蛋白质的修饰和表达
蛋白质的修饰和功能调控
蛋白质的修饰和功能调控蛋白质是生命体中最基本的分子组成部分之一，它们参与了细胞的几乎所有生物学过程。
然而，蛋白质单独的氨基酸序列并不能完全解释它们的多样功能。
蛋白质的修饰和功能调控起着非常重要的作用，通过化学修饰以及与其他分子的相互作用，蛋白质的功能可以被调节和扩展。
一、蛋白质修饰的类型及功能1. 磷酸化修饰磷酸化修饰是一种常见的蛋白质修饰方式，通过将磷酸基团共价地添加到蛋白质的特定氨基酸上，如丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。
这种修饰方式可以影响蛋白质的空间结构和电荷状态，从而改变其功能。
例如，磷酸化可以调节酶的活性，参与信号转导通路，调控细胞增殖和凋亡等过程。
2. 甲基化修饰甲基化修饰是一种将甲基基团共价地添加到蛋白质的氨基酸上的修饰方式。
这种修饰方式可以改变蛋白质的亲水性、电荷状态以及相互作用的能力，从而调节蛋白质的功能。
例如，甲基化修饰可以在染色质结构的调控中起到重要作用，调节基因的转录和表达。
3. 乙酰化修饰乙酰化修饰是一种将乙酰基团共价地添加到蛋白质的氨基酸上的修饰方式。
这种修饰方式可以改变蛋白质的结构和电荷状态，影响蛋白质的功能。
例如，乙酰化可以调节组蛋白的结构，影响染色质的结构和稳定性，从而调控基因的表达。
4. 糖基化修饰糖基化修饰是一种将糖基团共价地添加到蛋白质的修饰方式。
这种修饰方式可以改变蛋白质的结构、稳定性和溶解度，影响蛋白质的功能。
例如，糖基化修饰可以参与细胞黏附、信号转导和免疫应答等重要的生物学过程。
二、蛋白质修饰的调控机制1. 激酶和磷酸酶的作用蛋白质的磷酸化修饰通常是由激酶和磷酸酶调控的。
激酶可以添加磷酸基团到蛋白质上，而磷酸酶可以将磷酸基团去除。
这种激酶和磷酸酶之间的平衡调节，可以使蛋白质的磷酸化状态发生变化，从而影响其功能。
2. 转录调控因子的作用转录调控因子可以结合到蛋白质上，并改变蛋白质的修饰状态，从而调节蛋白质的功能。
通过与转录因子的相互作用，蛋白质可以参与基因的转录和表达调控。
蛋白质工程--3蛋白质的修饰和表达
2 蛋白质分子的固定化
蛋白质分子的固定化主要是酶分子的固定
吸附法、交联法、包埋法、共价结合法 A）交联法 B）共价结合法 ➢载体的物化性质要求载体亲水，并且有一定的机械强度 和稳定性，同时具备在温和条件下与酶结合的功能基团
➢反应必须在温和pH、中等离子强度和低温的缓冲溶液中 进行
➢所选择的偶联反应要尽量考虑到对酶的其他功能基团的 副反应尽可能少
3. 羧基的化学修饰 通过碳二亚胺法、混合酸酐法与蛋白质分子上的氨基形成
酰胺键
二硫键的化学修饰
二硫键的还原：必须使用超剂量的巯基乙 醇，同时用过羧甲基化处理
判断蛋白质分子中有无二硫键，是链内二 硫键还是链间二硫键的方法可用非还原/还 原双向SDS-PAGE电泳技术
2 蛋白质的位点专一性修饰
专一性： 试剂对被修饰基团的专一性 对蛋白质分子中被修饰部位的专一性
第三章 蛋白质的修饰和表达
第一节 蛋白质修饰的化学途径 第二节 蛋白质改造的分子生物学途径 第三节 重组蛋白质的表达
第一节 蛋白质的化学修饰
凡通过活性基团的引入或去除，而是蛋白质一级 结构发生改变的过程
影响因素： 1) 蛋白质功能基的反应活性 基团之间的氢键和静电作用 基团之间的空间阻力 2) 修饰剂的反应活性
1) 蛋白质修饰的交联方法和试剂
常用的方法通常有重氮化法、戊二醛法、过碘酸盐氧化 法、混合酸酐法及碳二亚胺法
