22+透射电镜制样+
透射电镜样品制备方法
透射电镜样品制备方法由于电子束穿透能力限制，必须把标本切成厚度小于0.1um以下的薄片才适用，这种薄片称为超薄切片。
常用的超薄切片厚度是50-70nm。
在透射电镜的样品制备方法中，超薄切片技术是最基本、最常用的制备技术。
超薄切片的制作过程基本上和石蜡切片相似，需要经过取材、固定、脱水、渗透、包埋聚合、切片及染色等步骤。
一．取材的基本要求组织从生物活体取下后，如果不立即进行适当处理，会由于细胞内部的各种酶作用，出现细胞自溶现象。
此外还可能由于污染，微生物在组织内繁殖使细胞的微细结构遭受破坏，因此，为了细胞结构尽可能保持天然状态，必须做到快、小、准、冷。
（1）动作迅速，组织从活体取下后应在最短的时间内（争取1分钟内）投入2.5%戊二醛固定液。
（2）所取组织的体积要小，一般不超过1mm*1mm*1mm。
也可将组织修成1mm*1mm*2mm大小长条形。
因为固定剂的渗透能力较弱，组织块如果太大，块的内部将不能得到良好的固定。
（3）机械损伤要小，解剖器械应锋利，操作宜轻，避免牵拉、挫伤与挤压。
（4）操作最好在低温（0℃~4℃）下进行，以降低酶的活性，防止细胞自溶。
（5）取材部位要准确。
二．取材方法将取出的组织放在洁净的蜡版上，滴一滴预冷的固定液，用新的、锋利的刀片将组织切下并修小，然后用牙签或者镊子将组织块移至盛有冷的固定液的1.5ml离心管中。
如果组织块带有较多的血液和组织液，应先用PBS洗几遍，然后切成小块固定。
1.动物及人体组织的取材（在冰浴上进行）动物组织的取材，应麻醉（1%戊巴比铵5ml/kg体重腹腔注射）或断头急性处死，解剖出所需器官，用解剖剪刀剪取一小块组织，放在干净的纸板上，滴一滴冷却的固定液，用新的、无油污的锋利双面刀片将材料切成大约1mm宽，2~3mm长的小块并从中选出受损伤较小的小条，再将其切成1mm3的小块，最后用牙签将这些小块逐一放入盛有预冷的、新鲜固定液的1.5ml管内，放入冰箱冷藏室低温固定（0~4℃）2-4小时或以上。
透射电镜制样步骤以及注意事项
杨克勤 2013‐4‐11 Nhomakorabea1）（2） （3）
注1： 鉴于目前实验室各研究方向，该流程仅适用于粉末样品； 注2：铜网有亮面和暗面，请记住样品是滴在暗面还是亮面上， 特别是对于使用 有碳膜的铜网的同学； 注3： 将制好的TEM样放入干燥箱过夜，或者在100 oC 以上的烘箱或者红外灯下 烘烤半个小时以上。
碳膜
常用铜网类别
方华膜 载网
注意事项
9 溶液浓度不要太大，一般溶液颜色略透明即可（部分黑色 物质，如石墨， 颜色可稍深）； 9 洗去样品中的表面活性剂，否则会因碳污染影响观察； 9 放入透射电镜前，铜网务必充分干燥，鉴于温州地区特别潮湿，建议做透射 电镜前铜网一直保存在干燥箱里； 9 选择合适的支持膜； 9 特殊分散剂请向实验人员说明； 9 谢绝磁性、挥发性样品做透射电镜。
透射点镜的生物样本的制样过程
透射电镜生物样品制作过程透射电镜生物样品制作过程大致经过取材、固定、脱水、浸透、包埋、切片及染色等步骤。
一. 取材取材时要注意的要点是：快、小、冷、净、准、避免机械损伤。
取材方法：将固定液滴在冰台上的卡片上，在麻醉后的动物身上快速用剪刀剪取一块组织，用预冷的过的缓冲液将剪下的组织洗净，迅速放到卡片上的固定液中，用刀片切去被镊子夹到和剪刀剪过的组织，后按实验的目的将组织切成0.5~1mm2的立方或横截面为1mm2的长方体。
用牙签将切好的组织块转移到装有固定液的小瓶中，贴好标签并置于4℃的冰箱中。
二．固定以下操作尽可能在4℃的环境下，使用的溶液也要保存在4℃的冰箱中。
