转生长激素基因鱼的研究与进展

转生长激素基因鱼的研究进展摘要: 本文主要介绍了非“全鱼”、“全鱼”以及“同种”生长激素基因重组体的构建，对比分析相应转基因鱼的生长，同时介绍了显微注射法、电脉冲法、精子载体法、基因枪法等常用的鱼类基因转移技术，分析了转生长激素基因鱼的安全性、遗传稳定性和发展前景。

关键词：生长激素基因重组体；转基因鱼；基因转移；Abstract:This paper mainly introduces the of non - "all fish", fish and the same growth hormone gene recombinant construction, comparison and analysis of the corresponding transgenic fish growth, at the same time, it introduces the micro injection method, electroporation ,sperm vector method,Particle gun method commonly used fish gene transfer technology, analysis of the growth hormone gene fish safety, genetic stability and development prospects.Key words: Growth hormone gene recombinant; transgenic fish; gene transfer;0前言1985年，世界上第一批转基因鱼的诞生，开辟了鱼类遗传育种的新领域，同时也揭开了转基因鱼研究的序幕[1]。

过去的20 余年，转基因鱼研究取得了长足发展。

目前，世界上已经有超过35 种的鱼用于转基因研究，绝大多数鱼类的转基因研究以培育具有优良生产性状的新品系为目的[2]。

其中，生长激素转基因鱼由于具有生长速度快、饵料转化效率高等特点而备受关注。

近日，美国食物药品管理局（FDA）在确认转基因三文鱼食用安全性五年、环境安全性三年之后，批准了水恩公司（AquaBounty）的转基因三文鱼品牌“AquAdvantage”上市，从而使之成为首个获批的供食用转基因动物，快速生长转基因鱼在转基因动物中率先实现市场化[2]。

在对转生长激素基因鱼的研究中，先后经历了转非全鱼生长激素基因鱼，转全鱼生长激素基因鱼以及同种生长激素基因鱼的研究，采用了显微注射法、电脉冲法、精子载体法、基因枪法等常用的基因转移技术，本文主要分析不同转基因元件构建的转基因鱼生长状况，介绍几种基本的基因转移方法，转基因鱼的安全性、遗传稳定性分析以及其发展前景。

1生长激素基因重组体与转基因鱼1.1 非“全鱼”生长激素转基因鱼非“全鱼”生长激素转基因重组体指转植基因的构成元件(调控序列和生长激素编码序列)中至少有一部分来自鱼类以外的其他物种。

通过转移此类转植基因所获得的转基因鱼即为非“全鱼”生长激素转基因鱼。

转基因鱼研究的初期，所使用的重组生长激素基因来自哺乳动物，如人、牛等的生长激素基因，调控顺序有小鼠金属硫蛋白基因(mMT)启动子、病毒SV40启动子等。

部分非“全鱼”生长激素转基因鱼的快速生长效应是令人振奋，60 日龄转入生长激素基因银鲫(Carassius auratus gibelio Bloch)的平均体重是对照组的 1.82 倍[4]。

135日龄转入生长激素基因泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)体重较对照鱼增加3—4.6 倍[5,6]。

F2 代转入生长激素基因鲤鱼(Cyprinuscarpio L.)最大个体体重是对照鱼的8.7 倍[7]。

除此之外，尽管其他非“全鱼”生长激素转基因鱼的生长速率或体重增加较对照鱼有一定优势，但一般不超过 50%。

F2 和 F4代转入生长激素基因红鲤(Cyprinus carpio L. red var.)的生长率分别比对照鱼高出13%—25%[8,9]。

转虹鳟生长激素基因鲤鱼P0 代个体的平均体重比对照鱼高 22%，F1 代杂合个体平均体重比对照鱼高50%[10,11]。

嵌合体转基因沟鲶(Ictalurus punctatus)平均体重与对照鱼之间没有显著性差异，尽管其F1 代转基因个体表现出一定的快速生长效应，但其平均体重仅仅高出对照鱼23%—26%[12]。

1.2 “全鱼”生长激素转基因鱼“全鱼”生长激素转基因鱼指通过转移构成元件来自鱼类，但又不完全来自于受体鱼类本身的转植基因所获得的转基因鱼。

朱作言等利用鲤鱼肌动蛋白基因启动子与草鱼生长激素基因(gcGH )，重组构建了鲤科鱼类基因元件组成的“全鱼”生长激素基因构建体pCAgcGH[13]。

目前，国际上已克隆出20 多种鱼的GH 基因，包括鲷鱼、大马哈鱼等[14]。

在此基础上，国内外已构建出10多个“全鱼”重组基因，证实了其在受体鱼中的生物学功能[15]。

转“全鱼”生长激素基因鱼的生长情况根据“全鱼”转植基因不同可分为如下 4 种情况。

(1) 转植基因调控序列和编码序列均来源于与受体鱼亲缘关系较远的鱼类。

这一类转基因鱼主要包括转基因罗非鱼(Oreochromis niloticus)、泥鳅、香鱼(Plecoglossus altivelis)、平鲷(Rhabdosargus sarba)和印度鲶鱼(Heteropneustes fossilis)。

转基因罗非鱼在室内和室外生长条件下均表现出明显的快速生长效应(2—4 倍), 但是不同家系之间表现出较大的差异[17]。

与对照鱼相比，转基因泥鳅、香鱼和平鲷的快速生长效应均达到了2 倍[17,18]，而生长激素转基因印度鲶鱼的生长速率是对照鱼的 1.6—1.8倍[19]。

(2) 转植基因调控序列来源于与受体鱼亲缘关系较远的鱼类, 而编码序列则来自于亲缘关系很近的鱼类。

这一类的典型代表是转基因大西洋鲑。

转基因大西洋鲑的生长速率是对照鱼的2—6 倍[20,21]。

此外, 转生长激素基因大鳞大麻哈鱼(Oncorhynchus tshawytscha)、克氏鲑(Oncorhynchus clarkii)以及虹鳟(Oncorhynchus mykiss)的平均体重分别是对照鱼的3—6 倍[22]。

