硫酸铵沉淀

硫酸铵沉淀:

有生物活性的蛋白一般在做硫胺沉淀的时候要小心一点。最保险的做法就是,把硫酸铵配成饱与溶液,把蛋白溶液置于冰浴上,再把饱与硫胺溶液一滴一滴的加到您的蛋白溶液中,最好边加边搅拌,避免局部硫胺浓度过高,但搅拌的时候注意不要搅出气泡。按照您的比例加完之后,最好放冰箱静置至少2h,充分沉淀后离心即可。

4M的硫酸铵pH值为4、6,在这个酸度下可能会有一些蛋白质变性,要小心。硫酸铵会破坏蛋白质水化层,最好就是缓与地加入。边加入边搅拌,如果在磁力搅拌器上搅拌,小漩涡中心有很多泡沫就表示蛋白质变性,使得溶液粘度增加,泡沫难破,那就很难保证您的蛋白质有没有变性了。

溶解度,在一定温度下,某固态物质在100g溶剂中达到饱与状态时所溶解的质量,

其单位就是“g/100g水”。在未注明的情况下,通常溶解度指的就是物质在水里的溶解度。

溶液饱与度(化学)

某种溶液的饱与度就是指在100g该溶液中溶质在溶液中所占质量分数、一般情况下,一种溶液的饱与度在同一温度下不会变、要想使不饱与溶液饱与度增加可以选择增加溶质、在刚好有晶体析出的时候就就是溶液刚好饱与的时候、溶液饱与度不会出现100%

加固体比较好,加得越慢越好。如果加快了,会造成局部浓度过大,造成意想不到的沉淀。

硫酸铵沉淀的时候应该要注意pH值的变化,就我的实验来说,一株产淀粉酶曲霉固态发酵之后用超纯水浸泡离心,得到含有酶的上清液的pH值为6、5,但就是淀粉酶能耐受pH4、5,为了去除更多杂质蛋白质,我把硫酸铵浓度调节到2摩尔每升的同时会控制pH值为4、5,4度过夜之后离心取上清液再调节到pH值7、0,4度放置,离心,又去除一部分杂质蛋白质,上清液直接用pH7、0的疏水层析系统来纯化。

一个纤维素酶的纯化我也用类似的方法,只不过第一步就是用4、0。

硫酸铵就是酸式盐,2M时pH值约为5,4M时更低,用来沉淀蛋白质的时候情况就更复杂了,所以最好知道自己需要的蛋白质的耐受情况,不要搞死了。

透析之前要选用一个不影响自己想要的蛋白质的pH值,硫酸铵沉淀与透析都要保持一致,才能使损失减少。透析时候产生的沉淀不知道就是不就是您想要的蛋白质,不过下次做最好谨慎一点,做我说过的预备实验。

分段盐析的方法

对分离目的蛋白的盐析,最好采用分段盐析。由于不同的蛋白质其溶解度与等电点不同,沉淀时所需的pH值与离子强度也不相同,改变盐的浓度与溶液的pH值,可将混合液中的蛋白质分批盐析分开,这种分离蛋白质

的方法称为分段盐析法(fractional saltingout)。如半饱与硫酸铵可沉淀血浆球蛋白,饱与硫酸铵则可沉淀包括血浆清蛋白在内的全部蛋白质。

1、分段盐析的条件先需要进行小实验探索,如:先进行0%-30%的硫酸铵沉淀,再进行30%-60%的硫酸铵沉淀,最后进行60%-80%的硫酸铵沉淀。

2、每一段盐析静置之后都将离心取沉淀,透析并检测活性。通过实验结果可以瞧出哪一段盐析出来的目的产物最多,相对来说杂质就更少。

3、比如实验中的活性物质主要在60%-80%这段出来,在以后的实验中,就可以首先进行0%-60%的硫酸铵沉淀,这段沉淀物可以抛弃(去处大多数

杂质);然后进行60%-80%的硫酸铵沉淀,这段沉淀出来就是物质就是所需

要的目的物质含量比较高的物质,将其收集进行下一步纯化工作。

盐析法:

蛋白质、酶在低盐浓度下的溶解度随着盐浓度升高而增加(此时称为盐溶);当盐浓度不断上升时,蛋白质与酶的溶解度又以不同程度下降并先后析出,称为蛋白质的盐析。这一现象就是由于蛋白质分子内及分子间电荷的极性基团有着静电引力,当水中加入少量盐类时,由于盐类离子与水分子对蛋

白质分子上的极性基团的影响,使蛋白质在水中溶解度增大。但盐浓度增加到一定程度时,蛋白质表面的电荷大量被中与,水化膜被破坏,于就是蛋白质就相互聚集而沉淀析出。盐析法就根据不同蛋白质与酶在一定浓度的盐溶液中溶解度降低程度的不同而达到彼此分离的方法。

