细胞传代标准操作规程版
细胞传代标准操作流程
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细胞传代操作步骤
细胞传代操作步骤细胞传代呀，就像是一场细胞世界的接力赛！咱就来好好唠唠这个操作步骤。
先得准备好比赛场地呀，也就是超净工作台啦，把它收拾得干干净净，可不能有啥灰尘杂质来捣乱。
然后把咱要用的那些瓶瓶罐罐、吸管啥的都放进去，消消毒，这就好比给运动员们准备好崭新的运动装备。
接下来，就该主角细胞们登场啦！把培养瓶从培养箱里小心翼翼地拿出来，就像迎接冠军队伍一样。
看看细胞们长得咋样啦，如果它们已经密密麻麻地挤在一起，就像人多到快没地方站了，那就是该传代的时候啦。
这时候，就得来点温柔的操作啦。
先用吸管把培养液吸出来，这可不能太粗鲁，不然会伤到细胞宝宝们的。
吸完培养液，再给它们洗个澡，加点缓冲液轻轻晃一晃，把那些杂质啥的都冲掉。
然后呢，就该给细胞们分家啦！可以用胰酶来帮忙，就像个温柔的分割大师。
把胰酶加进去，让细胞们稍微泡一泡，等它们松松地贴在瓶底上，就可以开始下一步啦。
轻轻拍打培养瓶，让细胞们都松动起来，这感觉就像是给运动员们喊加油，让他们活动活动筋骨。
然后再用吸管把细胞们吸起来，分成一小份一小份的，就像把大队伍分成一个个小团队。
把分好的细胞们放进新的培养瓶里，给它们加上新鲜的培养液，这就好比给运动员们准备好充足的能量和营养。
把培养瓶放好，送回培养箱里，让细胞们继续茁壮成长。
你说这细胞传代是不是很有意思呀？就像一场精心安排的比赛，每个环节都不能出错呢。
要是操作不当，细胞们可不高兴啦，说不定就长不好啦。
所以呀，咱得细心细心再细心，就像照顾宝贝一样照顾这些细胞们。
细胞传代可不只是个简单的操作，它关系到细胞能不能健康生长，能不能为我们的实验提供有力的支持呢。
每次做细胞传代的时候，都感觉自己像是个细胞世界的魔法师，掌握着细胞们的命运。
大家可别小瞧了这个过程哦，它可是很多实验的基础呢。
只有把细胞传代做好了，才能让细胞们好好发挥作用呀。
就好比只有运动员们状态好，才能在比赛中取得好成绩一样。
总之呢，细胞传代是个既有趣又重要的操作，大家可得好好掌握呀！让我们一起在细胞的世界里愉快地玩耍吧！。
细胞传代标准操作规程
细胞传代培养标准操作规程一、实验名称：细胞传代培养二、实验目的：传代培养细胞株三、背景知识：随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一方面细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。
此时就需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。
这个过程就称为传代（passage）或者再培养（subculture）。
对单层培养而言，80%汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。
细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。
在一代中，细胞倍增3～6次。
细胞传代后，一般经过三个阶段：游离期、指数增生期和停止期。
常用细胞分裂指数表示细胞增殖的旺盛程度，即细胞群的分裂相数／100个细胞。
一般细胞分裂指数介于0.2％～0.5％，肿瘤细胞可达3～5％。
细胞接种2～3天分裂增殖旺盛，是活力最好时期，称指数增生期(对数生长期)，适宜进行各种试验。
四、实验原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代(再培养)。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。
同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。
悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
五、实验材料和药品：（一）实验药品：DMEM培养基，小牛血清，0.25％胰蛋白酶，PBS缓冲液。
（二）实验仪器和材料：CO2培养箱，倒置显微镜，超净台；培养瓶，弯头吸管，废液缸，离心管；75％酒精棉球，酒精灯，培养细胞六、实验步骤：1．入无菌室之前用肥皂洗手，用75％酒精擦拭消毒双手。
