Western Blotting
Western blotting 方法
B 免疫印迹主要步骤1）蛋白提取取相应组织，加入135 μl 无SDS的匀浆缓冲液，于冰浴中，匀浆器15 秒一次，匀两次，再加入15 μl 10%的SDS。
95°C水浴5分钟。
10000g 4°C离心30分钟，取上清。
每管20μl 分装。
2）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白提取液加入1/5体积的6倍上样缓冲液，目标蛋白SPAR、NR2A、NR2B、NR1、PSD-95和Actin使用7.5%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。
浓缩胶使用80V 恒压约1小时，分离胶使用120V 恒压1-2小时。
整个过程电泳槽使用冰浴自来水降温。
3）转膜和封闭取6张与凝胶大小相同的滤纸和1张PVDF膜，100%甲醇浸泡PVDF膜15秒活化。
把滤纸和活化后的PVDF膜一起浸泡到转膜缓冲液中。
将电泳后的凝胶放置于等面积的PVDF膜上，然后夹在滤纸中，滤纸上下各三层，挤走夹层中的气泡。
将夹层物放置于电极之中，膜一面朝向正极，接通电源，25mA 恒流电转移过夜。
带有分离蛋白的PVDF膜放入10%脱脂牛奶TBS-T溶液中，37°C封闭1.5小时。
5）一抗二抗孵育弃去封闭液，PVDF膜装于加有相应的一抗的塑料袋，再用封口机将塑料袋封上，一抗的量为150 μl/cm2，所有抗体均用加入5%BSA和0.02%叠氮钠的TBS-T 稀释，37°C温浴1小时40分钟。
SPAR一抗来自于美国乔治敦大学Pak教授的馈赠，其它抗体均为商业来源，抗体的浓度根据实际情况进行调整，但是同一批实验在预实验条件确定以后，使用相同的抗体浓度。
SPAR抗体（1:400稀释）；NR2B抗体(1:500稀释; Millipore, 美国)；NR2A抗体(1:1,000稀释; Abcam, 英国)；PSD-95抗体(1:4,000稀释; Affinity BioReagents, 美国)；Actin抗体(1:3,000稀释; Santa Cruz Biotechnology, 美国)。
免疫印迹(immunoblotting)
免疫印迹（immunoblotting）免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。
该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。
由于免疫印迹具有SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。
免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。
主要实验步骤如下：1.蛋白质抽提a．实验对象为组织样品，取适量（250～500mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂），匀浆后抽提总蛋白（或核蛋白）。
b.实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加0.1ml～1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂）抽提总蛋白（或核蛋白）。
2.蛋白质定量：按KCTMBCA蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。
3.变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE)将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准分别上样，标准加进第一个孔中，电泳分离蛋白。
4.蛋白质转移到硝酸纤维膜或PVDF膜按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层，30mA恒流条件下，4°C转移过夜。
5.膜的封闭和抗体孵育a．膜在5％BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。
b.封闭过的膜加入一级抗体室温孵育1.5小时，抗原抗体结合。
c.加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准，室温孵育膜1小时。
加入HRP标记的GAPDH抗体可同时检测GAPDH含量。
6.结果检测：化学发光法检测，膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影。
图片扫描保存为电脑文件，并用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。
western blotting(蛋白免疫印迹)
7
蛋白样品的制备
① SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分
子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级和三级结构。
② 强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开 二硫键，破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解 聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结 合形成带负电荷的蛋白质-SDS 胶束。 ③ 蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量 ，而与其形状及所带电荷的性质无关。
电泳缓冲液：pH8.3 Tris- 甘氨酸系统
12
PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel，简称PAG): 单体 丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr) 交联剂 N,N-甲叉双丙烯酰胺 加速剂 N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED) 催化剂 过硫酸铵 三维网状结构的凝胶，该凝胶化学惰性强，具有 一定的机械强度和透明度，是良好的电泳介质， 以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电 泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称 PAGE)。
对 策
5. 抗体浓度过高
35
Thanks！
36
压太高。转膜过程注意降温
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四、SDS-PAGE常见问题
背景太高
原因
1. 2. 3. 4. 膜没有均匀浸湿 膜或者缓冲液污染 封闭不充分 抗体与封闭剂出现交叉 反应
1. 转膜前用100%甲醇将膜完 全浸湿 2. 拿取膜与吸水纸时要戴手 套，更换新鲜转膜缓冲液 3. 检测一抗、二抗与封闭剂 是否有交叉反应 4. 杂交前检测一抗、二抗的 工作浓度
蛋白质免疫印迹技术详解
1
主要内容
一、Western Blot 简介 二、Western Blot 一般流程
Western blotting