A) 重氮化法: 重氮盐与蛋白质分子中的酪氨酸残基上的 邻位，即得到以偶氮键相连的结合物
B) 戊二醛法:戊二醛的两个醛基可以分别与两个相同或不 同分子上的伯氨基酸形成Schiff碱，将2分子以五碳链的 桥连接起来
1. 巯基的化学修饰
1）碘乙酸和碘乙酰胺 2）N-乙基马来酰亚胺：反应伴随光吸收的变化
蛋白质的修饰和表达
蛋白质翻译后修饰包括磷酸化乙酰化和泛素化等可以调节蛋白质表达和功能
蛋白质翻译后修饰包括磷酸化乙酰化和泛素化等可以调节蛋白质表达和功能蛋白质翻译后修饰包括磷酸化、乙酰化和泛素化等可以调节蛋白质表达和功能蛋白质是构成细胞的重要组成部分，它们在细胞内执行各种功能。
然而，在合成蛋白质的过程中仅仅翻译出氨基酸链还不足以确保完成蛋白质的结构和功能。
事实上，蛋白质在翻译后还需要经历修饰的过程，其中包括磷酸化、乙酰化和泛素化等多种修饰方式。
这些修饰过程不仅可以调节蛋白质的表达水平，还能调控其功能。
一、磷酸化修饰磷酸化是指通过酶类将磷酸基团添加到蛋白质的特定氨基酸上，通常是赖氨酸、苏氨酸或酪氨酸。
磷酸化修饰在细胞信号传导、细胞周期调控和基因表达等生物过程中起着重要的作用。
磷酸化能够改变蛋白质的电荷分布，从而调节蛋白质的结构和功能。
例如，磷酸化可以导致蛋白质的构象变化，从而改变蛋白质与其他分子的相互作用。
此外，磷酸化还可以介导蛋白质的定位和降解，以及参与细胞信号传导的级联反应等。
二、乙酰化修饰乙酰化是指在蛋白质上添加乙酰基团，通常是赖氨酸残基。
乙酰化修饰通过乙酰转移酶进行，在细胞代谢、细胞周期调控和染色质结构维持等生物过程中发挥着重要的作用。
乙酰化能够调节蛋白质的功能和稳定性。
通过乙酰化，蛋白质的电荷分布和空间结构发生改变，从而影响蛋白质与其他分子的相互作用。
此外，乙酰化还能够调控蛋白质的定位和降解，参与细胞信号转导和基因表达的调控等重要生物过程。
三、泛素化修饰泛素化修饰是指在蛋白质上添加泛素分子，通常通过泛素连接酶（E3酶）介导完成。
泛素化修饰在细胞质调控、蛋白质降解和细胞凋亡等生物过程中发挥着重要的作用。
泛素化修饰能够标记蛋白质，使其被泛素酶体降解并确保细胞内的蛋白质质量控制。
此外，泛素化还可以调节蛋白质的定位和活性，影响其与其他分子的相互作用。
综上所述，蛋白质翻译后的修饰过程如磷酸化、乙酰化和泛素化等可以调节蛋白质的表达水平和功能。
这些修饰对于细胞内各种生物过程的调控起着重要的作用。
蛋白质合成、修饰及分泌
03
蛋白质分泌
囊泡运
01
02
03
04
囊泡运输是指蛋白质在细胞内 合成后，通过一系列的囊泡转 运过程，将其从内质网等合成 场所转运至高尔基体进行加工 和修饰，再通过胞吐作用分泌 到细胞外。
囊泡运输是指蛋白质在细胞内 合成后，通过一系列的囊泡转 运过程，将其从内质网等合成 场所转运至高尔基体进行加工 和修饰，再通过胞吐作用分泌 到细胞外。
蛋白质合成、修饰及分泌
目
CONTENCT
录
• 蛋白质合成 • 蛋白质修饰 • 蛋白质分泌 • 蛋白质合成、修饰及分泌的相互关
系
01
蛋白质合成
氨基酸的合成
氨基酸是蛋白质的基本组成单 位，通过生物合成或从食物中 摄取来获得。
生物合成氨基酸主要通过转氨 基作用、脱羧基作用和氨基转 移作用等途径来完成。
不同的生物合成氨基酸的方式 不同，例如植物和微生物可以 通过光合作用将二氧化碳转化 为有机物，而动物则必须从食 物中摄取氨基酸。
核糖体合成
02
01
03
核糖体是细胞内合成蛋白质的场所，由大、小两个亚 基组成。
