北京化工大学仪器分析第三章高效液相色谱
北京化工大学仪器分析第三章高效液相色谱精品文档
检测器
用来连续监测经色谱柱分离后的流出物 的组成和含量变化的装置。
紫外-可见检测器 荧光检测器 电化学检测器 蒸发光散射检测器 质谱检测器
紫外-可见检测器
单波长UV检测器，光源用Hg灯，加滤光 片 可 以 到 254 ， 280 ， 313 ， 334 ， 365 等 。 生化中用到很多。
多波长 光度计类似，光栅或棱镜分光
残留农药和兽药是食品中主要的污染物 世界上许多国家制定并实施食品安全法规，但是
在美国、加拿大、欧盟以及日本食品安全法规更 加严格的完善。 在食品和农产品国际贸易中，残留农药和兽药的 检测中非常苛刻的。
食品中残留检测
农产品 - 谷物：大米等 - 豆类：大豆、豌豆等。 - 水果：橘柑，苹果，葡萄等。 - 蔬菜：洋白菜（甘蓝）、菠菜等 - 茶叶，种子，蜂蜜等。
全多孔型担体 薄壳型微珠担体
固定相 --- 化学键合
R --- 极性基团 疏水基团 离子交换基团
Si OO
Si
HCO S l iOC HS l i3 ()2 C RHO SiOSi3 ()2 C RH
O
SiOH
SiOSi3 ()2 C RH
固定相的化学构造
非键合相表面
键合相表面
ODC
C18
C8
C1 Phenyl
样品的分析实例
食品 啤酒，清酒，葡萄酒，酱油等
体液 血清，尿等
医药品 肾的透析液，钙制剂等
发酵 微生物培养液，酸奶等
环境 工厂废水等
有机酸标准品的色谱图1
一个分析柱
1. 磷酸 2. 柠檬酸 3. 丙酮酸 4. 苹果酸 5. 琥珀酸 6. 乳酸 7. 甲酸 8. 乙酸 9. 乙酰丙酸 10. 焦谷氨酸
《仪器分析》高效液相色谱法
《仪器分析》高效液相色谱法仪器分析是化学分析中的重要分支，是利用各种仪器设备对样品进行分析、测定和监控的科学方法。
高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）作为仪器分析中的一种常用方法，具有快速、高效、灵敏度高等特点，在许多领域得到广泛应用。
高效液相色谱法是基于液相色谱原理发展起来的一种方法，其主要原理是利用色谱柱对样品中的化合物进行分离，再通过检测器对各个化合物进行定量测定。
高效液相色谱法相比传统的液相色谱法，具有流动相流速快、柱温控制稳定、色谱柱填充剂的粒径更小等优点，从而使样品得到更高的分离效果和更好的分辨率。
高效液相色谱法可以应用于多种不同类型的样品分析，例如药物分析、环境分析、食品安全监测等。
以药物分析为例，在药物研发和质量控制中，高效液相色谱法可以用于分析药物的纯度、含量和杂质等指标，从而保证药品的质量和安全性。
而在环境分析方面，高效液相色谱法可以用于检测水、土壤和空气中的有机污染物，为环境保护提供科学依据。
此外，高效液相色谱法还可以用于食品安全监测，检测食品中的农药残留和添加剂等有害物质，保障人民群众的身体健康。
高效液相色谱法的操作相对简单，但是在实际应用中也需要注意一些技巧和注意事项。
首先，需要选择合适的色谱柱和填充剂。
不同的分析目标和样品类型需要选择不同的色谱柱和填充剂，以获得最佳的分离效果和分辨率。
其次，需要合理选择流动相的组成和流速。
流动相的组成和流速会直接影响样品的分离效果和检测结果，因此需要经过调试和优化。
最后，还需要进行准确的定量分析。
在高效液相色谱法中，常用的定量方法包括外标法、内标法和标准曲线法等，可以根据实际情况选择合适的方法进行定量分析。
综上所述，高效液相色谱法是一种快速、高效、灵敏度高的仪器分析方法，具有广泛的应用领域和潜力。
在实际应用中，需要根据具体的分析目标和样品类型选择合适的色谱柱和填充剂，合理选择流动相的组成和流速，并进行准确的定量分析。
北京化工大学仪器分析答案之色谱-3
液相色谱1.在GC和LC中, 影响柱选择性的不同的因素是CA.固定相的种类；B. 柱温；C．流动相的种类；D．分配比。
2.在液相色谱中, 范氏方程中的哪项对柱效能的影响可以忽略不计?B A．涡流扩散项；B．分子扩散项；C．固定相传质阻力项；D．流动相中的传质阻力。
3.在液相色谱中, 某组分的保留值大小实际反映了哪些部分的分子间作用力？CA．组分与流动相；B．组分与固定相；C．组分与流动相和固定相；D．组分与组分。
4.在液-固色谱法中, 以硅胶为固定相, 对以下四组分, 最后流出色谱柱的组分可能是DA.苯酚；B. 苯胺；C．邻羟基苯胺；D．对羟基苯胺。
5. 用液相色谱法分离长链饱和烷烃的混合物, 应采用下述哪一种检测器? BA．紫外吸收检测器；B．示差折光检测器；C．荧光检测器； D．电导检测器。
6.液－液色谱法中的反相液相色谱法，其固定相、流动相和分离化合物的性质分别为：AA．非极性、极性和非极性；B．极性、非极性和非极性；C．极性、非极性和极性；D．非极性、极性和离子化合物。
7. 在液相色谱中。
常用作固定相，又可用作键合相基体的物质是BA. 分子筛B. 硅胶C. 氧化铝D. 活性炭。
