DNA印迹与杂交技术课件PPT
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8.印迹杂交技术
基因突变位点周围的碱基序列是已知的 合成15～20nt的两种探针: 正常探针:与正常基因序列互补 突变探针:与突变基因序列互补 两者区别是与突变位点对应的碱基不同，称 为等位基因特异性寡核苷酸(ASO)探针。
55
用ASO探针分别与待测DNA进行杂交
只与正常探针杂交-正常纯合子 结果 与正常及突变探针均杂交-杂合子
地高辛标记
18
生物素-11-dUTP
19
异硫氰酸荧光素
罗丹明
荧光素
20
四、探针标记的方法
1.切口平移标记法
2.随机引物标记法 3.PCR标记法
4.末端标记法
21
（一）缺口平移标记法
22
（二）随机引物标记法
23
（三）PCR标记法
以四种dNTP（其中一种为标记dNTP）
为底物，扩增产物即为标记DNA，可作 探针使用，其灵敏度和特异性很高。
上，转移后各待测核酸片段在固相膜 上的相对位置和在凝胶中的相对位置
一样。此过程最重要的是要保持核酸
片段的相对位置不变。
31
固相膜：硝酸纤维素膜、尼龙膜 活化滤纸
印迹方法 毛细管虹吸转移法（毛细转移）
真空转移法 电转移法（电泳转移）
32
（1） 毛细管虹吸转移法
33
（2）真空转移法
34
（3） 电转移法
片段的大小和含量
40
41
第四节 核酸分子杂交的分类
根据杂交核酸分子的种类：
DNA与DNA杂交
DNA与RNA杂交 RNA与RNA杂交
42
根据杂交探针标记的不同： 同位素杂交
非同位素杂交
43
根据杂交介质的不同： 液相杂交 点杂交/狭缝杂交
55
用ASO探针分别与待测DNA进行杂交
只与正常探针杂交-正常纯合子 结果 与正常及突变探针均杂交-杂合子
地高辛标记
18
生物素-11-dUTP
19
异硫氰酸荧光素
罗丹明
荧光素
20
四、探针标记的方法
1.切口平移标记法
2.随机引物标记法 3.PCR标记法
4.末端标记法
21
（一）缺口平移标记法
22
（二）随机引物标记法
23
（三）PCR标记法
以四种dNTP（其中一种为标记dNTP）
为底物，扩增产物即为标记DNA，可作 探针使用，其灵敏度和特异性很高。
上，转移后各待测核酸片段在固相膜 上的相对位置和在凝胶中的相对位置
一样。此过程最重要的是要保持核酸
片段的相对位置不变。
31
固相膜：硝酸纤维素膜、尼龙膜 活化滤纸
印迹方法 毛细管虹吸转移法（毛细转移）
真空转移法 电转移法（电泳转移）
32
（1） 毛细管虹吸转移法
33
（2）真空转移法
34
（3） 电转移法
片段的大小和含量
40
41
第四节 核酸分子杂交的分类
根据杂交核酸分子的种类：
DNA与DNA杂交
DNA与RNA杂交 RNA与RNA杂交
42
根据杂交探针标记的不同： 同位素杂交
非同位素杂交
43
根据杂交介质的不同： 液相杂交 点杂交/狭缝杂交
基因组学课件 第8章 分子杂交与印迹技术
➢ 操作步骤：
✓ 蛋白样品的制备 ✓ 蛋白样品的分离-（SDS-PAGE） ✓ 转膜 ✓ 封闭 ✓ 一抗杂交 ✓ 二抗杂交 ✓ 底物显色
50
3、Western 印迹杂交
➢ 酶联显色：
HRP：底物为DAB AP：底物为BCIP/NBT
51
3、Western 印迹杂交
52
3、Western 印迹杂交
转印方法：毛细管虹吸法
➢ 利用毛细管的虹吸作用由转移缓冲液带动核酸分子转移至滤膜上。 ➢ DNA片段由液体携带而从凝胶转移并聚集于薄膜表面。液体通过毛
细管作用抽吸通过凝胶，借助于一叠干的吸水纸巾产生并维持毛细 管作用。转移的速度取决于DNA片段的大小和凝胶中琼脂糖的浓度， 小片段DNA（<1kb）1h内就能够从0.7%琼脂糖上几乎定量地转移， 而较大片段的DNA转移较慢且效率较低。
3）荧光原位杂交
64
2）组织/细胞原位杂交
➢ 特点:
能在成分复杂的组织中进行单一 细胞的研究
不需从组织或细胞中提取核酸， 对含量极低的靶序列灵敏度高
能准确反映组织细胞的相互关系 及功能状态
65
4、原位杂交（in situ hybridization）
1）菌落原位杂交 2）组织/细胞原位杂交 3）荧光原位杂交
5、斑点杂交(dot blot)
59
4、原位杂交（in situ hybridization）
➢ 核酸原位杂交特点：
（1）不受组织成分的影响； （2）灵敏度高； （3）可完整保持细胞或组织形态，准确反映组织细胞的相互关系
及功能； （4）可检测多个探针。
60
4、原位杂交（in situ hybridization）
7
2、分子印迹（blot、bloting）
✓ 蛋白样品的制备 ✓ 蛋白样品的分离-（SDS-PAGE） ✓ 转膜 ✓ 封闭 ✓ 一抗杂交 ✓ 二抗杂交 ✓ 底物显色
50
3、Western 印迹杂交
➢ 酶联显色：
HRP：底物为DAB AP：底物为BCIP/NBT
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3、Western 印迹杂交
52
3、Western 印迹杂交
转印方法：毛细管虹吸法
➢ 利用毛细管的虹吸作用由转移缓冲液带动核酸分子转移至滤膜上。 ➢ DNA片段由液体携带而从凝胶转移并聚集于薄膜表面。液体通过毛
细管作用抽吸通过凝胶，借助于一叠干的吸水纸巾产生并维持毛细 管作用。转移的速度取决于DNA片段的大小和凝胶中琼脂糖的浓度， 小片段DNA（<1kb）1h内就能够从0.7%琼脂糖上几乎定量地转移， 而较大片段的DNA转移较慢且效率较低。
3）荧光原位杂交
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2）组织/细胞原位杂交
➢ 特点:
能在成分复杂的组织中进行单一 细胞的研究
不需从组织或细胞中提取核酸， 对含量极低的靶序列灵敏度高
能准确反映组织细胞的相互关系 及功能状态
65
4、原位杂交（in situ hybridization）
1）菌落原位杂交 2）组织/细胞原位杂交 3）荧光原位杂交
5、斑点杂交(dot blot)
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4、原位杂交（in situ hybridization）
➢ 核酸原位杂交特点：
（1）不受组织成分的影响； （2）灵敏度高； （3）可完整保持细胞或组织形态，准确反映组织细胞的相互关系
及功能； （4）可检测多个探针。