2．倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。
将实验所需培养基置37℃下预热。
3．手在进入超净台前应消毒；超净台台面应整洁，用75％酒精溶液擦净。
4．打开超净台的紫外灯照射台面30min左右，打开抽风机，关闭超净台的紫外灯，清洁空气，除去臭氧。
细胞培养传代冻存复苏操作规程自编
细胞培养传代冻存复苏操作规程自编.doc细胞培养传代、冻存、复苏操作规程第一章总则第一条目的为规范细胞培养实验室的操作流程，确保细胞培养的质量和安全，特制定本操作规程。
第二条适用范围本规程适用于所有进行细胞培养、传代、冻存和复苏的实验室人员。
第三条安全与健康实验室人员在操作过程中必须遵守生物安全和个人防护的相关规范。
第二章细胞培养传代第四条传代前的准备检查细胞培养基、血清、胰蛋白酶等消耗品的质量和数量。
确保无菌操作台、培养箱、显微镜等设备正常运行。
第五条传代操作步骤细胞观察：在显微镜下观察细胞形态，确认细胞健康状况。
培养基更换：使用无菌操作吸去旧培养基，加入适量的胰蛋白酶。
细胞分离：待细胞变圆后，轻敲培养瓶，使细胞脱落。
细胞计数：使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。
细胞传代：根据细胞密度和传代比例，将细胞加入新的培养基中。
第六条传代后的观察观察细胞在新培养基中的附着情况。
定期检查细胞的形态和生长状态。
第三章细胞冻存第七条冻存前的准备准备冻存管、冻存液（含DMSO）、标签等。
确保液氮罐或程序降温仪处于良好状态。
第八条冻存操作步骤细胞计数：确保细胞密度和活力符合冻存要求。
冻存液配制：按照比例加入DMSO至冻存液中。
细胞悬液制备：将细胞与冻存液混合均匀。
细胞冻存：将细胞悬液分装至冻存管中，标记信息。
降温过程：将冻存管放入程序降温仪或直接浸入液氮中。
第九条冻存后的管理将冻存管放入液氮罐中，记录存放位置。
定期检查液氮罐的液位和温度。
第四章细胞复苏第十条复苏前的准备准备培养基、胰蛋白酶、无菌操作台等。
检查培养箱、显微镜等设备是否正常。
第十一条复苏操作步骤取出冻存管：从液氮罐中取出所需冻存管。
快速解冻：将冻存管置于37°C水浴中快速解冻。
细胞悬液制备：将解冻后的细胞迅速转移到含有培养基的离心管中。
离心去除DMSO：低速离心以去除DMSO。
细胞培养：将细胞重悬于新鲜培养基中，转入培养瓶中培养。
细胞传代、铺板 、冻存、复苏等细胞培养相关操作步骤和注意事项
细胞传代的步骤（贴壁细胞为例）
首先，镜下观察细胞密度，90%以上即可传代培养（为了细胞的稳定，距离上 一次传代至少间隔一天。）。
准备工作：无菌枪头、培养瓶、离心管、废液桶等所需物品，培养基、血清、 PBS、胰酶等试剂类，可根据情况，提前放入生物安全柜，进行紫外灭菌；
细胞传代的步骤（贴壁细胞为例）
培养液量 （ml）
0.1 0.2 0.5 1 2 2 5 10 5 15-30
100%细胞量（105） （约） 1 2.5 5 10 25 20 52 137 50 200
培养板需要加入的细胞量
细胞培养板中加入细胞的数量，需要考虑一下几点： 1. 常规实验的设计：转染siRNA（约30%-50%），转染质粒（约70%-
结合镜下观察，调整浓度。 ❖2. 计数细胞：参考前文中各种规格中100%满时细胞的大概数量，再根据实验的
要求，计算加入的细胞的数量。（使用计数板）
细胞计数板的使用
细胞计数板
0.1ul
干净的盖玻片
细胞计数板的使用
10-20 ul 细胞悬液 注意: 避免有气泡！
数上不数下，数左不数右
计算公式： n/4 x104 （个/ml）
4.其他：轻轻移动他人的细胞，轻轻关闭培养箱的门等
细胞冻存
准备工作：FBS，完全培养基，DMSO，或无血清冻存液，冻存管，冻存盒。 常规的细胞传代步骤，至细胞消化后离心完毕，根据细胞的量以及需要冻存的管
数配制冻存液； 冻存液： 10%DMSO+90%FBS/完全培养基（A），或者无血清冻存液（B）。 冻存程序： A ： 1. 使用冻存盒：可直接放入-80℃冰箱，第二天转移入液氮罐中。
把细胞转移到生物安全柜中，吸去培养基，加入无菌PBS（只要没过即 可），轻轻摇动清洗细胞，尽量弃尽PBS。
细胞传代具体操作(1)
一、生物安全柜的操作规程1.进入细菌、细胞间进行实验，必须穿上白大褂和乳胶手套，才能开始后续所有实验操作。
