microRNA技术介绍
microrna研究思路
microrna研究思路引言：随着生物技术的发展，人们对于微小RNA（microRNA）的研究越来越深入。
微小RNA是一类非编码RNA分子，具有调控基因表达的重要功能。
本文将介绍微小RNA研究的思路和方法，以期更好地理解其在生物学中的作用。
一、鉴定与筛选微小RNA：鉴定和筛选微小RNA是研究的第一步。
目前，常用的方法有基于高通量测序的全基因组鉴定以及生物信息学分析。
首先，通过提取RNA样本，利用高通量测序技术获得大量的RNA序列信息。
然后，利用生物信息学分析工具对测序数据进行处理和比对，筛选出具有典型微小RNA特征的序列。
二、微小RNA的功能研究：微小RNA的功能研究是微小RNA研究的重点之一。
通过实验室内外的功能研究，可以揭示微小RNA在基因调控中的具体作用机制。
常用的研究方法有：靶标预测、基因敲除、转染和转基因动物模型等。
首先，通过生物信息学方法预测出微小RNA的靶标基因。
然后，利用基因敲除技术或转染技术使微小RNA的表达发生变化，观察靶标基因的表达水平变化。
最后，利用转基因动物模型验证微小RNA对于生物体内的调控作用。
三、微小RNA与疾病的关联研究：微小RNA在多种疾病中发挥重要的调控作用，因此，研究微小RNA与疾病的关联关系对于疾病的诊断和治疗具有重要意义。
常用的研究方法有：疾病相关基因的筛选、微小RNA表达谱的分析以及功能研究等。
首先，通过大量的临床样本和生物信息学分析，筛选出与疾病相关的基因。
然后，通过微小RNA表达谱的分析，寻找与疾病相关的微小RNA。
最后，通过功能研究，揭示微小RNA 在疾病发生发展中的作用机制。
四、微小RNA的应用前景：微小RNA的研究不仅可以增进对基因调控的理解，还具有广泛的应用前景。
微小RNA可以作为潜在的生物标志物用于疾病的早期诊断和预后评估。
此外，微小RNA还可以作为潜在的治疗靶点，通过调控微小RNA的表达来治疗相关疾病。
目前，已经有一些微小RNA药物进入了临床试验阶段。
microrna 5’加接头原理
一、微小RNA的概念和作用微小RNA（miRNA）是一类长度约为22个核苷酸的非编码RNA分子，主要通过靶向特定mRNA分子来调控基因表达。
在细胞内的功能方面，miRNA参与了许多生物学过程，包括细胞增殖、分化和凋亡等。
对于miRNA的研究不仅为我们深入了解基因调控提供了新的视角，同时也为相关疾病的诊断和治疗提供了新的思路。
二、miRNA 5’加接头的概念和作用miRNA的5’加接头是指miRNA分子在转录后会在5’端连接一个独特的序列，这个序列通常被称为5’接头。
在miRNA的成熟过程中，这个5’接头扮演着至关重要的角色，它不仅可以保护miRNA分子不被降解，同时也可以帮助miRNA与靶mRNA结合，从而发挥调控基因表达的作用。
三、miRNA 5’加接头的原理miRNA 5’加接头的原理主要包括以下几个环节：1. miRNA的转录：miRNA首先会在细胞中通过基因转录的方式合成成为一段长的前体miRNA，该前体miRNA会进一步被酶切成为长度约为70-100个核苷酸的小分子；2. miRNA的修饰：在miRNA的成熟过程中，miRNA的5’端会连接上一段特定的序列，这个序列即为5’加接头；3. 5’加接头的功能：miRNA 5’加接头的添加不仅可以保护miRNA 分子，同时也可以为miRNA与RISC（RNA诱导靶向RNA降解复合体）的结合提供必要条件。
四、miRNA 5’加接头在研究中的应用miRNA 5’加接头在miRNA研究中起着至关重要的作用，它不仅可以帮助我们更加深入地了解miRNA在基因调控中的作用机制，同时还可以为miRNA的定量和检测提供重要技术支持。
在miRNA疾病的诊断和治疗中，miRNA 5’加接头也被广泛应用，比如在miRNA药物的设计和开发中，5’加接头的改造可以帮助提高miRNA的稳定性和靶向性。
五、miRNA 5’加接头技术的发展和挑战随着对miRNA的深入研究，miRNA 5’加接头技术也在不断地发展和完善中。
微小RNA (microRNA, miRNA)
内容
➢什么是microRNA ➢microRNA的加工过程与作用 ➢microRNA在疾病检测与治疗中的应用
微小RNA (microRNA)
~22 nt的内源性的单链小分子RNA
Bartel, 2018, Cell
发现历程
Bushati and Cohen,2007, Annu. Rev. Cell Dev. Biol
发现历程
➢ 271 organisms ➢ 38 589 hairpin precursors ➢ 48 860 mature microRNAs
Kozomara, et al., 2019, Nucleic Acids Research
二、microRNA的加工与作用
miRNA
的 加 工
Williams, 2008, Cell. Mol. Life Sci
酶消化
酶消化
冻融
酸碱
Chen et al., 2008, Cell Research
microRNAs 表达随疾病发生变化
血清
正常 肺癌 血细胞 血清