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4、原位杂交（in situ hybridization）
7
2、分子印迹（blot、bloting）
核酸分子杂交技术核酸分子杂交的基本原理PPT课件
第43页/共46页
（4）杂交 • 杂交液体积小：10~20μl • cDNA和RNA探针杂交温度约为50℃ • 杂交时间:DNA探针杂交为2~4h.RNA探针杂交过夜 • 杂交前一般将组织切片置95 ℃ 5~15分钟使DNA变 性 • 冲洗温度一般 不超过50 ℃
第44页/共46页
（5）杂交结果检测 • 所用探针为核素标记,放射自显影检测 • 所用探针为非核素标记,比色或化学发光检测
第40页/共46页
2、杂交过程： （1）组织或细胞的固定
理想固定液应具备： • 保持组织细胞的形态 • 对核酸无抽提，修饰与降解作用 • 不改变核酸在组织细胞内的定位 • 不阻碍核酸与探针的杂交过程 • 对杂交信号无遮蔽作用 • 理化性质稳定
第41页/共46页
（2）组织细胞杂交前的预处理 • 去垢剂（如Triton x-100和SDS）和蛋白酶
K去除核酸表面的蛋白质 • 组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体 • 控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻
片上脱落
第42页/共46页
（3）探针的选择与标记 • 以获得最好杂交效果为依据选择探针 • 探针的长度一般为50~300bp ,有时达1.5kb • 放射性核素标记探针敏感性高，操作简便稳定 检测结果分辨率高，但信号检测时间长 • 非核素标记探针安全、稳定性好、显色快，易 于观察
第19页/共46页
四、探针的纯化
1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可 去除dNTP和蛋白质
2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将 大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷 酸（<80bp)等物质分离，常用凝胶基质是 Sephadex G-50
3、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相 同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此 法则是利用离心的方式来纯化探针
（4）杂交 • 杂交液体积小：10~20μl • cDNA和RNA探针杂交温度约为50℃ • 杂交时间:DNA探针杂交为2~4h.RNA探针杂交过夜 • 杂交前一般将组织切片置95 ℃ 5~15分钟使DNA变 性 • 冲洗温度一般 不超过50 ℃
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（5）杂交结果检测 • 所用探针为核素标记,放射自显影检测 • 所用探针为非核素标记,比色或化学发光检测
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2、杂交过程： （1）组织或细胞的固定
理想固定液应具备： • 保持组织细胞的形态 • 对核酸无抽提，修饰与降解作用 • 不改变核酸在组织细胞内的定位 • 不阻碍核酸与探针的杂交过程 • 对杂交信号无遮蔽作用 • 理化性质稳定
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（2）组织细胞杂交前的预处理 • 去垢剂（如Triton x-100和SDS）和蛋白酶
K去除核酸表面的蛋白质 • 组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体 • 控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻
片上脱落
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（3）探针的选择与标记 • 以获得最好杂交效果为依据选择探针 • 探针的长度一般为50~300bp ,有时达1.5kb • 放射性核素标记探针敏感性高，操作简便稳定 检测结果分辨率高，但信号检测时间长 • 非核素标记探针安全、稳定性好、显色快，易 于观察
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四、探针的纯化
1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可 去除dNTP和蛋白质
2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将 大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷 酸（<80bp)等物质分离，常用凝胶基质是 Sephadex G-50
3、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相 同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此 法则是利用离心的方式来纯化探针
DNA印迹与杂交技术PPT课件
23
4.3 Southern印迹的常用方法 （1）毛细管虹吸印迹法
利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的 DNA转移到固相支持物上。 其基本原理是：容器 中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠， 上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤 纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动 凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA 片段移出凝胶而滞留在膜上。
47
3、离子强度： （1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂
交率增加 （2）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进
行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交 反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度
48
4、甲酰胺： （1）甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交
液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待 测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在 35~42 ℃杂交
的非特异性吸附 （2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分
子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts 溶液或脱脂奶粉。
51
五、 其它分子杂交方法
Southern 印迹法 Northern 印迹法 斑点印迹杂交 原位杂交 Western 印迹法 液相杂交
固相杂交
52
（一）Northern印迹杂交
30
5、Southern杂交
1、预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点 预杂交液为不含DNA探针的杂交液
2、杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交 双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交
3、洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的 DNA
31
6. 杂交结果的检测
化学显色或放射自显影
32
4.3 Southern印迹的常用方法 （1）毛细管虹吸印迹法
利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的 DNA转移到固相支持物上。 其基本原理是：容器 中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠， 上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤 纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动 凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA 片段移出凝胶而滞留在膜上。
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3、离子强度： （1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂
交率增加 （2）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进
行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交 反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度
48
4、甲酰胺： （1）甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交
液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待 测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在 35~42 ℃杂交
的非特异性吸附 （2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分
子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts 溶液或脱脂奶粉。
51
五、 其它分子杂交方法
Southern 印迹法 Northern 印迹法 斑点印迹杂交 原位杂交 Western 印迹法 液相杂交
固相杂交
52
（一）Northern印迹杂交
30
5、Southern杂交
1、预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点 预杂交液为不含DNA探针的杂交液
2、杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交 双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交
3、洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的 DNA
31
6. 杂交结果的检测
化学显色或放射自显影
32
医学分子生物学第九章印迹杂交技术
cDNA； 分别用cy3(绿色)和cy5红色两种荧光燃料标记两种
cDNA。 将标记后的cDNA与点好的芯片进行杂交。 激光扫描芯片杂交结果，计算机处理。 分析杂交数据。
基因芯片
芯片杂交操作流程：
基因芯片
经大规模PCR扩增获得独立cDNA插入片段
人工制作芯片
商业化芯片
分别用cy3(绿色)和cy5红色两种荧光燃料标记两 种cDNA
23 ICK
4 IL-3
22 MIP-3 alpha
25 MMP-8
原始值
model
normal
30386
12625 14732 14606 11547.5 9262.5 20601 16912 16590.5 22787 28232.5
12482.5
7836.5 8059.5 8564.5 6742.5
辣根过氧化物酶源自底物产物， 并发出光辣根过氧化物酶：HRPO 底片曝光
③ Blotting过程
1）牛血清白蛋白封闭硝酸纤维素膜 2）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与