8.在液相色谱中，梯度洗脱最宜于分离：DA．几何异构体；B．沸点相近，官能团相同的试样；C．沸点相差大的试样；D．分配比变化范围宽的试样。
9.液－液色谱法中的正相液相色谱法，其固定相、流动相和分离化合物的性质分别为：CA. 非极性、极性和非极性；B. 极性、非极性和非极性；C. 极性、非极性和极性；D. 非极性、极性和离子化合物。
10.下面那个不属于选择性检测器：BA．紫外吸收检测器；B．示差折光检测器；C．荧光检测器； D．电导检测器。
1. 高效液相色谱是如何实现高效、快速、灵敏的？解：气相色谱理论和技术上的成就为液相色谱的发展创造条件，从它的高效、高速和高灵敏度得到启发，采用5-10μm微粒固定相以提高柱效，采用高压泵加快液体流动相的流速；设计高灵敏度、死体积小的紫外、荧光等检测器，提高检测灵敏度，克服经典液相色谱的缺点，从而达到高效、快速、灵敏。
仪器分析第三章 高效液相色谱分析
2019/2/28
2、HPLC与GC的区别
• 分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物， 而这些物质只点有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点、高 分子量、热稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%。 • 流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体， 只起运载作用，和组分之间没有相互的作用力；HPLC采用的流 动相为各种极性不同的液体或液体的混合，可供选择的机会多。 它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作 用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和 改进分离。 • 操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。
2.主要部件
(1) 高压输液系统（储液器、高压泵、过滤器） 高压泵
为了获得高柱效， HPLC 使用粒度很小的固定相（ <10 μm），液体 流经色谱柱受到的阻力大 应具有流量稳定、压力平稳无脉动等特性。 分为恒流泵、恒压泵，各有优缺点。目前恒流泵逐渐取代恒压泵。
2019/2/28
梯度洗提装置（P84）
2019/2/28
3. 流动相选择
在选择流动相时，溶剂的极性是选择的重要依据。 例：采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分 的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。 常用溶剂的极性顺序：水(最大) > 甲酰胺> 乙腈> 甲醇> 乙醇> 丙 醇> 丙酮> 二氧六环> 四氢呋喃> 甲乙酮> 正丁醇> 乙酸乙酯> 乙醚> 异丙醚> 二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己 烷>煤油(最小) 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性 或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。
仪器分析高效液相色谱法
仪器分析高效液相色谱法高效液相色谱法（HPLC）是一种常用的仪器分析方法，广泛应用于化学、药学、环境科学、食品科学等领域。
本文将介绍HPLC的原理、仪器组成、操作步骤以及应用领域。
HPLC的原理是利用样品在液态流动条件下在固定相上的分配行为进行分离和定量分析。
相比于传统的色谱法，HPLC具有操作简便、分离效果好、灵敏度高等优点。
HPLC的仪器组成主要包括溶液配制系统、进样系统、柱温控制系统、分离柱、检测器和数据处理系统。
其中，溶液配制系统主要用于调配流动相，进样系统用于将样品注入分离柱，柱温控制系统用于控制柱温度，分离柱用于实现样品的分离，检测器用于检测样品，数据处理系统用于处理和分析检测结果。
HPLC的操作步骤如下：1.首先，需要根据需要选择合适的固定相和流动相，然后将固定相充填到分离柱中。
2.将样品溶解于合适的溶剂中，并按照一定的稀释比例稀释溶液。
3.将稀释后的溶液注入进样器中。
4.打开柱温控制系统，设置合适的柱温。
柱温的选择应考虑到样品的性质以及分离柱的要求。
5.打开溶液配制系统，调配合适的流动相，并将流动相以一定的流速通过分离柱。
6.启动检测器，并设置适当的检测波长和灵敏度，以便对样品进行检测。
7.数据处理系统会自动记录检测结果，并进行相应的数据处理和分析。
HPLC广泛应用于化学、药学、环境科学、食品科学等领域，常见的应用包括药物分析、环境污染物检测、食品成分分析等。