Chen et al., 2008, Cell Research
microRNA用于疾病诊断
miR-122的抑制剂（anti-miR-122） 用于丙肝治疗
miRNA的作用
Bartel, 2004, Cell; BaNA也能上调基因表达
He et al., 2016, PNAS
三、microRNA用于疾病诊断
血浆microRNAs
Chen et al., 2008, Cell Research
血浆microRNAs很稳定
酶Drosha切割后成为Pre-miRNA, 随后通过 Exportin运输到细胞质，最终经核酸酶Dicer切割 后并分离为单链的miRNA ➢ miRNA常通过抑制翻译或降解信使RNA而抑制基 因表达，特殊条件下也能激活基因表达 ➢ 血清中存在miRNA，并可用于疾病诊断与治疗
microRNA知识大全
microRNA知识大全microRNA知识大全MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA,是发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer 酶加工后生成。
其在细胞内具有多种重要的调节作用。
每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNAs也可以调节同一个基因。
这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达。
随着miRNA调控基因表达的研究的逐步深入，将帮助我们理解高等真核生物的基因组的复杂性和复杂的基因表达调控网络。
miRNA广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA，其本身不具有开放阅读框(ORF)。
成熟的miRNA，5′端有一个磷酸基团，3′端为羟基。
编码miRNAs的基因最初产生一个长的pri-RNA分子，这种初期分子还必须被剪切成约70-90个碱基大小、具发夹结构单链RNA前体(pre-miRNA)并经过Dicer 酶加工后生成。
成熟的miRNA 5’端的磷酸基团和3′端羟基则是它与相同长度的功能RNA 降解片段的区分标志。
miRNA 5'端第一个碱基对U(尿苷)有强烈的倾向性，而对G却排斥，但第二到第四个碱基缺乏U。
一般来讲，除第四个碱基外，其他位置碱基通常都缺乏C。
这些分子能够与那些和它的序列互补的mRNA分子相结合，有时候甚至可以与特定的DNA片断结合。
这种结合的结果就是导致基因的沉默。
这种方式是身体调节基因表达的一个重要策略。
据推测，miRNA调节着人类三分之一的基因。
microRNA - 形式1 . pre-miRNA约70bp含microRNA茎环结构的pre-miRNA。
制备方式：化学合成、生物转录合成、pre-miRNA质粒表达载体、pre-miRNA病毒。
2. pri-miRNA天然pri-miRNA从染色体基因文库中调取300bp-1000bp完整的microRNA基因，克隆到质粒载体(普通载体或病毒载体)，以强大的CMV启动子操纵该300bp-1000bp microRNA。
MicroRNA研究概况以及MicroRNA芯片技术简述MicroRNA的研究
MicroRNA 研究概况以及MicroRNA 芯片技术简述一、MicroRNA 的研究概况1.MicroRNAMicroRNA（miRNA , miR）是由约21-25个核苷酸组成的分子，microRNA 通过抑制mRNA 的翻译或者促进其降解而起到负性调控的作用。
最初miRNA 的功能在植物学、癌症、病毒性感染和发育生物学中得到了验证。
但最近的研究发现，患有心脏疾病的小鼠对照正常状态miRNAs 失调，并且在肥大的心脏中也检测到了数种miRNA 的上调或者下调，同时体外实验也证实了它们对心肌细胞形态的影响。
2.MicroRNA 的研究进展miRNA现象的最早报道是在佃80年的Genetics和Cell上。
佃93年在线虫中发现的lin-4 是第一个被确定的miRNA [31]，它的基因产物是21 个核苷酸的RNA 分子并且部分序列互补于lin-14 mRNA的3' UTR区域。
这些互补序列使lin-4间断地与lin-14 mRNA结合。
奇怪的是，lin-4没有明显地改变lin-14 mRNA的量，但是Lin-14蛋白表达却明显降低。
2000年又在线虫中发现了与lin-4相似的miRNA ―― let-7，它们参与线虫发育的时空调节。
miRNA基因首先被RNA聚合酶H转录为较长的初始转录本，该转录本含有数千个核苷酸，称其为pri-miRNA。
在pri-miRNA内，miRNA位于由大约70个核苷酸构成的环柄结构内。
在动物体内，该环柄结构在细胞核内被RNA酶川Drosha和其辅助蛋白Pasha/DGCR8 识别和切割，形成pre-miRNA 。
之后，pre-miRNA 迅速被核质/细胞质转运蛋白Exportin5转运至细胞质，被位于细胞质内的RNA酶川Dicer 进一步切割。