1、戊二醛固定：用镊子轻轻的将组织块从固定液中取出，放在卡片上的固定液中，利用双面刀片把组织块切成小块状，放进盛有1~1.5ml的0.1%的戊二醛的固定液的细管中，将吸管放进真空箱中，将大气压抽到760托后取出，使组织块在戊二醛溶液中固定1小时。
2、漂洗：经戊二醛固定的组织块要用1~1.5ml的0.1%PBS缓冲溶液漂洗，漂洗的次数为5次，在漂洗到第四次时可以将组织留在PBS漂洗液中过夜，放入4℃的冰箱中。
第二天早晨再进行第五次漂洗。
3、四氧化锇固定：向漂洗过的组织中加入0.5ml的0.1%四氧化锇固定液，固定时间为2个小时。
由于四氧化锇具有毒性，因此操作在通风橱里进行。
4、漂洗四氧化锇：用0.1%PBS缓冲溶液漂洗剩余的四氧化锇，然后再漂洗两次，其时间间隔为10min。
三．脱水为了保证包埋介质完全渗入组织内部，必须事先将组织内的水分驱除干净，即用一种和水及包埋剂均能相混溶的液体来取代水，常用的脱水剂是乙醇和丙酮。
1、酒精脱水:用浓度梯度依次为30%、50%、70%、90%的酒精，依次浸泡组织，其浸泡的时间一般为10min。
当在70%梯度的酒精时，样品可以放置过夜。
2、丙酮脱水：用浓度梯度为90%、100%的丙酮浸泡组织，在纯丙酮中浸泡三次。
透射电镜样品制备
透射电镜试样制备一、实验内容及目的了解透射电镜对试样的要求，熟悉透射电镜试样的制备过程，制备一个合格的透射电镜试样。
二、薄膜样品的制备用于透射电镜下观察的试样厚度要求在50-200nm之间，试样的制备过程大致可以分为以下三个步骤：第一步从实物或大块样品上切割厚度为0.3-0.5mm厚的薄片。
电火花线切割法是目前用得最广泛的方法，它是用一根往返运动的金属丝作切割工具，以被切割的样品作阳极、金属丝作阴极，两极间保持一个微小的距离，利用其间的火花放电进行切割。
电火花切割可切下厚度小于0.5mm的薄片，切割时损伤层比较浅，可以通过后续的磨制或减薄过程去除。
电火花切割只能切割导电样品，对于陶瓷等不导电样品可用金刚石刃内圆切割机切片。
第二步样品薄片的预减薄。
预减薄的方法有两种，即机械法和化学法。
机械法是通过手工研磨来完成的，把切割好的薄片一面用粘接剂粘在样品座表面，然后在水砂纸磨盘上进行研磨减薄。
应注意把样品平放，不要用力太大，并使它充分冷却。
减薄到一定程度时，用溶剂把粘接剂溶化，使样品从样品座上脱落下来，然后用同样方法研磨另一个面直至样品被减薄至规定的厚度。
（如果材料较硬，可减薄至70μm左右；若材料较软，则厚度不能小于100μm。
另一种预先减薄的方法是化学薄化法。
这种方法是把切割好的金属薄片放入配制好的化学试剂中，使它表面受腐蚀而急需减薄。
因为合金中各组成相的腐蚀倾向是不同的，所以在进行化学减薄时，应注意减薄液的选择。
化学减薄的速度很快，因此操作时必须动作迅速。
化学减薄的最大优点是表面没有机械硬化层，减薄后样品的厚度可以控制在20-50μm 。
经化学减薄的样品最终抛光穿孔后，可供观察的薄区面积较大。
但是化学减薄时必须事先把薄片表面充分清洗，否则将得不到满意的结果。
第三步最终减薄目前效率最高和操作最简便的方法是双喷电解抛光法，图为一台双喷式电解抛光装置的示意图。
将预先减薄的样品剪成直径为3mm的圆片,装入样品夹持器中。
透射电镜制样要求与制样方法
透射电镜制样要求与制样方法1. 样品一般应为厚度小于100nm的固体。
2. 样品在电镜电磁场作用下不会被吸出，附于极靴上。
3. 样品在高真空中能保持稳定。
4. 不含有水分或其它易挥发物，含有水分或其他易挥发物的试样应先烘干。
TEM样品常放置在直径为3mm的200目载网上纳米粉末样品的制备方法1、研磨法将（研磨后的）粉末放在去离子水或无水乙醇溶液里，用超声波分散器将需要观察的粉末分散成悬浮液。
用滴管滴几滴在覆盖有支持膜的电镜载网上，待其干燥(或用滤纸吸干)后, 即成为电镜观察用的粉末样品。