膜上的蛋白结合。 3）洗去未结合的一抗。 4）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。 5）清洗掉未结合的二抗。 6）显影，检测
④结果 单抗blotting 结果
在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测 胶上的蛋白质泳带。
（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）：
是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线 性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷。
② 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） （Polyacrylamide gel electrophoresis）
（一）核酸的变性与复性
复性
RNA
DNA
cDNA。 将标记后的cDNA与点好的芯片进行杂交。 激光扫描芯片杂交结果，计算机处理。 分析杂交数据。
基因芯片
芯片杂交操作流程：
基因芯片
经大规模PCR扩增获得独立cDNA插入片段
人工制作芯片
商业化芯片
分别用cy3(绿色)和cy5红色两种荧光燃料标记两 种cDNA
23 ICK
4 IL-3
22 MIP-3 alpha
25 MMP-8
原始值
model
normal
30386
12625 14732 14606 11547.5 9262.5 20601 16912 16590.5 22787 28232.5
12482.5
7836.5 8059.5 8564.5 6742.5
辣根过氧化物酶源自底物产物， 并发出光辣根过氧化物酶：HRPO 底片曝光
③ Blotting过程
1）牛血清白蛋白封闭硝酸纤维素膜 2）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与
膜上的蛋白结合。 3）洗去未结合的一抗。 4）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。 5）清洗掉未结合的二抗。 6）显影，检测
④结果 单抗blotting 结果
在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测 胶上的蛋白质泳带。
（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）：
是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线 性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷。
② 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） （Polyacrylamide gel electrophoresis）
（一）核酸的变性与复性
复性
RNA
DNA
斑点印迹杂交(共7张PPT)
预杂交：将膜封入15ml离心管中，做好剪角标记。 封闭杂交膜上多余的非特异性DNA结合位点
预杂交的：将探膜封针入15〕ml离，心管中放，做射好剪自角标显记。 影，判断是否有杂交或其杂交强度，主 要用于基因缺失或拷贝数改变的检测。根据点样磨具不同， 点样形状呈圆形称为斑点杂交，呈狭缝形那么称为狭缝杂交。
斑点杂交：是指将待测的DNA变形后点加在硝酸纤维素膜〔或 5 洗膜：倒掉杂交液，洗液1(每次5ml〕洗膜三次〔洗液1预热到42℃〕，每次5min；
预杂交：将膜封入15ml离心管中，做好剪角标记。
再将洗液2 (每次5ml〕洗膜两次〔预热到42℃〕，每次15min。
尼龙膜〕上，用已标记的探针进行杂交，洗膜〔除去未结合 封闭杂交膜上非特异性的蛋白结合位点
立即置于冰中5min〔使DNA变性〕，参加 根据点样磨具不同，点样l 20×SSC混匀。 封闭杂交膜上多余的非特异性DNA结合位点
置42℃恒温摇床上，轻轻振摇30min。
点样：将上述变性后的样品180ul点在尼龙膜的 预杂交：将膜封入15ml离心管中，做好剪角标记。
第3页，共7页。
斑点印迹杂交不需要电泳和转移，杂交过程包括点 样，变性，中和，枯燥固定，预杂交，杂交，封闭， 检测杂交结果等步骤，相对southern印迹杂交和 Northern印记杂交来说快，适合于同时分析多个样 品。
第4页，共7页。
实验步骤：
变性：按8:1将80ul ddH2O参加至10ul待测 DNA样品中，稀释样品。100℃加热10min后，
中120℃烘烤15min。使变性的DNA与膜结合 杂交的双方是待测核酸及探针。
杂交的双方是待测核酸及探针。
牢固 点样：将上述变性后的样品180ul点在尼龙膜的毛面上，真空抽滤，室温下风干后，于烤箱中120℃烘烤15min。
预杂交的：将探膜封针入15〕ml离，心管中放，做射好剪自角标显记。 影，判断是否有杂交或其杂交强度，主 要用于基因缺失或拷贝数改变的检测。根据点样磨具不同， 点样形状呈圆形称为斑点杂交，呈狭缝形那么称为狭缝杂交。
斑点杂交：是指将待测的DNA变形后点加在硝酸纤维素膜〔或 5 洗膜：倒掉杂交液，洗液1(每次5ml〕洗膜三次〔洗液1预热到42℃〕，每次5min；
预杂交：将膜封入15ml离心管中，做好剪角标记。
再将洗液2 (每次5ml〕洗膜两次〔预热到42℃〕，每次15min。
尼龙膜〕上，用已标记的探针进行杂交，洗膜〔除去未结合 封闭杂交膜上非特异性的蛋白结合位点
立即置于冰中5min〔使DNA变性〕，参加 根据点样磨具不同，点样l 20×SSC混匀。 封闭杂交膜上多余的非特异性DNA结合位点
置42℃恒温摇床上，轻轻振摇30min。
点样：将上述变性后的样品180ul点在尼龙膜的 预杂交：将膜封入15ml离心管中，做好剪角标记。
第3页，共7页。
斑点印迹杂交不需要电泳和转移，杂交过程包括点 样，变性，中和，枯燥固定，预杂交，杂交，封闭， 检测杂交结果等步骤，相对southern印迹杂交和 Northern印记杂交来说快，适合于同时分析多个样 品。
第4页，共7页。
实验步骤：
变性：按8:1将80ul ddH2O参加至10ul待测 DNA样品中，稀释样品。100℃加热10min后，
中120℃烘烤15min。使变性的DNA与膜结合 杂交的双方是待测核酸及探针。
杂交的双方是待测核酸及探针。