产生一个类似于siRNA 的miRNA ：miRNA* 复合体，随后，该双链体解旋为成熟的miRNA和miRNA*，成熟的miRNA在一种ATP-依赖的沉默复合体（RISC ）中，形成非对称的RISC 复合物。
microrna生物学特征
microrna生物学特征
MicroRNA（miRNA）是一组短小的、不编码蛋白质的RNA家族，广泛存在于真核生物中。
其生物学特征主要包括以下几个方面：
1. 长度短：一般含20\~24个碱基，在3'端有1\~2个碱基的差异。
2. 特异性：成熟的microRNA在5'端和3'端具有特殊结构，便于区分。
3. 同源性：均来自前体的一条臂。
4. 广泛性：在自然界广泛存在，从低等生物到人类都有其存在的痕迹。
5. 保守性：高度保守性，时序表达特异性和组织表达特异性，以及miRNA 独有的特征。
6. 功能特性：可以跟RISC结合，促进靶基因mRNA降解，或抑制其蛋白翻译，从而发挥其生物学作用。
更多信息可查阅关于miRNA的学术文献获取。
microRNA沉默技术
microRNAs 沉默技术例证
microRNAs沉默技术例证
实验进程1
·实验动物：小鼠
·沉默分子：antagomir-122
就
是
·提呈系统：胆固醇偶联
我
啦！
·注射方式：尾静脉注射
·靶分子：miR-122（肝脏）
microRNAs沉默技术例证
northern biot分析
③ 夏新，张小敏，宋鹏飞，王爽.反义寡核苷酸介导的 miRNA沉默研究.安徽农业科学.2011.39(24):14545-14547
④ Ambros, V. The functions of animal microRNAs. Nature 431, 350–-355
病（没有图）
microRNAs 沉默技术
microRNAs沉默技术
microRNAs的转录与加工
无效或低 效沉默
高效沉默
microRNAs沉默技术
用单纯的反义寡核苷酸抑制miRNA
效果差！！
分子改造！！
反义寡核苷酸链与miRNA之间 亲和力低！！稳定性差！
1.提高亲和力！ 2.延长细胞内滞留时间！
目录
microRNAs 背景知识介绍
microRNAs的背景知识介绍
mRNA：信使RNA，转录的模板 tRNA ：转运RNA rRNA：核糖体RNA microRNA：微小RNA，起基因调控作用。 hnRNA：不均一核RNA，多为mRNA的前体 snRNA：小核RNA ,对RNA加工方面起作用。 ssRNA:作为病毒的线状单链遗传物质 dsRNA：作为病毒的线状双链遗传物质 siRNA：小干扰RNA Sat-RNA：卫星RNA TR：端粒酶RNA，组成端粒酶的成分之一 核酶RNA：起催化反应的RNA。 。。。。。。
MicroRNA治疗原理分析及应用前景评估
MicroRNA治疗原理分析及应用前景评估近年来，MicroRNA（miRNA）已成为基因治疗领域的研究热点之一。
作为一类小分子RNA，miRNA在细胞内起着调控基因表达的关键作用。
通过干扰miRNA的功能，人们发现可以有效地调控基因的表达，从而影响一系列重要的生物过程，如细胞增殖、细胞分化和细胞凋亡等。
本文将对miRNA治疗的原理进行深入分析，并对其在疾病治疗领域的应用前景进行评估。
一、MicroRNA治疗原理分析1. miRNA的功能和调控机制miRNA是一种短链非编码RNA，一般由21-23个核苷酸组成。
在细胞内，miRNA通过与靶基因的MRNA序列互相配对，从而介导了转录后基因表达的调节。
miRNA在这一过程中通过促进mRNA降解或抑制蛋白质合成来发挥作用。
2. miRNA的治疗模式miRNA治疗可以通过两种模式实现：增强miRNA的功能或抑制miRNA的功能。
增强miRNA功能主要通过miRNA模拟物来实现，这类物质能够降低特定miRNA的表达量，并恢复其功能。
而抑制miRNA的功能则是通过miRNA反义物或miRNA掩蔽物来实现，用以影响miRNA与靶基因的结合。
3. miRNA疾病相关性研究表明，许多疾病与miRNA表达的异常相关。
异常表达的miRNA在许多疾病中被发现，包括癌症、心血管疾病、神经系统疾病等。
因此，调控miRNA表达和功能，对于疾病的治疗具有重要意义。
二、MicroRNA治疗的应用前景评估1. 癌症治疗领域miRNA在癌症治疗中具有广泛的应用前景。
已有研究显示，通过调控miRNA的表达和功能，可以恢复肿瘤抑制miRNA的水平，从而抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭。
此外，miRNA还可以作为肿瘤标记物，用于早期癌症诊断和预后评估。
2. 心血管疾病治疗领域miRNA也被广泛应用于心血管疾病的治疗。
研究发现，某些miRNA在心脏病变中表达异常，并与心肌纤维化、心肌细胞凋亡等心血管疾病相关的生理过程密切相关。
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Victor R. Ambros
C. elegans
lin-4 ,first discovered , control the developmental time of C. elegans.
