico流水仪上,通过单个核苷酸连续测序的方式得到DNA序列信息。
本文将从实验步骤、原理和优缺点三个方面阐述454测序技术的基本原理。
实验步骤1、DNA提取测序前需要从样品中提取目标DNA物质。
对于不同的样品,提取方法不同,通常采用化学试剂、机械破碎或针刺取等方法提取DNA。
2、PCR扩增PCR扩增是将DNA序列按照一定的温度循环条件进行复制的过程。
PCR扩增由若干次循环组成,通常可分为三步:a) 熔解(Denaturation):高温(95℃~98℃)使DNA双链分离成两个单链,形成单链DNA模板。
b) 合成(Annealing):温度回降(50℃~70℃),引物结合到单链DNA上,形成DNA 双链结构。
c) 延伸(Extension):DNA聚合酶将双链DNA沿模板链向3'端延伸合成新的DNA链。
PCR扩增反应得到的DNA产物可分为两种类型:大量扩增的目标DNA和微球放置板上随机捕获的非模板DNA。
3、微球固定4、测序反应测序反应通过单个核苷酸的连续探测,对目标DNA序列进行识别和测序。
精细的光学和声学系统检测每次核苷酸加入后发出的光信号,然后排除错误数据并将相邻的场景、质量和信号强度合并以产生最终测序可靠的序列。
原理1、基于串联式测序在测序反应中,每个核苷酸单元依次加入为该反应产物的单一串联链的一部分。
这种串联式测序方式将初步测序的精度扩展到所有测序反应产物的终端序列。
2、基于荧光原理测序反应中每个核苷酸单元的加入和检测均通过荧光技术实现。
特殊荧光分子被加入到产物反应液中,随着核苷酸单元的加入和反应的进行,每个反应产生的荧光信号与特定的核苷酸单元有关。
3、基于高通量454测序技术结合了反应批处理和DNA克隆,大大增加了读取的序列数量。
基因组测序方法和流程

基因组测序方法和流程基因组测序是一种重要的分子生物学技术,用来确定生物个体的全基因组序列。
下面将介绍几种常见的基因组测序方法和其流程。
Sanger测序方法Sanger测序是最早被广泛应用的测序方法之一。
它通过DNA链终止反应来测定DNA序列。
Sanger测序的流程如下:1. DNA片段的扩增:通过聚合酶链反应(PCR)或其他扩增方法,将待测序的DNA片段扩增。
2. 序列反应:将DNA片段与DNA聚合酶、起始引物和四种特殊的二进制核苷酸(即各种类型的氮碱基)一起反应,使DNA聚合酶在复制DNA过程中停止。
这些停止的位置代表了DNA序列中的不同碱基。
3. 凝胶电泳:将反应产物经过凝胶电泳分离,根据酶在不同位置停止的情况,可以逐个测定DNA序列。
454测序方法454测序是一种高通量测序技术,利用酶依赖法合成技术进行测序。
其流程如下:1. DNA片段的制备:将待测序的DNA片段通过PCR扩增,得到大量的DNA片段。
2. 测序反应:将DNA片段与特殊的引物和酶(即磷酸巯基核苷酸转化酶)一起反应,使每个DNA片段在酶的作用下合成一链自由的DNA。
3. 测序仪读取信号:将反应产物加载至测序仪中,通过光学信号或电信号读取DNA合成时释放的磷酸巯基核苷酸的数目和位置,从而确定DNA序列。
Illumina测序方法Illumina测序是当前最常用的高通量测序技术之一。
其流程如下:1. DNA片段的制备:将待测序的DNA片段通过PCR扩增,得到大量的DNA片段。
2. 测序反应:将DNA片段和两种特殊的引物一起反应,引物与DNA片段的一端连接,形成桥式PCR产物。
然后,引物依次结合并延伸DNA链,生成补充DNA链。
3. 测序仪读取信号:将反应产物加载至测序仪中,通过荧光信号的强度和位置来确定DNA序列。
测序方法是一种基于单分子实时测序技术的测序方法。
其流程如下:1. DNA片段的制备:将待测序的DNA片段通过PCR扩增,得到大量的DNA片段。
微生物基因组测序技术及其应用

微生物基因组测序技术及其应用随着科技进步,微生物基因组测序技术在医学、环境、农业等领域受到广泛关注和应用。
本文将简要介绍微生物基因组测序技术的基本原理和应用场景,以及未来的发展方向。
一、微生物基因组测序技术的基本原理微生物基因组测序技术是指将微生物DNA分子逐一排列,从而得到一条由ATCG四种碱基构成的“基因序列”。
这种技术的基本原理是将DNA从细胞中分离出来,通过PCR扩增等方法得到大量的DNA片段,然后用高通量测序仪对这些DNA片段进行测序,最后将这些片段拼接得到完整的基因组序列。
目前,微生物基因组测序技术主要分为三种方法:Sanger测序技术、454逆转录聚合酶链反应测序技术和Illumina测序技术。
其中,Illumina测序技术是目前最常用的基因组测序方法之一。