牢固 点样：将上述变性后的样品180ul点在尼龙膜的毛面上，真空抽滤，室温下风干后，于烤箱中120℃烘烤15min。
第十二章 印迹杂交技术
二、RNA印迹法（Northern blot）
操作：与Southern印迹极为相似，但不需要酶切可直 接变性转移； RNA经变性后再电泳（可用甲酰胺、甲醛等 使RNA变性，不能用碱，易使RNA降解）； 电泳时不能加EB，影响RNA与膜结合； 严防RNase污染。 用途：检测RNA（定性或定量分析细胞内总RNA或 某一特定RNA，特别是分析mRNA的大小和含 量）——研究基因插入缺失等突变、基因表达（金 标准）。
一、核酸探针
——带有标记物且序列已知的核酸片段， 能与待测核酸中的特定序列特异杂交。
• 核酸探针是否合适是决定核酸杂交分析 能否成功的关键。
核酸杂交与分子探针
核酸探针应具有的条件
① 特异性高：只与待测核酸样品中的 互补序列杂交。 ② 带有标记物：标记物灵敏度高而稳 定，检测方便。
核酸探针的种类
常用核酸杂交分类
杂交方法
Southern印迹 Northern印迹 斑点杂交 菌落杂交和噬斑杂交
适用范围
检测经凝胶电泳分开的DNA 分子,需转印到膜上 检测经凝胶电泳分开的RNA 分子,需转移到膜上 检测未经分离的,固定在膜上的 DNA或RNA分子 检测固定在膜上的,经裂解后从 细菌和噬菌体中释放的 DNA分子 检测细胞或组织中的DNA或 RNA分子
2.非放射性标记物
优点：无环境污染，可长时间贮存。 • 生物素：
一种小分子水溶性维生素，连接在碱基上 和抗生物素蛋白（avidin）特异结合 抗生物素蛋白上连接有显色物质(酶、荧光素等) 。 • 酶促显色：
碱性磷酸酶（ALP或AKP）：催化底物（5-溴-4-氯-4吲哚 磷酸，BCIP）和硝基蓝四氮唑（NBT），生成不溶性紫色 化合物二甲臜； 辣根过氧化物酶（HRP）：催化底物二氨基联苯胺（DAB） 生成红棕色沉淀物；或催化底物四氨基联苯胺（TMB）生 成蓝色沉淀物。
医学分子生物学原理-分子杂交和印迹技术
最适切口平移的片段一般为50-500个核苷酸。
2020年3月4日1时8分
15
DNA切口平移标记法示意图
DNA 酶 Ⅰ ： 在 双 链DNA上随机打开 若干个单链缺口， 产生3’-OH端。
大 肠 杆 菌 DNA 聚 合 酶 Ⅰ ： 5’→3’ DNA聚合酶活性； 5’→3’ 外 切 核 酸 酶活性。
➢ 将这些菌落归并到一个琼脂主平板，第二个琼 脂平板表面铺一张硝酸纤维素滤膜。经培养一 段时间后，对菌落进行原位裂解。
2020年3月4日1时8分
6
核酸分子杂交应用
（1）特定基因序列的定性和定量分析 （2）基因克隆的筛选 （3）酶切图谱的制作 （4）基因突变分析 （5）疾病的诊断
2020年3月4日1时8分
7
二、探针的种类和制备
探针(probe)的概念： 用来检测某一特定核苷酸序列或基因序列
的DNA或RNA的互补标记片段：
5′ 3′ 5′
3′
53′′ 5′
3′
2020年3月4日1时8分
3′ 5′ 限制性内切酶
3′ 5′
Klenow DNA聚合酶
完整双链DNA
5 ′末端突出 的DNA
[α-32P]-dNTP 其他3 种dNTP
变性
35 ′′
3 ′末端标记的 DNA
3 ′ 32P-末端标记的
5′
单链DNA探针
21
标记探针的纯化
Luminol化学发光原理
1.曝光：用滤纸吸去杂交膜上多余底物，作好标记， 保鲜膜包裹，放在暗夹里，放上X光片，曝光1-5 分钟；
2.显影：取出X光片，按使用说明书显影和定影。
思考题：
2020年3月4日1时8分
29
2020年3月4日1时8分
15
DNA切口平移标记法示意图
DNA 酶 Ⅰ ： 在 双 链DNA上随机打开 若干个单链缺口， 产生3’-OH端。
大 肠 杆 菌 DNA 聚 合 酶 Ⅰ ： 5’→3’ DNA聚合酶活性； 5’→3’ 外 切 核 酸 酶活性。
➢ 将这些菌落归并到一个琼脂主平板，第二个琼 脂平板表面铺一张硝酸纤维素滤膜。经培养一 段时间后，对菌落进行原位裂解。
2020年3月4日1时8分
6
核酸分子杂交应用
（1）特定基因序列的定性和定量分析 （2）基因克隆的筛选 （3）酶切图谱的制作 （4）基因突变分析 （5）疾病的诊断
2020年3月4日1时8分
7
二、探针的种类和制备
探针(probe)的概念： 用来检测某一特定核苷酸序列或基因序列
的DNA或RNA的互补标记片段：
5′ 3′ 5′
3′
53′′ 5′
3′
2020年3月4日1时8分
3′ 5′ 限制性内切酶
3′ 5′
Klenow DNA聚合酶
完整双链DNA
5 ′末端突出 的DNA
[α-32P]-dNTP 其他3 种dNTP
变性
35 ′′
3 ′末端标记的 DNA
3 ′ 32P-末端标记的
5′
单链DNA探针
21
标记探针的纯化
Luminol化学发光原理
1.曝光：用滤纸吸去杂交膜上多余底物，作好标记， 保鲜膜包裹，放在暗夹里，放上X光片，曝光1-5 分钟；
2.显影：取出X光片，按使用说明书显影和定影。
思考题：
2020年3月4日1时8分
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24
25
（2）电转法 利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到
固相支持物上。
26
（3）真空转移法 此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜
在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真空室上， 利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝 胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带动核酸片段 转移到凝胶下面的尼龙膜或硝酸纤维素膜上。
第二 是将具有核酸印迹的滤膜与带有放射性或其它标记的DNA或 RNA探针进行杂交
12
杂交模式图
－
DNA印迹转移
探针杂交
放射自显影
＋
13
Southern bloting的主要步骤
1.待测DNA样品的制备、酶切 2.待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 3.凝胶中DNA的变性：碱变性 4.Southern转膜(印迹)：