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lin-4 and lin-14 control timing of larval development and regulate life span in C.elegans
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miRNA Registry
/Software/Rfam/mi rna/index.shtml
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Function
500 400 300 200 100 0
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007.8
Year of miRNA Publications
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Introduction
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The mature miRNA sequence /Software/Rfam/mirna/ Identify the targets of miRNAs /targetscan Gene Ontology (GO) annotations http:// /
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Prediction
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Methods
3’-UTR sequence retrieval; ENSEMBL website http:// www.
miRNAs indentified in viral genomes
Let-7 , a second miRNA discovered by Gary Ruvkun's group
miRNAs implicated in cancer
Sanger Release 10.0 contains 5071 hairpin precursor miRNAs, expressing 4922 mature miRNA products, in primates, rodents, birds, fish, worms , flies, plants and viruses in August 2007
Cancer genomics: Small RNAs with big impacts Nature 435, 745-746(9 June 2005)
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miRNA Genes
TU :transcriptional unit
The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 1993 :75(5):843-854
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A Developmental Timing MicroRNA and Its Target Regulate Life Span in C. elegans Science 23 December 2005:Vol. 310. no. 5756, pp. 1954 - 1957
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miRNA gene prediction algorithms
Genomics of microRNA TRENDS in Genetics vol.22 No.3 March 2006
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Up to 88% of randomly selected predicted miRNA targets were proved to be real targets
Cell, Vol. 123, Issue 6, pp. 1133-1146
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miRNA Introduction
naturally in plants and animals Originate from capped & polyadenylated full length precursors (pri-miRNA) Hairpin precursor ~70 nt (pre-miRNA) Mature miRNA (miRNA)
Single stranded RNAs ◆ 19~25 nt, non-coding RNAs ◆ A single miRNA may target up to hundreds of mRNAs ◆ Inhibition of translational (animal) or Degradation of target RNA (plants) ◆ Regulation of cell proliferation, differentiation, apoptosis, carcinogenesis and viral infection ◆ Evolutionarily conserved
The lin-4 miRNA is shown with its complementary site in Lin-14(a) and Lin-28(b);The microRNA lin-4 and its target- lin-14, control the timing of larval development in Caenorhabditis elegans,also regulate life span in the adult. Reducing the activity of lin-4 shortened life span and accelerated tissue aging, whereas overexpressing lin-4 or reducing the activity of lin-14 extended life span .
Genomics of microRNA TRENDS in Genetics vol.22 No.3 2006
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MicroRNAs in Gene Regulation: When the Smallest Governs It All J 易生物-领先的生物医药商务平台 Biomed Biotechnol. 2006; : 69616.
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miRNA controls some plant phenotype
Control of leaf morphogenesis by microRNAs. Nature 2003, 425: 257–263Nature, 2003 易生物-领先的生物医药商务平台
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miRNA controls the differentiation of the hematopoietic stem cell
MicroRNAs modulate hematopoietic lineage differentiation. 易生物-领先的生物医药商务平台 Science 2004,303, 83–86
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miRNA Publications(NCBI)
700 600
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Number of miRNA Publications Number of miRNA Publications
Timeline for miRNA Dicsoveries
lin-4 , First discovered in C.elegan by Victor Ambros ,mediated repression of lin-14 mRNA miRNAs discovered in human ,mouse and Drosophila
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Differences in miRNA Mode of Action
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miRNA in C. elegans development
◆
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miRNA processing
miRNA genes are transcribed by RNA polymerase II into primary miRNAs (pri-miRNAs). pri-miRNAs are processed into 60 to 70 nt miRNA precursors (pre-miRNAs within the microprocessor complex. exported via exportin-5, pre-miRNAs are cleaved by Dicer, generate an imperfect miRNA:miRNA duplex. mature 22 nt miRNAs are towards specific mRNAs ,the targeted mRNA will be initially subjected either to cleavage or translation repression.