硫酸铵,25度时饱与溶解度为4、1M,即767g/L;0度时饱与溶解度为3、9M,即676g/L。应用硫酸铵时,对蛋白氮的测定有干扰,且缓冲能力比较差。硫酸铵浓溶液的pH在4、5-5、5之间,当用其她pH值进行盐析时,需用硫酸或氨水调节。

硫酸铵饱与度计算方法及加入方式:在分段盐析时,加盐浓度一般以饱与度表示,饱与溶液的饱与度定为100%。用硫酸铵盐析时其溶液饱与度调整方法有3种。一就是当蛋白质溶液体积不大,所需调整的浓度不高时,可加入饱与硫酸铵溶液;

饱与硫酸铵配制方法可加入过量的硫酸铵,加热至50-60度保温数分钟,趁热滤去沉淀,再在0度或25度下平衡1-2天,有固体析出时即达100%饱与度。盐析所需饱与度可按下式计算:

今天作的实验就是利用硫酸铵沉淀蛋白质,从之前作过的经验知道,这一个步骤就是有名的烦,要慢慢用敲的把硫酸铵缓缓的加入蛋白质溶液中。

相关的原理可以在庄荣辉学习网站中找到,与盐溶刚好相反,在蛋白质溶液中加入硫酸铵,会使得蛋白质的溶解度下降,因而沉淀出来。因为硫酸铵所解离的离子容很大,所带的电子数也多(NH4+, SO42-),因此当其溶入水中时,会吸引大量水分子与这些离子水合。

蛋白质分子表面多少有一些较不具极性的区域,水分子会在这些非极性区的表面聚集,形成类似『水笼』的构造(请见下图),以便把蛋白质溶入水中。一旦蛋白质溶液加入硫酸铵,后者吸引了大量水分子,使水笼无法有效隔离蛋白质的非极性区,造成这些非极性区之间的吸引,因而沉淀下来。因此,分子表面上若有越多的非极性区域,就越容易用硫酸铵沉淀下来。

在计算所添加的硫酸铵的重量方面,找到了一个不错的网站——硫酸铵计算机

这个网页上可以靠着输入实验温度、溶液体积、想要到达的百分浓度以及初始的百分浓度这四个数值,就可以得到需要添加的硫酸铵克数,以及在加入固体硫酸铵后所增加的体积,算就是一个很不错的网站。

此外另一个比较值得提的,就是我有用两种方式加入硫酸铵,第一种就是固体的硫酸铵模碎加入,另一种就是将硫酸铵溶成饱与溶液再加入,各有各的优缺点,比较如下:

1、造成蛋白质变质的程度:固体的硫酸铵>硫酸铵饱与溶液

利用硫酸铵饱与溶液真的超棒,滴入的速度可以很快而不造成变质(没试过用倒入的)。不像固体的硫酸铵只能磨碎慢慢加入,速度一快蛋白质就坏了(溶液有致密的白色气泡产生)。

2、操作的容易度: 硫酸铵饱与溶液>>固体的硫酸铵

固体硫酸铵最大的缺点就就是操作不容易,要一直敲敲敲又不能太快,所以当您要溶解的蛋白质很多时,这就是很累的步骤。然而硫酸铵饱与溶液比较麻烦只有在配制部分,要先加热让它饱合后,回到操作温度让它过饱与,最后用滤纸把硫酸铵结晶去掉。

3、蛋白质溶液的体积放大程度硫酸铵饱与溶液>>固体的硫酸铵

这就是使用硫酸铵饱与溶液最头痛的部分,举例来说,要让100 ml的硫酸铵百分比从0%到25%, 如果就是加入固体的硫酸铵,只会让溶液从100 ml变成107 ml左右,但若就是加入硫酸铵饱与溶液,会让溶液变成125 ml！而且若就是要提高到50%,须加等量的硫酸铵饱与溶液,所以会让蛋白质溶液从100 ml变成200 ml。

因此在加入硫酸铵时,若就是低百分浓度可以利用硫酸铵饱与溶液,然而如果就是高百分浓度的,除非不在意蛋白质溶液体积的放大(反正都要离心离下来),否则还就是用固体硫酸铵来的好。

所以今天从0%拉到25%及从25%拉到50%时,都就是利用硫酸铵饱与溶液,但就是当要从50%拉到75%时,我选择利用固体硫酸铵,因为如果用硫酸铵饱与溶液, 离心机无法离那么多的溶液体积。

硫酸铵沉淀法纯化蛋白的原理与操作及配比用表- Ox Liu - Ox Liu的博客