例如，可以利用HPLC对药物中的成分进行分离并进行定量分析，以保证药物的质量和疗效。
在环境科学中，HPLC可以用于检测空气、水体和土壤中的有机污染物。
在食品科学中，HPLC可以用于检测食品中的残留农药、添加剂和重金属等。
总之，HPLC是一种常用的高效仪器分析方法，通过流动相在固定相上的分配行为实现样品的分离和定量分析。
由于其操作简便、分离效果好、灵敏度高等优点，成为化学、药学、环境科学、食品科学等领域中不可或缺的分析工具。
高效液相色谱法教程
由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。这类固定相由于颗
全多孔型固定相
粒很细（5~10m），孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析。 二、流动相 由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲合力，并参与固定相对组分的竞争，因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是： （1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选 择性。 （2）溶剂与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选 用检测器波长比溶剂的紫外截止波长 要长。所谓溶剂
第二节 高效液相色谱仪
梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，来调整混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通过色谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质k值的变化是通过溶质的极性、pH值和离子强度来实现的，而不是借改变温度（温度程序）来达到。
第三节 高效液相色谱的固定相 和流动相
的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时， 溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不 透明的，它严重干扰组分的吸收测量。 对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较 大差别的溶剂作流动相，以达到最高灵敏度。 （3）高纯度 由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也 要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪 峰”。
固定相
高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类。 刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.0108~1.0109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。 硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5108Pa。固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相
仪器分析(第3章高效液相色谱分析)教材
三、应用范围
气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。
对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型 化合物及高聚物的分离、分析较为困难。致使其应用受到一 定程度的限制，据统计只有大约20%的有机物能用气相色谱 分析；而液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制，它 非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、 离子型化合物及高聚物的分离分析，大约占有机物的70 80%。 。
式中C m是与k (容量因子）函数。 d m固定相的粒度。 D m试样分子在流动相中的 扩散系数。u流动相线速度 .
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ii.滞留的流动相中的传质阻力项Hsm 由于固定相的多孔性能使流动相滞留在其微孔内，微孔内 的流动相称为滞留区流动相（静止状态，不流动）。当流动 相中的试样分子与固定相进行质量交换时，必须先从流动相 扩散进入到滞留区。如果固定相中微孔既小又深，则滞留就 越严重，传质就越慢，对峰扩展影响也越大。 2 Cs m d p H sm u (3 4) Dm