分离、转印到固相支持物上，用探针进行检 测的方法。 应用：基因组DNA的定性和定量分析
基因诊断、分子克隆、法医学等
11
在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或 RNA分子，都必须通过毛细管或电导作用被转移到滤膜上，而 且是按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”上去的，因此， 核酸杂交也被称为“DNA印迹杂交”。 材料：尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜、二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE） 步骤： 第一 将分离的核酸样品转移到固体支持物滤膜上－核酸印迹转移 电泳凝胶核酸印迹法、 斑点和狭线印迹法、 菌落和噬菌斑印迹法
9
核酸的分子杂交
将带有互补的特定核 苷酸序列的单链DNA或 RNA混合在一起，其相应 的同源区段就会退火形成 双链结构。如果退火的核 酸来自不同的生物有机体， 所形成的双链分子就被称 为杂种核酸分子。
10
三、Southern blotting DNA印迹与杂交
1975年，英国Edwen Southern创建 定义：检测DNA杂交方法，即将DNA电泳
5
2、变性的方法： （1）热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸
分子链间的氢键完全断裂。 （2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核
酸分子链 间的氢键断裂。 （3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使
双链核酸分子链间的氢键断裂。
6
3、变性后的理化性质变化： 粘度降低 密度增加 紫外吸收值增加
22
4.2 常用的固相支持物 ①硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交信号本 底低。缺点是DNA分子结合不牢固 ②尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能力比硝酸 纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高 ③化学活化膜：优点：DNA与膜共价结合；对不同 大小的DNA片段有同等结合能力；缺点：结合能 力较上述两种膜低
毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 5.Southern杂交(预杂交、杂交、洗膜) 6.杂交结果的检测
14
（a）
Southern 凝 （b） 胶转移杂交
技术
基因组DNA
DNA限制片段
（c）
（d） 硝酸纤维素滤膜
（e）
同探针同源杂交的 基因DNA片段
X光底片
15
步骤解析
1. 待测DNA样品的制备、酶切
第三节 核酸分子杂交技术
DNA印迹与杂交技术 RNA印迹与杂交技术
1
一、 分子杂交的基本方法
Southern 印迹法 Northern 印迹法 斑点印迹杂交 原位杂交 Western 印迹法 液相杂交
固相杂交
2
二、核酸分子杂交的基本原理
• 具有互补序列两条单链核酸分子在一定 条件下 按碱基互补配对原则退火形成双链 的过程。 • 杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列， 已知核酸序列称探针。
凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为 较短的单链 DNA，中性缓冲液中和凝胶中的 缓冲液。
20
4. Southern转膜(印迹)
待测定核酸分子通过一定的方法转移并结 合到一定的固相支持物（如纤维素膜）上， 即印迹。
21
4.1 固相支持物的选择 （1）理想的固相支持物应具备的特性
①具有较强结合核酸分子的能力 ②不影响与探针的杂交反应 ③与核酸分子结合稳定牢固 ④具有良好的机械性能 非特异吸附少
3
Hybridization of Nucleic Acids
DNA1
DNA2
DNA RNA
探针
probe
Northern
Southern
hybridization
hybridization
4
（一）DNA变性与复性
DNA变性 1、定义：某些理化因素导致两条DNA链间的
氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性。
DNA的提取原理：裂解细胞，使DNA释 放，交替使用酚、氯仿两种蛋白质变性 剂，有效去除蛋白质
标准程序：酚——酚-氯仿——氯仿。
16
17
2. 待测DNA 样品的电泳分离： 琼脂糖凝胶电泳
18
A
B
ห้องสมุดไป่ตู้
C
M 琼脂糖凝胶电泳
bp
—1534
— 994 — 695
— 515
— 377 — 237
19
3. 凝胶中DNA的变性：碱变性
7
复性 1、定义：变性的单链核酸分子在一定
条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸 的过程，称复性或杂交。 具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成 双链：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、 寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。
8
2、复性过程 （1）单链分子间碰撞形成局部双链 （2）局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离 （3）局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列 （4）形成完整的双链分子
23
4.3 Southern印迹的常用方法 （1）毛细管虹吸印迹法