2. 生物安全柜内必备用品：酒精灯、打火机、1000μl枪、200μl枪、200μl枪头一盒、1000μl枪头一盒、移液枪、擦台面的泡有棉球的酒精瓶、装有EP管的瓶子、镊子、记号笔、细胞培养瓶（最多一袋）。
3. 开启紫外灯灭菌之前，请用酒精棉球擦拭台面，并且注意检查如下几点：准备一个废液缸，放入生物安全柜中；移液管是否够用，生物安全柜里面保证至少有一筒装有移液管的铁皮桶；酒精灯的酒精量是否够，若不够请及时添加工业酒精；移液枪是否有电，发现移液枪吸液速度慢了请及时充电；1000μl和200μl枪头是否够，保证生物安全柜里面有各有一盒；擦台面的棉球是否还有，若没有了请及时添加棉球（将医用脱脂棉撕成适宜大小的棉球）和75%酒精；各种型号EP管是否还有，没有了请及时灭菌放入生物安全柜内。
4. 灭菌消毒：开启紫外灯灭菌20-30分钟保证柜内空间无菌，如果紧接着其他实验使用生物安全柜，灭菌5-10分钟即可。
5. 灭菌完后，请打开风机，将挡板升高到一定高度，抽气5-10分钟，将臭氧全部排出。
6. 生物安全柜内所有操作必须带乳胶手套。
7. 实验完毕后，请适当处理废弃物，并且再次用酒精棉球擦拭台面。
8. 生物安全柜内只放一些必备用品，以免影响操作。
如果是私人实验所需物品，请在紫外灭菌之前将其放入进行灭菌。
紫外灭菌后，带入生物安全柜内操作的物品必须先经过灭菌处理。
为了方便他人实验，实验完毕后请务必将私人的实验用品取出。
二．细胞培养箱操作规程1. 培养箱每周换两次超纯水，每两月清洁培养箱一次。
清洁时用75%医用酒精擦拭培养箱，擦拭过程中应关闭培养箱。
2. 取放细胞的过程中严禁对着培养箱内说话，避免引入细菌；取放细胞的手套要喷过酒精，放进培养箱的培养瓶盖最好用75%医用酒精擦拭过。
3. 调节CO2钢瓶的压力为0.05–0.08 MPa，调节压力的时候应关闭培养箱，除仪器负责人不应随便调节CO2压力和仪器参数。
细胞传代标准化步骤
细胞传代标准化流程：
穿戴好白大褂和手套，用75%酒精擦手；
1、取出细胞，显微镜下观察细胞形态和密度，确定细胞生长状况，是否需要传代或换液；
2、将培养基（如有需要还有血清和大瓶高糖培养基）、PBS、胰酶培养基等预热及超净台消毒
结束后，将试剂及细胞等喷酒精后移入超净台，将废液缸喷足酒精移入超净台，取酒精棉放入超净台；
3、点燃酒精灯，将瓶口拧松，过火消毒；
4、在确定细胞生长状况良好且没有污染的情况下，将培养皿中的培养基取（大培养皿6ml，中
培养皿3ml）至一个新的15ml离心管中；（一个1ml枪头）
5、用适量PBS清洗细胞表面（大皿5ml，中皿3ml），并弃去PBS；（一个5ml枪头）
6、加入适量胰酶消化细胞（大皿1ml，中皿0.5ml），此时可将细胞置于37°C细胞培养箱内消
化；（C2C12用5min，3T3-L1用1.5min），（一个1ml枪头）
7、待消化完全后，用胰酶6倍体积的完全培养基中止消化，并吹打培养皿皿底，将细胞移入离
心管；（一个5ml枪头）
8、1000rpm，5min离心，离心间隙可以准备好传代的细胞培养皿，并加好培养基；
9、弃上清，口擦酒精，烧口；
10、加适量完全培养基吹打混匀细胞(沿壁轻轻吹打24次左右)，按合适比例进行细胞传代，
在盖上标记好细胞名称、代数及传代日期并放入孵箱。
（一个1ml枪头）
11、将所有试管收至冰箱，将废液缸及废液取出，装至一次性PE手套，废液缸喷酒精清洗
12、用酒精棉仔细擦拭操净台表面，检查显微镜、离心机是否关闭，孵箱是否正常；
13、做试验记录，打开超净台和细胞间紫外，15min后关闭。
细胞传代标准化步骤
细胞传代标准化流程：
穿戴好白大褂和手套,用75%酒精擦手；
1、取出细胞,显微镜下观察细胞形态和密度,确定细胞生长状况,是否需要传代或换液；
2、将培养基如有需要还有血清和大瓶高糖培养基、PBS、胰酶培养基等预热及超净台消毒
结束后,将试剂及细胞等喷酒精后移入超净台,将废液缸喷足酒精移入超净台,取酒精棉放入超净台；
3、点燃酒精灯,将瓶口拧松,过火消毒；
4、在确定细胞生长状况良好且没有污染的情况下,将培养皿中的培养基取大培养皿6ml,
中培养皿3ml至一个新的15ml离心管中；一个1ml枪头
5、用适量PBS清洗细胞表面大皿5ml,中皿3ml,并弃去PBS；一个5ml枪头
6、加入适量胰酶消化细胞大皿1ml,中皿,此时可将细胞置于37°C细胞培养箱内消化；