核糖体合成蛋白质的过程包括氨基酸的活化、肽链合 成的起始、肽链的延长和终止等步骤。
在核糖体合成过程中，mRNA作为模板指导氨基酸按 照特定的顺序排列，形成具有一定功能的蛋白质。
胞吐作用的异常可以导 致多种疾病的发生，如 神经退行性疾病、免疫 系统疾病等。
04
蛋白质合成、修饰及分泌的相互关系
合成与修饰的关系
合成是修饰的前提
蛋白质合成首先需要氨基酸按照特定 的序列连接成多肽链，然后经过翻译 后修饰，如磷酸化、乙酰化等，才能 形成具有生物活性的蛋白质。
翻译后修饰和蛋白质表达这篇文章将介绍翻译后修饰对蛋白质表达的影响包括如何改变蛋白质功能
翻译后修饰和蛋白质表达这篇文章将介绍翻译后修饰对蛋白质表达的影响包括如何改变蛋白质功能翻译后修饰和蛋白质表达蛋白质是生物体内最基本的分子之一，扮演着许多生命活动中重要角色。
蛋白质表达是指蛋白质合成和功能的产生过程，而翻译后修饰则在蛋白质合成后对其进行改变，进一步调节其功能和稳定性。
本文将介绍翻译后修饰对蛋白质表达的影响，以及如何改变蛋白质功能。
一、翻译后修饰对蛋白质表达的影响1. 磷酸化修饰磷酸化是最常见的翻译后修饰方式之一，通过在蛋白质上添加磷酸基团来改变其结构和功能。
磷酸化修饰可以调节蛋白质的活性、稳定性以及与其他分子的相互作用。
磷酸化修饰还参与细胞信号传导、细胞周期调控等生物学过程。
2. 甲基化修饰甲基化修饰是通过在蛋白质上添加甲基基团来改变其功能。
甲基化修饰在染色质结构的调控中扮演重要角色，可以影响基因的转录和表达。
甲基化修饰还参与细胞分化、胚胎发育以及人类疾病的发生发展等过程。
3. 乙酰化修饰乙酰化修饰是指通过在蛋白质上添加乙酰基团来改变其功能。
乙酰化修饰可以调节蛋白质的稳定性、亲和力和活性。
乙酰化修饰还参与细胞代谢、基因转录调控以及细胞衰老等生命过程。
4. 糖基化修饰糖基化修饰是在蛋白质上附加糖分子来改变其功能。
糖基化修饰可以影响蛋白质的稳定性、折叠和识别。
糖基化修饰还参与细胞黏附、免疫应答以及疾病的发生发展等过程。
二、翻译后修饰如何改变蛋白质功能1. 调节蛋白质活性翻译后修饰可以通过改变蛋白质的结构和环境来调节其活性。
例如，磷酸化修饰可以激活或抑制蛋白质的酶活性。
2. 调控蛋白质-蛋白质相互作用翻译后修饰可以改变蛋白质与其他分子之间的相互作用。
例如，乙酰化修饰可以增强蛋白质与DNA之间的亲和力，从而影响转录调控。
3. 调整蛋白质稳定性翻译后修饰可以影响蛋白质的稳定性。
例如，甲基化修饰可以增强蛋白质的稳定性，延长其寿命。
4. 蛋白质定位和转运翻译后修饰可以调整蛋白质在细胞内的定位和转运。
蛋白质的修饰和表达
定向进化的应用
目标酶
所需功能
方法
结果
实施菌种
卡那霉素核苷基 转移酶
枯草杆菌蛋白酶
β-内酰胺酶 对硝基苯酯酶
胸苷激酶 β-半乳糖苷酶 砷酸脱毒途径
热稳定性
作用于有机溶 剂
作用于新底物
有机溶剂中的 底物特异性和
活性 第五特异性 基
因理疗 底物特异性
砷酸抗性
定位诱变+选择 易错PCR+选择
DNA改组+选择 易错PCR+重组
化学修饰影响的条件
• 1、温和的反响条件是防止蛋白质分子变性 的一个必要条件
• 2、pH值得变化：决定了具有潜在反响能力 的基团所处的可反响和不可反响的离子状 态。
• 3、温度：影响活性巯基的微环境 • 4、有机溶剂：试剂需要有机溶剂来助溶，
但有机溶剂可使蛋白质变性。
• 化学方法：
•
• 产生半合成的结构，一个天然多肽与一个 人造〔或化学修饰〕的多肽相缔合
Amps
Tetr
Tetr
Amps
突变 氨苄青霉素抗性的阳性克隆