载网种类：方华支持膜：方华支持膜的化学成分是聚乙烯醇缩甲醛，由于是纯的有机膜，所以膜的弹性好，厚度通常为 10nm 左右，透射电镜观察时背底影响小。
但方华膜因导电性不好，在电子束照射下，易因高温或电荷积累，产生样品漂移甚至膜破损，通常在 100kV 电镜和生物样品中使用较多。
碳支持膜：是一种最常用的支持膜，有两层膜结构。
从下至上依次为裸网、方华膜和碳膜，由于碳层具有较强的导电性和导热性，弥补了无碳方华膜的荷电效应以及热效应，增强了膜整体的稳定性，适合大多数纳米材料和生物样品的一般形貌观察用于常规样品制样。
微栅：在膜上制作出微孔，以便使样品搭载在微孔边缘，使样品“无膜”观察，提高图象衬度。
观察管状、棒状、纳米团聚物效果好，特别是观察这些样品的高分辨像及mapping时更是最佳选择。
超薄碳膜：在微栅的基础上叠加了一层很薄的碳膜，一般为3-5纳米。
这层超薄碳膜的目的是用超薄碳膜把微孔堵住。
主要针对粒度较小的纳米材料。
如10纳米以下分散性很好的纳米材料，如果用微栅可能从微孔中漏出，如果在微栅孔边缘，由于膜厚可能会影响观察。
所以用超薄碳膜就会得到很好的效果。
纯碳膜：当样品所用的有机溶剂（氯仿、甲苯等）能够溶解方华膜时，载网膜中就要去除方华膜，只剩碳膜，称为纯碳膜，碳膜的厚度通常为 20nm 左右，在高分辨观察时背底的影响也比较明显。
透射电子显微镜样品制备
截面样品专用胶
G1 . G2 (Gatan公司)
M-Bond600/610
G1胶的优点：
1）固化快130°5-10分钟
2）保存时间长（室温一年）
3）高温稳定性好：300°工作十几个小时,400 °几小时
（可在TEM 加热台上升温）
三、薄膜样品——截面样品的制备
截面样品的制备
切好的截面样品重复平面样品的制备工艺,当
3. 凹坑
凹坑后的样品
4. 离子减薄
目的：TEM样品的最终减薄，以获得电子束透明的观察区
域。
特点：不受材料电性能的影响，即不管材料是否导电，金
属或非金属或者二者混合物，不管材料结构多复杂均可用
此方法制备薄膜。制样时惰性气体介质（氩气）对样品组
织结构无影响。
原理：在电场作用下氩气被电离成带Ar+的氩离子，带着一
大钉薄深度：1.1mm×tan4°=77（μm）。因此样品的钉
薄深度不能大于77微米，否则离子束打不到样品中心。
钉轮直径和钉薄深度的关系
不同的钉轮直径可获得的钉薄深度不同
10mm直径的钉轮，钉薄
的深度大于77μm一般不用。
15mm直径的轮子在实践
中效果不错。
钉薄前样品的最佳厚度
起始样品厚度应是钉薄深度
以及氧化膜复型。
一级塑料复型是对样品表面形貌的简单的复制，它表面的形貌
与样品的形貌刚好互补，所以称之为负复型。其厚度可以小到
100纳米。
碳膜一级复型是一种正复型，它与塑料一级复型的区
别是：
1.碳膜复型的厚度基本上相同，而塑料复型的厚度随试样位置
透射电镜生物样品制备步骤
透射电镜生物样品制备步骤
一．取材：
组织块小于1立方毫米
二．固定：
2.5%戊二醛，磷酸缓冲液配制固定2小时或更长时间。
用0.1M磷酸漂洗液漂洗15分三次
1%锇酸固定液固定2-3小时
用0.1M磷酸漂洗液漂洗15分三次
三．脱水：
50%乙醇15-20分
70%乙醇15-20分
90%乙醇15-20分
90%乙醇90%丙酮（1：1）15-20分
90%丙酮15-20分
以上在4度冰箱内进行
100%丙酮室温15-20分三次
四．包埋：
纯丙酮+包埋液（2：1）室温3-4小时
纯丙酮+包埋液（1：2）室温过夜
纯包埋液37度2-3小时
五．固化：
37度烘箱内过夜
45度烘箱内12小时
60度烘箱内48小时
六．超薄切片机切片70 nm
七．3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色
八．透射电镜JEOL JEM-1230（80KV）观察。