(第五讲）
仪器分析教程
内容提要
1 高效液相色谱法的特点 2 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素 3 高效液相色谱法的主要类型及其分离原理 4 液相色谱法的固定相 5 液相色谱法流动相 6 高效液相色谱仪 7 高效液相色谱分离类型的选择 8 高效液相色谱法应用实例 9 液相制备色谱 10 毛细管电泳
仪器分析教程
因此，高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不 需要气化，不受试样挥发性的限制。
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§3.2影响色谱峰扩展及色谱分离的因素 • 与GC 比较65/1；基本概念及理论基础与GC一致； 主要区别：流动相不同. 影响的因素：柱内展宽和柱外展宽。 一、柱内展宽 1.涡流扩散项 ： He = 2λdp λ:填充不均匀因子；dp填充粒度直径 高效液相色谱法的固定相是高效填料，其颗粒直 径比气相色谱法更小；且装柱多采用匀浆法装柱， 填充很均匀， λ变得很小，所以He值比较小。
高效液相色谱法—高效液相色谱仪(仪器分析课件)
• 内梯度：利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定比例送入梯度混 合室，混合后进入色谱柱。
• 外梯度：一台高压泵，通过比例调节阀，将两种或多种不同极性的溶剂按一定 的比例抽入高压泵中混合。
柱子内径一般为1～6 mm。常用的标准柱型是内径为4.6或 3.9 mm ，长度为15～30 cm 的直形不锈钢柱。填料颗粒度5 ～10 μm ，柱效以理论塔板数计大约 7000～10000。
发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
（三）检测器 1. 紫外吸收检测器 紫外吸收检测器是目前HPLC中应用最广泛的检测器。 2. 光电二极管阵列检测器（PDAD） 3. 示差折光检测器（DRD） 4. 电导检测器 5. 荧光检测器 6. 蒸发激光散射检测器
HPLC
HPLC
高效液相色谱仪 一、高效液相色谱仪工作流程及组成
• 1.高效液相色谱仪的工作流程图
一、高效液相色谱仪工作流程及组成 流 动 相
高压泵
2.高效液相色谱仪组成
脱气装置
进 样 阀
色 谱 柱
检测器
检测器
二、仪器操作 （一）开机前 的准备
• 在开机前应详细阅读 仪器使用说明书，了 解仪器的参数、熟悉 仪器操作规程。
高压输液泵
3.. 梯度洗脱装置
高压梯度： 用于二元梯 度，用两个泵分别按设定 的比例输送A和B两溶液 至混合器
（二）进样装置 常见的 进样装置有： 1.隔膜进样 2.停留进样 3.六通进样 4.自动进样
（三）色谱分离系统
色谱柱是色谱仪最重要的部件（心脏）。通常用后壁玻璃 管或内壁抛光的不锈钢管制作的，对于一些有腐蚀性的样 品且要求耐高压时，可用铜管、铝管或聚四氟乙烯管。
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荧光检测器
许多有机化合物，特别是芳香族化合物、 被一定强度和波长的紫外光照射后，发射出较 激发光波长要长的荧光。但可以与发荧光物质 反应衍生化后检测。
特点： 有非常高的灵敏度和良好的选择性，灵 敏度要比紫外检测法高23个数量级，特别适合 于药物和生物化学样品的分析。
高效液相色谱仪
流动液贮存提供脱气 输液泵 进样系统 分离系统 检测系统 控制与记录系统
日本岛津公司
美国Waters公司
流动相脱气方法
（1）真空泵抽滤系统 （2）低溶性惰性气体导入替换 （3）超声脱气 （4）在线脱气
输液系统
高压输液泵： 高压输液泵是液相色谱仪的关键部 件，其作用是将流动相以稳定的流 速或压力输送到色谱系统。 输液泵的稳定性直接关系到分析结 果的重复性和准确性。
O
SiOH
SiOSi3 ()2 C RH
固定相的化学构造
非键合相表面
键合相表面
ODC
C18
C8
C1 Phenyl
-NH2
-CN
OH
OH
正相HPLC（normal phase HPLC）：
是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动相所 组成的HPLC体系。其代表性的固定相是改性硅胶、氰 基柱等，代表性的流动相是正己烷。吸附色谱也属正 相HPLC。
反相HPLC（reversed phase HPLC）：
由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱 体系，与正相HPLC体系正好相反。其代表性的固定相 是十八烷基键合硅胶(ODS柱），代表性的流动相是甲 醇和乙腈。是当今液相色谱的最主要分离模式。