设计突变体引物 氨苄青霉素抗性修复寡核苷酸
PCR方法介导的定点突变
• 通过改变引物中的某些碱基而改变基因序 列，到达有目的改造蛋白质结构、研究蛋 白质的结构和功能之间的关系的目的
• 取代突变、插入突变、缺失突变
5’ 3’
5’
3’ 3’
• 亚氨代乙酰基：亚氨代乙酰化反响可区分α氨基和ε-氨基。完全亚氨代乙酰化的蛋白质 仍保持在水溶液中的可溶性。
• α-异硫氰酸苯酯在严格控制的条件下可对α氨基进行相当特异性的修饰，而不作用于ε氨基。
羧基的化学修饰
• 由于羧基在水溶液中的化学性知识的蛋白 质分子中的谷氨酸和天冬氨酸的修饰方法 很有限，产物一般是酯类或酰胺类。水溶 性的碳化二亚胺类特定修饰羧基基团，可 在较温和的条件进行
蛋白修饰方式
蛋白修饰方式
蛋白质修饰是指在蛋白质合成后，通过化学反应或酶催化等方式对蛋白质的结构进行改变或功能进行调节的过程。
常见的蛋白质修饰方式包括：
1. 磷酸化（Phosphorylation）：通过添加磷酸基团，改变蛋白质的电荷分布和结构，从而调节蛋白质的活性、互作和定位等。
2. 乙酰化（Acetylation）：在蛋白质N-末端或赖氨酸残基上加入乙酰基，影响蛋白质的稳定性、亚细胞定位和相互作用等。
3. 甲基化（Methylation）：通过在蛋白质上引入甲基基团，调节蛋白质的结构和功能，涉及到细胞分化、基因表达和转录调控等过程。
4. 糖基化（Glycosylation）：在蛋白质上加入糖基，影响蛋白质的稳定性、溶解性和识别性，参与细胞信号传导、免疫应答等生物学过程。
5. 泛素化（Ubiquitination）：通过连接泛素分子到蛋白质上，调节蛋白质的稳定性和降解，参与细胞周期、DNA修复和免疫应答等过程。
这些是常见的蛋白质修饰方式，不同的修饰方式可以对蛋白质的结构和功能产生不同的影响，进而调节细胞内的生物学过程。
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① 识别特定的核苷酸序列；② 在识别序列内或者识别 序列的相邻位置具有特定的切割位点；③ 没有甲基化 修饰酶功能，不需要ATP和SAM 等辅助因子
识别序列： GAATTC 切割位点
G AA T T C C T T AA G
切割位点 切割后 G CTTAA AATTC G
EcorR I 对DNA链的 切割效果及识别序列 的双轴对称性
H2N
C O
CH2
CH NH2
COOH
H2N
C O
CH2 CH2
CH NH2
COOH
天冬酰胺，Asparagine (N), アスパラギン, AAC / AAU
谷酰胺，Glutamine (Gln, Q), グルタミン, CAA / CAG
HO
CH2
CH NH2
COOH
N H
CH2
CH NH2
COOH
3. 遗传信息的传递方向
4. 基因的表达与调控
5'
GC AT AT AT GC T A
3'
G
C
AT GC
TA CG
AT GC
C G
AT
Replication Directions
GC
TA CG
AT GC
5'
3'
5'
3'
DNA
RNA 翻译
蛋白质
遗传信息的传递规则 — 中心法则
GENE
启动子 转录区 终止子
tRNA介导定点参入非天然氨基酸
重组蛋白质的表达 1、重组蛋白质在大肠杆菌中的表达
3. 平端DNA片段的连接
识别序列：GAATTC
切割位点
G AA T T C C T T AA G
切割位点
EcorR I 对DNA 链切割后产生的 粘性末端