(3) 转植基因调控序列和编码序列均来自于与受体鱼类亲缘关系很近的鱼类。

转基因银大麻哈鱼(Oncorhynchus kisutch)和红点鲑(Salvelinus alpinus)即属于这一类。

这一类转基因鱼的快速生长效应较上述几类更加明显，均达到了10 倍以上。

转基因银大麻哈鱼的平均体重是对照鱼的11 倍，最大转基因个体体重是对照鱼的37 倍[23]。

10 月龄的转基因红点鲑的平均体重是对照鱼的14 倍[24]。

(4) 转植基因调控序列和编码序列两部分中一部分来自于受体鱼类，另一部分则来自于受体鱼类以外的其他鱼类。

这一类包括转基因黄河鲤和南亚野鲮(Labeorohita)。

80 日龄F1 代转基因黄河鲤平均体重为对照鱼的 1.6 倍[25]。

转基因野鲮生长速率是对照鱼的4.0—5.8倍[26]。

1.3 “同种”生长激素转基因鱼“同种”生长激素转基因鱼指通过转移构成元件均来自受体鱼类本身的转植基因所获得的转基因鱼。

生长激素转基因泥鳅是世界上第一例“同种”转基因鱼，快速生长效应可谓是惊人的。

部分嵌合体转基因鱼的体重是对照鱼的35 倍。

2月龄超大型转基因个体体重、体长均远远大于12 年龄的普通泥鳅[27]。

饲养转基因泥鳅到上市规格 (10 g)仅需30—50d, 而对普通泥鳅而言, 这一过程则需6 个月。

此外,“同种”转生长激素基因罗非鱼[28]、野鲮[29]和团头鲂[30]的研制也在进行中。

综上所述，转生长激素基因鱼具有快速生长效应已勿庸置疑。

但由于实验鱼种类和品系、转植基因、整合位点、拷贝数等因素致使不同生长激素转基因鱼之间生长情况存在较大差异。

总体上讲，“全鱼”生长激素转植基因的促生长效应较非“全鱼”生长激素转植基因有了较大提高，但似乎“同种”转植基因的促生长效应最为明显。

2 鱼类基因转移的几种主要方法2.1显徽注射法即在显微镜下借助显微操作将直径几微米的玻璃插入受精卵原核或核附近的细胞质中，注入一定量的外源基因，注射后的受精卵于室温下在生理盐水中发育成鱼苗。

显微注射法(Microinjection)是目前广泛应用、效果较好的一种方法。

目前有三种显微注射方法。

一是从受精孔将DNA溶液注入卵中，简称MP法[31]。

二是在受精卵刚受精后卵壳尚未变硬时直接注射，简称Ei法[31]。

三是先用硬金属针在卵壳上打一个孔，再进行显微注射，简称LI 法[31]。

2.2 电脉冲法该法的基本原理是利用外部高电压短脉冲使细胞膜的结构改变，使之产生可逆的孔隙或孔洞，一定大小的分子包括 DNA 即可通过孔隙或孔洞进入细胞。

在电脉冲处理下，外源DNA 可进入已去除卵壳的受精卵，其中部分外源DNA可整合到受精卵的基因组内而成为转基因鱼。

这一方法的优点是，操作比较简单，可同时处理大量的受精卵。

缺点是外源DNA导入无定向性，转移率较低等。

关于外源基因在电脉冲处理下进入受精卵的机制目前尚不十分清楚。

在仅有的两例成功的鱼类电脉冲基因转移报道中，使用的电压都较低(几百伏)。

有人认为，在这样的电压下，受精卵膜不会发生变态，因此外源基因的进入机制也就不同于培养细胞。

分析是在鱼类受精卵膜上天然存在一些小孔，在低电压下，外源基因就通过这些小孔进入受精卵[32]。

2.3精子载体法在鱼类的受精过程中，精子进入卵子，与受精卵的雌性原核结合，成为受精卵，随后发育成个体。

如果将目的基因设法结合到精子上，由精子将这一基因带入卵内不失为一条有效的基因转移途径。

目前, 精子载体制作转基因鱼主要有2种方法:2.3.1直接混合法在受精前将精子直接加入事先配好的保存液中, 然后与外源基因混匀, 温育半小时后按常规方法受精。

2.3.2 脂质体法将外源DNA 与精子混合培养之前用脂质体包裹, 脂质体自发地与DNA 形成脂质体- DNA 复合体。

这种复合体比较容易和精子细胞质融合, 从而进入细胞内部, 同时脂质体的包裹还可防止核苷酸酶的降解以及防止DNA 被稀释。

2.4基因枪法又名高速钨微粒子轰击法或粒子枪法( Particle gun) 。

基因枪法是利用DNA 包裹在钨微粒子上面，通过高速轰击受体细胞以达到把外源DNA 转移的目的[33]。

该方法在植物细胞中使用得较多，鱼类也有成功的报道，如Zelenin 等用半乳糖苷酶和新霉素磷酸转移酶基因序列的质粒DNA 包裹钨微粒子，高速轰击欧洲泥鳅( Misgurnus fossilis) 、虹鳟鱼和斑马鱼受精卵, 有70% 的卵受轰击后存活[33]。