二、微生物基因组测序技术的应用场景1.医学应用微生物基因组测序技术被广泛应用于临床诊断中。
如何对感染病原体进行准确快速的鉴定,是临床医生面临的一项困难。
传统的菌落培养法不仅时间长,而且不能鉴定细菌的种系,因此不能满足对临床诊断的要求。
微生物基因组测序技术可以直接从感染部位分离出细菌DNA,进行基因组测序后,通过对基因组序列的比对,快速高效地鉴定病原菌种类以及其耐药性。
同时,该技术还被应用于研究小肠细菌群的变化,对于小肠细菌感染和肠道菌群失调的诱因和机制的研究有着重要的作用。
而在抗生素的研究和开发中,微生物基因组测序技术也发挥着越来越重要的作用。
2.环境应用微生物基因组测序技术的应用不仅局限于医疗领域,也被广泛应用于环境监测领域。
通过微生物基因组测序技术,可以对环境中微生物丰度、多样性和功能进行高通量测定,揭示微生物群落结构和功能特征。
例如,饮用水中的微生物群落结构和数量分布对水质安全和人体健康有着至关重要的作用。
通过微生物基因组测序技术,可以对水中的细菌、病毒和病原真菌等微生物进行定量和定性分析,为水质监测提供有效的手段。
3.农业应用微生物基因组测序技术在农业领域的应用也越来越广泛。
454测序原理

454测序原理
454测序原理是一种被广泛应用于基因组学研究的高通量测序技术。
其原理基于荧光化学发光和低密度DNA固相扩增的方法,能够以高通量的方式快速获取大量的基因组信息。
首先,将待测DNA样品进行首次扩增,得到大量的单链DNA模板。
然后,将这些单链DNA模板固定在微小的玻璃球上,每个玻璃球上只有一个DNA模板。
之后,这些玻璃球会被封装在一个水油混合液中的微小水滴中,每个水滴中通常只有三个玻璃球。
接下来,这些水滴会被密封在一片透明的PicoTiterPlate™中,并在一组具有不同碱基的草酸序列上进行串联测序,这些草酸序列会与模板DNA上的碱基进行互补配对。
然后,454测序仪会从PicoTiterPlate™中释放出草酸序列,当这些草酸序列与模板DNA上的碱基配对时,会释放出一定量的能量。
这些能量会被测序仪检测到,并将其转化成可视化的荧光信号。
最后,经过相应的图像处理和数据分析,就可以得到原始的测序数据。
根据荧光信号的强度和先后顺序,可以确定每个DNA模板上的碱基序列。
总结来说,454测序原理基于荧光化学发光和低密度DNA固相扩增的方法,通过测量荧光信号的强度和先后顺序,快速获
得DNA模板的碱基序列信息。
这种技术具有高通量、高准确性和高灵敏度等特点,在基因组学领域有着广泛的应用。
下一代测序技术名词解释

下一代测序技术名词解释下一代测序技术(Next Generation Sequencing,NGS)是一种高通量测序技术,能够同时对大量的DNA或RNA进行测序。
相比传统的测序技术,下一代测序技术具有更高的测序速度、更低的成本以及更强的分辨能力。
以下是一些常见的下一代测序技术名词解释:1. Illumina测序(Illumina Sequencing):Illumina公司开发的一种基于桥式扩增(Bridge Amplification)的测序技术。
它通过光反应和荧光检测原理,将DNA片段扩增成固定桥结构,再通过碱基逐个加入的方式进行测序。
2. 454测序(454 Sequencing):Roche Diagnostics公司开发的一种基于聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)和微滴化技术的测序技术。
它通过将DNA片段扩增成微滴并进行逐个碱基加入的方式进行测序。
3. Ion Torrent测序(Ion Torrent Sequencing):Ion Torrent Systems公司开发的一种基于核苷酸测序的技术。
它通过检测DNA串联上新生链中释放的质子来确定DNA序列。
4. PacBio测序(Pacific Biosciences Sequencing):Pacific Biosciences公司开发的一种基于DNA聚合酶反应的测序技术。
它利用单分子实时测序原理,通过测量聚合酶在 DNA模板上运动的时间来确定序列。
5. Nanopore测序(Nanopore Sequencing):Oxford Nanopore Technologies公司开发的一种基于纳米孔技术的测序技术。
它通过电流信号检测DNA/RNA分子通过纳米孔时的不同电流变化,从而实现对序列的测定。
这些下一代测序技术在基因组学、转录组学、表观遗传学等领域中广泛应用,对于生物医学研究、疾病诊断和个体化医疗等方面具有重要意义。
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工作流程