切割后
G CTTAA AATTC G
识别序列：GTTAAC
切割位点
G T T AA C
C AA T T G
切割位点
Hpa I 对DNA链切割 后产生的平末端
基于天然蛋白 质结构的设计 蛋白质的 结构基础 蛋白质的 分子设计 蛋白质的 修饰表达
化学修饰 的途径 性质分析 结构测定 分子生物 学的途径 突变蛋白 质的应用
全 新 蛋 白 质 的 设 计
蛋 白 质 工 程 的 内 容 及 实 施 工 程
蛋 白 质 工 程 修 饰 和 表 达 1. 蛋白质修饰的化学途径 2. 蛋白质修饰的分子生物学途径
3. 其他限制性取代
蛋白质片段的嵌合修饰
1. 基于非共价缔合的嵌合蛋白质 2. 基于化学激活型肽键的嵌合蛋白质
3. 基于二硫键的嵌合蛋白质
4. 基于酶连接反应型肽键的嵌合蛋白质 5. 别型的嵌合蛋白质
疏
CH3 CH NH2 COOH
水
CH2 NH2
氨
基
酸
CH3 CH CH3 NH2 CH COOH
骼氨酸，Tyrosine (Y), チロシン UAC / UAU。侧链含酚基
色氨酸 ，Tryptophan (W), トリプトファン, UGG。 侧链含吲哚基
蛋白质修饰改造的途径
1. 化学途径
2. 分子生物学途径 把以重组DNA技术为核心的基因工程作 为手段，来定向地改造天然蛋白质的技 术途径。
蛋白质修饰改造的分子生物学途径 1.基因工程的概述 （1）基因工程的诞生 （2）基因工程的理论基础 （3）基因工程的概念和内容 （4）基因工程的工具酶和载体 （5）基因工程的过程 2.利用基因工程技术定向改造蛋白质的类型 （1）基因的专一性位点突变 （2）基因的区域性定向突变 （3）基因融合和基因剪接 （4）tRNA介导定点参入非天然氨基酸
3. 基于抗生素抗性恢复的突变法
4. 基于去除特定限制酶切位点的突变法
基因的区域性定向突变 盒式突变法（Cassette mutagenesis）: 利用目标基因中具有的适当的限制性酶切位点， 用具有任何长度、任何序列的DNA片断来置换或者取 代目标基因上的一段DNA序列。
基因融合和基因剪接 1. 利用PCR双链重叠延伸法的基因融合和基因剪接 2.利用PCR单链重叠延伸法的基因融合
3. 分子生物学途径所修饰蛋白质的表达
O
H N Arg Pro Val Boc
O Thrombin
NH2 + Arg Pro Val Boc Me
Me
Intensity
Wavelength (nm)
Fluorescent sensing of thrombin-catalysed cleavage reaction of bocval-pro-arg-7-amido- 4-methylcoumarin (AMC), monitored by UVspectrum measurement
COOH 赖氨酸，Lysine (Lys, K), リジン
AAA / AAG
HC N C H
C NH
CH2
CH NH2
COOH
组氨酸，Histidine (His, H), ヒスチジン CAC / CAU。侧链含咪唑基
极性中性氨基酸
HO CH2 CH NH2 COOH
CH3
CH OH
CH NH2
COOH
基因的专一性位点突变
1.普遍使用的DNA快速扩增技术—PCR反应
2.影响专一性位点突变的因素
3.几种专一性位点突变
（1）Kunkel突变法
（2）利用PCR的突变法 （3）基于抗生素抗性恢复的突变法 （4）基于去除特定限制酶切位点的突变法
变性
引物 5' 3' 延伸 引物 5' 3'