C2C12用5min,3T3-L1用,一个1ml枪头
7、待消化完全后,用胰酶6倍体积的完全培养基中止消化,并吹打培养皿皿底,将细胞移入
离心管；一个5ml枪头
8、1000rpm,5min离心,离心间隙可以准备好传代的细胞培养皿,并加好培养基；
9、弃上清,口擦酒精,烧口；
10、加适量完全培养基吹打混匀细胞沿壁轻轻吹打24次左右,按合适比例进行细胞传
代,在盖上标记好细胞名称、代数及传代日期并放入孵箱;一个1ml枪头
11、将所有试管收至冰箱,将废液缸及废液取出,装至一次性PE手套,废液缸喷酒精清
洗
12、用酒精棉仔细擦拭操净台表面,检查显微镜、离心机是否关闭,孵箱是否正常；
13、做试验记录,打开超净台和细胞间紫外,15min后关闭。
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细胞传代培养SOP（消化法）
具体步骤如下：
1. 传代前准备：
1.1预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37C水浴锅内预热。
1.2 用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
1.3 正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。
1.4 点燃酒精灯：注意火焰不能太小。
1.5 准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8 分钟再次消毒。
1.6 取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
1.7 从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。
1.8 打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。
2. 胰蛋白酶-EDTA消化：
2.1加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶-EDTA液）,注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37T <
2.2 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。
2.3 吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。
3. 吹打分散细胞：
3.1 吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。
3.2吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。
3.3 平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8 分钟。
3.4弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。
4. 分装稀释细胞：
4.1 分装：将细胞悬液吸出分装至2-3 个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。
4.1 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。
注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5X 105/ml。
最后要做好标记。
5. 继续培养：
用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO培养箱中继续培养。
传代细胞 2 小时后开始贴附在瓶壁上。
当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25％时
为一个＋，占50％为＋＋，占75％时为＋＋＋。
传代细胞培养注意事项：
1. 严格的无菌操作
2. 适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。
加入培养瓶中的量等一旦胞质回缩，连。