五.测序 携带DNA的捕获磁珠(20um)随后放入 PTP板(Pico TiterPlate)的微孔(29um)中 Pico TiterPlate) 进行后继的测序反应。此反应释放出的光信号 实时被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到。有 一个碱基和测序模板进行配对,就会捕获到一 分子的光信号。由此一一对应,就可以准确、 快速地确定待测模板的碱基序列。
工作流程
六.数据分析 454测序系统可以在10小时的运行当中获 得100多万个读长,读取超过4-6亿个碱基信 息。并提供两种不同的生物信息学工具对测序 数据进行分析,适用于不同的应用:达400 MB的从头拼接和任何大小基因组的重测序。
454测序系统图示 454测序系统图示
A为液体试剂供应装置 B为反应池 C为光线检测成像系统和计算机 控制系统
工作流程
三一个磁珠携带样就形成了只包 含一个磁珠和一个独特片段的微反应器。
工作流程
四.乳液PCR扩增 每个独特的片段在自己的微反应器里进行 独立的扩增,而没有其他增后产生了几百万个 相同的拷贝。随后,乳液混合物被打破,扩增 的片段仍然结合在磁珠上。
测序原理
经乳液PCR法扩增后携带有大量模板的磁珠被 放置到芯片上的微孔中。随后使用焦磷酸法测序, 每一轮反应都会掺入一个核苷酸,同时释放一个焦 磷酸,然后焦磷酸和腺苷酰硫酸在磷酸化酶的催化 下生成ATP,然后荧光素酶就可以在ATP参与下将 荧光素转化为氧化荧光素,同时发出荧光被检测器 检测到。
工流程
新一代测序技术
—— 454基因组测序技术
报告人:钱龙 组员:郭斌 邓娟 梁敏 高婷婷 专业:生物化学与分子生物学
背景介绍
DNA测序技术经历了漫长而曲折的发展历程,它已广泛应 用于生物学研究的各个领域,很多生物学问题都可以借助高通 量DNA测序技术予以解决。 迄今为止,我们获得的绝大部分DNA序列都是基于 Sanger测序法获得的。但在过去几年,大规模平行测序平台 (massively parallel DNA sequencing platform massively platform)已经发展为 主流的测序技术,这项测序技术的出现不仅令DNA测序费用降 到了以前的百分之一,还让基因组测序这项以前专属于大型测 序中心的“特权”能够被众多研究人员分享。目前,新的测序技 术及手段还在不断涌现,比如最新的进展就包括建立序列数据 库、建立序列数据分析新方法以及设计测序试验等等。 新一代DNA测序技术有助于人们以更低廉的价格,更全 面、更深入地分析基因组、转录组及蛋片制备
焦磷酸测序
加入含酶小微珠
工作流程
一.样品输入并片段化 大的样品例如基因组DNA或者BAC等被 打断成300-800 bp的片段;对于小分子的非 编码RNA或者PCR扩增产物,这一步A 和B接头(3’和5’端具有特异性)连接到DNA 片段上。接头也将用于后续的纯化,扩增和测 序步骤。具枪Sanger 测序法策略
图b为鸟枪循环芯片测序法 策略
测序原理
在体外构建好的两端带接头的单链DNA在 一个油包水的乳液环境中进行PCR扩增,因为起始 阶段模板浓度非常低,因此,大部分包还有磁珠的 为乳液滴都只含有一种模板,经PCR扩增后,每个 磁珠只连有一种模板的扩增产物,然后打破为乳液 滴,收集磁珠,加入芯片中。
测序策略
454基因组测序使用了一种新的测序策略——循 环芯片测序法(cyclic-array sequencing),也可将 其称为“新一代测序技术或者第二代测序技术”。 所谓循环芯片测序法,简言之就是对布满DNA DNA 样品的芯片重复进行基于DNA的聚合酶反应(模板 变性、引物退火杂交及延伸)以及荧光序列读取反 应。 与传统测序法相比,循环芯片测序法具有操作 更简易、费用更低廉的优势,于是很快就获得了广 泛的应用。
测序质量
454测序技术的准确率在99%以上。其主 要限制来自同聚物,也就是相同碱基的连续掺 入,如AAA或GGG。由于没有终止元件来阻 止单个循环的连续掺入,同聚物的长度就需要 从信号强度中推断出来。这个过程就可能产生 误差。因此,454测序平台的主要错误类型是 插入-缺失。
总结
454测序结果的数据质量高,且分析简单 。其多种多样的应用彰显出它强大的能力,那 些传统意义上无法用测序来解决的问题现在也 可以一并解决了。超长读长与易用的分析工具 相结合,让研究人员能更集中精力于科学研究 ,而不是研究测序过程中的某个技术细节。这 样研究项目能快速完成,接着踏上新的研究道 路。
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