退火
DNA快速扩增技术
切割后
GTT CAA AAC TTG
Hind III AmPr
BamH I
Hind III
BamH I
Hind III
Tetr AmPr
切割后
X
切割后
Tetr
Y
X
Y
Y
X
连接后
AmPr
外源DNA片断 的定向克隆
Tetr
重组DNA的转移 1.受体细胞
也称为宿主细胞或基因表达系统。受体细胞为
目的基因的复制、转录、转录后加工、翻译、 翻译后加工及分泌等提供了条件，以便实现目 的基因的表达。 2. 重组DNA分子导入受体细胞 (1)转化（CaCl转化法）；(2)转导；(3)显微注射 (4)高压电穿孔；(5) 其它的导入法。
脯氨酸，Proline (P), プロリン CCA / CCC / CCG / CCU
苯丙氨酸，Phenylalanine (F), フェニルアラニン，UUC / UUU
极性酸性氨基酸
HOOC CH2 CH NH2
天冬氨酸，Aspartic acid (D), アスパラギン酸 GAC / GAU
COOH
引物
3' 5'
PCR反应
引物
3' 5'
循环
影响专一性位点突变的因素 1. DNA模板的制备 2. 寡聚核苷酸突变引物的设计和选择
3. 引物的延伸条件
4. DNA聚合酶的选择
5. dUTP对DNA合成反应的影响
6. 受体细胞对突变体产率的影响
几种专一性位点突变
1. Kunkel突变法
2. 利用PCR的突变法
2. 分类：根据不同分类也不同 (1) 质粒载体、噬菌体载体、病毒 载体、人工组合载体 (2) 克隆载体 、表达载体
(3) 原核细胞表达载体；真核细胞表达载体
基因工程的概念及内容 1. 基因工程的概念
也叫遗传工程，是将外源基因通过体外重组导入 受体细胞，使其在受体内复制、转录、翻译表达 的操作过程。 2. 基因工程的内容 ① 目的基因的分离; ② 重组DNA的制作; ③重组 DNA的转移; ④受体中重组体的筛选; ⑤目的基因 在重组体中的表达; ⑤基因产物的检出 · 分离
CH2
CH
COOH
CH3 CH2
CH CH3
CH NH2
COOH
异亮氨酸，Iloleucine (I), イソロイシン AUA / AUC / AUU
H2 H2 N H H2 H COOH
CH2 CH NH2 COOH
CH3
S
CH2 CH2
CH NH2
COOH
蛋氨酸，Methionine (M), メチオニン，AUG。侧链含甲硫基
蛋白质修饰的化学途径
1. 功能基团的特异性修饰 2. 蛋白质片段的嵌合修饰
功能基团的特异性修饰 1. 多位点取代
2. 限制性取代
3. 次级取代
多位点取代
1. 氨基保护
2. 亚氨代乙酰化 3. 羧基的甲基酯化
4. 巯基的氧化
限制性取代 1. 蛋白质水解酶的限制性取代
2. α异硫氰酸苯酯的限制性取代
② 用于真核生物宿主的载体来自DNA限制性内切酶 1. 内切酶的定义 从细菌或噬菌体中发现的能识别和切断双链DNA分子子内 特殊核苷酸序列的酶。 2. 内切酶的分类： I 类、II类、III类 (1) I 类和III类限制性内切酶的特点： 识别特定的核苷酸序列位点, 没有特定的切割位点 (2) II类限制性内切酶的特点：
G
A
A
T
T
C
3¹ OH
T T
5¹
HOPHO3 O3HPOH A A 5¹ 退火 HO 3¹
C
G
G 3¹ O
5¹ A PHO3
A
T
T
C
O3HP C T T A A 5¹
O 3¹ G
T4DNA连接酶对DNA片断的作用原理