利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的 DNA转移到固相支持物上。 其基本原理是：容器 中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠， 上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤 纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动 凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA 片段移出凝胶而滞留在膜上。
27
28
各种转移方法的比较 i) 毛细管虹吸法：操作简便，不需要特殊转 移仪器，但转移效率低,（扩散法为70%， 毛细管法80%）耗时多。 ii) 电转移法：效率高，耗时少，需特殊转 移仪，对转移条件要求较严。 iii) 真空转移法：效率高，耗时最少，需特 殊真空转移仪。
29
转移的最佳条件
i) 固定基质的选择 ii) 转移前预处理：DNA和RNA分子变性，蛋白质 则需除去凝胶中的SDS。 iii)大分子的转移 对于分子量较大的DNA片段，必须进行原位断裂 后再进行转移，断裂DNA分子最佳长度为1-2kb。 其步骤是： 0.25M HCl处理凝胶两次（每次15分钟） →水洗→0.5M NaOH/1M NaCl两次，每次15分钟→ 转移。
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（2）电转法 利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到
固相支持物上。
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（3）真空转移法 此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜
在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真空室上， 利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝 胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带动核酸片段 转移到凝胶下面的尼龙膜或硝酸纤维素膜上。
第二 是将具有核酸印迹的滤膜与带有放射性或其它标记的DNA或 RNA探针进行杂交
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杂交模式图
－
DNA印迹转移
探针杂交
放射自显影
＋
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Southern bloting的主要步骤
1.待测DNA样品的制备、酶切 2.待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 3.凝胶中DNA的变性：碱变性 4.Southern转膜(印迹)：
分离、转印到固相支持物上，用探针进行检 测的方法。 应用：基因组DNA的定性和定量分析
基因诊断、分子克隆、法医学等
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在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或 RNA分子，都必须通过毛细管或电导作用被转移到滤膜上，而 且是按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”上去的，因此， 核酸杂交也被称为“DNA印迹杂交”。 材料：尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜、二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE） 步骤： 第一 将分离的核酸样品转移到固体支持物滤膜上－核酸印迹转移 电泳凝胶核酸印迹法、 斑点和狭线印迹法、 菌落和噬菌斑印迹法
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核酸的分子杂交
将带有互补的特定核 苷酸序列的单链DNA或 RNA混合在一起，其相应 的同源区段就会退火形成 双链结构。如果退火的核 酸来自不同的生物有机体， 所形成的双链分子就被称 为杂种核酸分子。
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三、Southern blotting DNA印迹与杂交
1975年，英国Edwen Southern创建 定义：检测DNA杂交方法，即将DNA电泳
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2、变性的方法： （1）热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸
分子链间的氢键完全断裂。 （2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核
酸分子链 间的氢键断裂。 （3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使
双链核酸分子链间的氢键断裂。
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3、变性后的理化性质变化： 粘度降低 密度增加 紫外吸收值增加
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4.2 常用的固相支持物 ①硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交信号本 底低。缺点是DNA分子结合不牢固 ②尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能力比硝酸 纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高 ③化学活化膜：优点：DNA与膜共价结合；对不同 大小的DNA片段有同等结合能力；缺点：结合能 力较上述两种膜低
毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 5.Southern杂交(预杂交、杂交、洗膜) 6.杂交结果的检测