拍片。
透射电镜常规制样简易流程
透射电镜常规制样简易流程
1.取样
因戊二醛和锇酸的固定深度有限，样品越小越好，尽量取1mm*1mm*1mm。
2.先固定
戊二醛在3%-6%。
参考：25% 戊二醛（必须买Sigma公司的G5885或者更高浓度的戊二醛）和0.2M PBS 配置为戊二醛5%和0.1M PBS缓冲液的混合工作液；时间：常温4小时后，4度冰箱过夜。
3.清洗
PBS缓冲液冲洗。
一定要洗干净，否则戊二醛和锇酸会产生沉淀。
参考：每15-30分钟更换一次，共4次。
4.后固定
参考:锇酸2%，固定4小时。
剧毒，在通风橱操作。
5.清洗
PBS缓冲液冲洗。
6.梯度脱水
参考：乙醇梯度脱水:30-50-70-90-95-100-100%，每次10-15分钟，无水乙醇中加分子筛或者无水硫酸铜，提前一周配置好备用。
7. 渗透
参考：spurr树脂。
包埋板即可。
8. 包埋聚合
参考：70度，24小时。
10.超薄切片
11.染色
（1）醋酸双氧铀封口膜上染色，染色时间参考：10分钟（铀染）
（2）水清洗
（3）柠檬酸铅因其极易和空气产生铅沉淀，染色时旁边放NaOH颗粒，注意避光。
染色时间参考附件。
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晶体薄膜法
薄膜样品制备步骤：
① 切取：切取薄块（厚度<0.5mm） ② 预减薄：用机械研磨、 Dimpling、化学抛光
等减薄成“薄片”（0.1mm） ③ 终减薄：用电解抛光、离子轰击减薄成“薄
膜”（<500nm）（视材料而定，对于塑性较 好而又导电的材料，一般采用双喷电解抛光， 而对于陶瓷等脆性较大，又不导电的材料一般 用离子减薄的方法。 ）
二、间接样品(复型)的制备
在电镜中易起变化的样品和难以制成薄膜的试 样采用此方法.
表面显微组织浮雕的复型膜，只能进行形貌观 察和研究复型的制备方法，复型主要分为：
一级复型
二级复型
萃取复型（半直接样品）
一级复型
一级复型是指在试样表面的一次直接复型。
避免引起组织结构变化，不用或少用机械方法。 终减薄时去除损伤层。
电解双喷
1。电解双喷时，一般要进行冷却，常用液氮 加酒精的方法来冷却，尤其是钢铁材料，必须冷 却，而且最好用液氮。
2。电解双喷时，要调好电流和电压的值，只 有电流和电压的值处于电解抛光的平台时，才能 制造出好的样品。
常用电解减薄液
粉末（纤维）样品的断面
2. 晶体薄膜样品
块状材料多采用此方法。 通过减薄制成对电子束透明的薄膜样品。 薄膜样品制备方法要求： ①薄膜样品的组织结构必须和大块样品相同，且制
备过程中不引起材料组织的变化。 ② 薄，相对电子束而言必须有足够的“透明度”，
且避免薄膜内不同层次图像的重叠，干扰分析。 ③ 具有一定的强度。
2.塑料复型不破坏样品；而碳膜复型破坏样品（分 离膜与样品时要电解腐蚀样品）。
3.塑料复型因塑料分子较大，分辨率低（1020nm)；碳离子直径小，碳膜复型分辨率高 (2nm)
② 二级复型
先一次复型，然后进行二 次碳复型，把一次复型溶去， 得到第二次复型。 为了增加衬度可在倾斜 15-45°的方向上喷镀一层 重金属，如Cr、Au等。
序号
1
2 3 4
电解液成分与配比
适用材料
乙醇（80ml），冰醋酸(80ml)，高氯酸 (15ml)，甘油(10ml)
正磷酸(480ml)，硫酸(50ml)，铬酐(80g)， 水(60ml)
高氯酸(80ml)，冰醋酸(70ml)
高氯酸(10ml)，乙醇(90ml)
高温合金，耐热钢 ，铝及其合金。
铝及铝合金
30CrMnSi钢回火组织
低碳钢冷脆断口
③ 萃取复型
用碳膜把经过深度侵蚀 （溶去部分基体）试样表 面的第二相粒子黏附下来。 既复制表面形貌，又 保持第二相分布状态，并 可通过电子衍射确定物相。 兼顾了复型膜和薄膜的优点。