ODS（Octa Decyltrichloro Silane)
检测器
用来连续监测经色谱柱分离后的流出物 的组成和含量变化的装置。
紫外-可见检测器 荧光检测器 电化学检测器 蒸发光散射检测器 质谱检测器
紫外-可见检测器
❖ 单波长UV检测器，光源用Hg灯，加滤光 片 可 以 到 254 ， 280 ， 313 ， 334 ， 365 等 。 生化中用到很多。
❖ 多波长 光度计类似，光栅或棱镜分光
活塞泵 注ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ泵 气动泵
进样系统
不使整个压力变 化的情况下将样品 注入色谱柱，通常 使用所谓六通阀
进样系统
不使整个压力变化的情况下将样品注入色谱柱， 通常使用所谓六通阀
色谱柱
色谱柱
泵 1
进 样
泵 2
色谱柱
色谱柱是实现分离的核心部件，要求柱效高、 柱容量大和性能稳定。柱性能与柱结构、填料 特性、填充质量和使用条件有关。
荧光检测器结构示意图
检测器
光源
滤光片
检测室
蒸发光散射检测器
蒸发光散射检测器适合于无紫外吸收、无 电活性和不发荧光的样品的检测。
电化学检测器 （以电导检测器为例）
电极 电极
电导仪
定性分析
标准样品法 谱库
HPLC-FTIR HPLC-MS
定量分析
峰面积∝浓度或质量
小结
四种色谱分离模式的分离机理及应用范围 反相色谱的概念 常用的固定相和流动相 紫外可见检测器
啤酒的色谱图
1. 磷酸 2. 柠檬酸 3. 丙酮酸 4. 苹果酸 5. 琥珀酸 6. 乳酸 7. 甲酸 8. 乙酸 9. 焦谷氨酸 10. 碳酸
分配色谱–分离原理
不同组分在两相间分配系数不同
分配色谱固定相
固定相 --- 物理吸附 （担体 + 固定液）
全多孔型担体 薄壳型微珠担体
固定相 --- 化学键合
R --- 极性基团 疏水基团 离子交换基团
Si OO
Si
HCO S l iOC HS l i3 ()2 C RHO SiOSi3 ()2 C RH
样品的分析实例
食品 啤酒，清酒，葡萄酒，酱油等
体液 血清，尿等
医药品 肾的透析液，钙制剂等
发酵 微生物培养液，酸奶等
环境 工厂废水等
有机酸标准品的色谱图1
一个分析柱
1. 磷酸 2. 柠檬酸 3. 丙酮酸 4. 苹果酸 5. 琥珀酸 6. 乳酸 7. 甲酸 8. 乙酸 9. 乙酰丙酸 10. 焦谷氨酸
排阻色谱固定相
1. 软凝胶：铰链葡萄糖的多孔聚合物， 聚丙烯酰胺凝胶。（凝胶过滤色谱）
2. 半硬凝胶：聚苯乙烯珠（凝胶渗透色谱）
3. 高硬凝胶和玻璃：多孔玻璃或多孔硅球， 经化学键合处理，不随压力及溶剂改变 尺寸，（高效排阻色 谱）
应用
高分子化合物分子量及分子量分布 DNA碎片不同碱基支链分离。
离子交换色谱
分离原理
各种离子根据它们与树脂上的交换
基团的交换能力的不同而得到分离。
固定相
固定相为离子交换树脂， 流动相为无机酸或无机碱 的水溶液。
分离对象 离子或可离解的化合物
（无机离子、氨基酸、蛋白质等）
排阻色谱法
(凝胶色谱法)
分离原理 根据样品分子尺寸大小分离
大分子不能进入多孔中，不被保留，随 Vm流出 中分子部分进入多孔中，一般保留 小分子完全进入多孔中，长时间保留。
×300mmL.) 1个或2个分析柱连接 保护柱 SCR-102H (6mmI.D.×50mmL.)
流动相：5mM p-甲苯亚磺酸水溶液 流量 ：0.8mL/min 温度 ：40℃或45℃
检测条件
缓冲液：20mM Bis-tris 水溶液
含 5mM p-甲苯亚磺酸和100μＭ EDTA 流量 ：0.8mL/min 检测器：电导检测器 polarity;+
高效液相色谱法的类型
（一）分配色谱 （二）吸附色谱 （三）离子交换色谱法 （四）排阻色谱法
分配色谱法
(Partition Chromatography)
分配色谱
液液分配色谱(LLPC)
液体固定相通过物理 吸附固定于载体表面
键合固定相分配色谱(LSPC)
有机分子通过化学反 应键合到载体表面
正相分配色谱 反相分配色谱
固定相性质 键合基团
极性 极性基团
流动相性质
非极性
非极性 疏水基团
极性
出峰顺序 极性小先出 极性大先出
吸附色谱法
分离原理
溶质与流动相分子在吸附剂表面上 的吸附竞争
吸附色谱固定相
以固体吸附剂为固定相，如硅胶、 氧化铝等，较常使用的是5～10μm 的硅胶吸附剂。流动相可以是各种 不同极性的一元或多元溶剂。
高效液相色谱应用实例
对有机酸具有高选择性和高灵敏度
柱后pH调节电导检测
有机酸分析系统流程图
1
9 2
10
6
3
8 4
7 5
1、2 泵 3 进样器 4 柱温箱 5 电导检测器 6 数据处理机 7 混合室 8 柱子 9 流动相 10 缓冲液
分析条件
分离条件 色谱柱：Shim-pack SCR-102H(8mmI.D．