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（a）
Southern 凝 （b） 胶转移杂交
技术
基因组DNA
DNA限制片段
（c）
（d） 硝酸纤维素滤膜
（e）
同探针同源杂交的 基因DNA片段
X光底片
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步骤解析
1. 待测DNA样品的制备、酶切
第三节 核酸分子杂交技术
DNA印迹与杂交技术 RNA印迹与杂交技术
1
一、 分子杂交的基本方法
Southern 印迹法 Northern 印迹法 斑点印迹杂交 原位杂交 Western 印迹法 液相杂交
固相杂交
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二、核酸分子杂交的基本原理
• 具有互补序列两条单链核酸分子在一定 条件下 按碱基互补配对原则退火形成双链 的过程。 • 杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列， 已知核酸序列称探针。
凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为 较短的单链 DNA，中性缓冲液中和凝胶中的 缓冲液。
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4. Southern转膜(印迹)
待测定核酸分子通过一定的方法转移并结 合到一定的固相支持物（如纤维素膜）上， 即印迹。
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4.1 固相支持物的选择 （1）理想的固相支持物应具备的特性
①具有较强结合核酸分子的能力 ②不影响与探针的杂交反应 ③与核酸分子结合稳定牢固 ④具有良好的机械性能 非特异吸附少
3
Hybridization of Nucleic Acids
DNA1
DNA2
DNA RNA
探针
probe
Northern
Southern
hybridization
hybridization
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（一）DNA变性与复性
DNA变性 1、定义：某些理化因素导致两条DNA链间的
氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性。
DNA的提取原理：裂解细胞，使DNA释 放，交替使用酚、氯仿两种蛋白质变性 剂，有效去除蛋白质
标准程序：酚——酚-氯仿——氯仿。
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2. 待测DNA 样品的电泳分离： 琼脂糖凝胶电泳
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A
B
ห้องสมุดไป่ตู้
C
M 琼脂糖凝胶电泳
bp
—1534
— 994 — 695
— 515
— 377 — 237
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3. 凝胶中DNA的变性：碱变性
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复性 1、定义：变性的单链核酸分子在一定
条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸 的过程，称复性或杂交。 具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成 双链：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、 寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。
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2、复性过程 （1）单链分子间碰撞形成局部双链 （2）局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离 （3）局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列 （4）形成完整的双链分子
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4.3 Southern印迹的常用方法 （1）毛细管虹吸印迹法
利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的 DNA转移到固相支持物上。 其基本原理是：容器 中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠， 上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤 纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动 凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA 片段移出凝胶而滞留在膜上。
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各种转移方法的比较 i) 毛细管虹吸法：操作简便，不需要特殊转 移仪器，但转移效率低,（扩散法为70%， 毛细管法80%）耗时多。 ii) 电转移法：效率高，耗时少，需特殊转 移仪，对转移条件要求较严。 iii) 真空转移法：效率高，耗时最少，需特 殊真空转移仪。
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转移的最佳条件
i) 固定基质的选择 ii) 转移前预处理：DNA和RNA分子变性，蛋白质 则需除去凝胶中的SDS。 iii)大分子的转移 对于分子量较大的DNA片段，必须进行原位断裂 后再进行转移，断裂DNA分子最佳长度为1-2kb。 其步骤是： 0.25M HCl处理凝胶两次（每次15分钟） →水洗→0.5M NaOH/1M NaCl两次，每次15分钟→ 转移。