萃取复型
二、直接样品的制备
1.粉末样品制备 粉末样品制备的关键是如何将超细粉的颗粒分散开来，各自独立而不
一级复型复型主要分为塑料（火棉胶）一级复型 和碳膜一级复型。
其中，塑料一级复型，相对于试样表面来讲，是
一种负复型，即复型与试样表面的浮雕相反；它
是对样品表面形貌的简单的复制，其表面的形貌 与样品的形貌刚好互补，所以称之为负复型。而
碳膜一级复型是一种正复型。
① 塑料一级复型
样品上滴浓度为1%的火棉 胶醋酸戍酯溶液或醋酸纤维 素丙酮溶液，溶液在样品表 面展平，多余的用滤纸吸掉， 溶剂蒸发后样品表面留下一 层100nm左右的塑料薄膜。 分辨率低（10－20nm），电子束照射下易分解
支持膜法
支持膜的作用是支撑粉末试样，铜网的作用是 加强支持膜。将支持膜放在铜网上，再把粉末 均匀分散地捞在膜上制成待观察的样品。
支持膜法
支持膜材料必须具备的条件： ① 无结构，对电子束的吸收不大； ② 颗粒度小，以提高样品分辨率； ③ 有一定的力学强度和刚度，能承受电子束的
照射而不变形、破裂。 常用的支持膜材料：火棉胶、碳、氧化铝、聚
图 塑料-碳二级复型制备过程示意图
塑料-碳二级复型
塑料-碳二级复型结合两种一级复型的优点。 不破坏样品原始表面；最终复型碳膜，稳定性 和导电导热性都很好，电子束照射下不易分解 和破裂；分辨率和塑料一级复型相当。
适于粗糙表面和断口的复型。
二级复型照片
回火组织中析出的颗粒状碳化物
解理断口上的河流花样
乙酸甲基乙烯酯等。 在火棉胶等塑料支持膜上镀一层碳，提高强度
和耐热性，称为加强膜。
支持膜法
支持膜上的粉末试样要求高度分散，可根据不 同情况选用分散方法：
① 悬浮法：超声波分散器将粉末在与其不发生 作用的溶液中分散成悬浮液，滴在支持膜上， 干后即可。为了防止粉末被电子束打落污染镜 筒，可在粉末上再喷一层碳膜，使粉末夹在中 间。
钢，硅钢 镍基合金，硅钢，
马氏体时效钢
离子减薄法
首先一般是用金刚石锯将块状样品切成0.5~1mm的薄片 ，接下来用手工研磨的方法将薄片研磨到50μm左右，然 后用小刀片将其划为略小于3毫米的小块，用树脂胶或者 A、B胶将小块样品粘于铜环或者钼环上，接着用手工研 磨的方法将其研磨至小于20μm之后，用挖坑仪将其减薄 至小于10μm，然后用离子减薄仪将其减薄至穿孔为止。 离子减薄是采用高能量的Ar离子轰击样品表面，把样品表 面上的原子团或分子团剥离样品。
团聚。 胶粉混合法：在干净玻璃片上滴火棉胶溶液，然后在玻璃片胶液上放
少许粉末并搅匀，再将另一玻璃片压上，两玻璃片对研并突然抽开， 稍候，膜干。用刀片划成小方格，将玻璃片斜插入水杯中，在水面上 下空插，膜片逐渐脱落，用铜网将方形膜捞出，待观察。 支持膜分散粉末法： 需TEM分析的粉末颗粒一般都远小于铜网小孔， 因此要先制备对电子束透明的支持膜。常用的支持膜有火棉胶膜和碳 膜，将支持膜放在铜网上，再把粉末放在膜上送入电镜分析。
② 散布法：直接撒在支持膜表面，叩击去掉多 余，剩下的就分散在支持膜上。
悬浮法注意事项：
在分散粉末时要特别注意，如果分散不好的，在
电镜下将观察不到单个的粉末颗粒。为了确保 粉末分散，一般用小的容器盛满酒精 或丙酮，然后往里面放入极少量的粉 末样品，之后将其置于超声波振荡器 中振动15分钟以上，再用带支持膜的 铜网在溶液中轻轻地捞一下即可。
和破裂。
碳一级复型
样品放入真空镀膜装置中， 在垂直方向上向样品表面蒸镀 一层厚度为数十纳米的碳膜。 把样品放入配好的分离液中进 行电解或化学分离。 分辨率高（2－5nm）， 电子束照射下不易分解和 破裂，样品易遭到破坏。
碳膜与塑料一级复型的区别：
1.碳膜复型的厚度基本上相同，而塑料复型的厚度 随试样位置而异。