Western BlottingWestern Blotting，即免疫印迹，是在蛋白质电泳分离和抗原抗体检测的基础上发展起来的一项检测蛋白质的技术，它结合了SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨率与抗原抗体反应的特异性。
其基本原理是：通过电泳将蛋白组分分开，然后将电泳后凝胶上的蛋白质转移至载体膜上，用封闭试剂封闭载体膜上未吸附蛋白质的区域，最后通过免疫学检测来分析特定的蛋白质表达水平。
免疫印迹克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳后直接在凝胶上进行免疫学分析的弊端，极大地提高了其分辨率和灵敏度，广泛地应用于检测特定基因表达产物的正确性，或者比较表达产物的相对变化量。
实验前准备实验开始前，需准备好实验所需的各种试剂和耗材，主要包括：各种凝胶配置液、各种缓冲液、相关抗体、PVDF膜，赛默飞公司的QSP盒装吸头及Nunc 冰盒，芬兰百得的各个量程单通道移液器等。
主要仪器有：Thermo Scientific 全波长扫描式多功能读数仪、离心机、电泳仪等。
接下来进入实验部分，本实验操作流程为：首先制备蛋白样品，然后进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，将电泳后凝胶上的蛋白质转移至PVDF膜上，接着对含有蛋白质的PVDF膜进行免疫学检测，X-胶片显影定影后，扫描图片，最后用IPWIN6.0软件分析结果。
蛋白样品的制备按1ml裂解液加10 μl的100mmol PMSF，混匀后置于冰上待用。
注意：PMSF 要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合，PMSF是剧毒物质，操作时要谨慎。
蛋白样品一般来源于基因工程菌或特定的真核细胞，本实验以单层贴壁细胞总蛋白的提取为例。
倒掉离心管中的上清，用移液枪吸去残余培养液，注意不要吸走细胞。
每管细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解，要经常上下颠倒离心管。
然后于4℃10000×g离心力离心5min。
将离心后的上清分装转移至干净的离心管中，分装至少两份，放于-80℃保存。
western blotting
Western Blotting摘要：Western Blotting即Western免疫印迹，是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
与Southern或Northern杂交方法类似，但W ......Western Blotting即Western免疫印迹，是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
western blotting 实验试剂1）30%丙烯酰胺/0.8% N,N’-亚甲丙烯酰胺将30克丙烯酰胺和0.8克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中，加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。
0.45μm微孔滤膜过滤除菌，查证该溶液pH应不大于7.0，置棕色瓶中保存。
小心：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。
称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。
可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。
2）4×Tris•Cl/SDS, pH8.8,在300mlH2O中溶解91g Tris碱(1.5mol/L)，用1mol/L调节pH至8.8, 补加H2O 至体积500ml。
用0.45um滤膜过滤溶液，再加入2g SDS[0.4%(w/v)]，于4℃可保存1月。
3）4×Tris•Cl/SDS, pH6.8,在40mlH2O中溶解6.05g Tris碱(0.5mol/L)，用1mol/L调节pH至6.8, 补加H2O至体积100ml。
蛋白质印迹(Western blotting)
蛋白质印迹(Western blotting)一、实验目的：免疫印迹主要用于蛋白质的结构和活性检测等方面，学生掌握与免疫印迹相关的原理和方法，如电泳技术，转膜技术等。
二、实验原理：蛋白质印迹(Western blotting)是将蛋白质转移并固定在化学合成膜的支撑物上，然后以特定的亲和反应、免疫反应或结合反应及显色系统分析此印迹。
蛋白质印迹(免疫印迹)的实验包括5个步骤：1)固定(immobilization)：蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，强度比较差，需要从胶上转移到硝酸纤维素膜上。
2)封闭(blocked)：保持膜上没有特殊抗体结合的场所，使场所处于饱和状态，用以保护特异性抗体结合到膜上,并与蛋白质反应。
3)初级抗体(第一抗体)是特异性的。
4)第二抗体或配体试剂对于初级抗体是特异性结合并作为指示物。
5)适当保温后的酶标记蛋白质区带，产生可见的、不溶解状态的颜色反应。
三、试剂与器材：试剂:(1)人IgG免疫兔的抗血清；(2)辣根过氧化酶一羊抗兔IgG；(3)PBS缓冲液：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，KH2P04 O．24 g，Na2HP04·12H20 2.9 g，加蒸馏水至1000 ml，pH值为7.4；(4)PBS-T缓冲液：PBS缓冲液加O.05 9／6 Tween-20；(5)封闭液：0.5％(质量分数)BSA(用PBS缓冲液配制)；(6)底物溶液：A液：溶解30 mg CN在5 ml甲醇中；B液：溶解10 mg DAB在5 ml甲醇中；C液：分别搅拌A液和B液10～15 rain，直到完全溶解，然后将A液和B液混合，加PBS至50 ml，分成10 ml 一份，不用的可冷冻(一20~C)(下次直接化冻运用)；D液：取10 ml C液，运用时加10 ml 30％(体积分数)H202；(7)转移缓冲液：0.025 mol／L Tris，O．192 mol／L甘氨酸(glycine)，20％(体积分数)甲醇(methan01)，pH值为8.3。
western-blotting
western blotting的原理、操作步骤及意义一。
免疫印迹法免疫印迹法（immunoblotting test，IBT）亦称酶联免疫电转移印斑法（enzyme linked immunoelectrotransfer blot，EITB），因与Southen早先建立的检测核酸的印迹方法Southen blot相类似，亦被称为Western blot。
免疫印迹（western blotting）是在蛋白质电泳分离和抗原抗体检测的基础上发展起来一项检测蛋白质的技术。
它将SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨力与抗原抗体反应的特异性相结合。
典型的印迹实验包括三个步骤①蛋白质的电泳分离；②将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上，用非特异性，非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域；③免疫学检测。
免疫印迹克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳后直接在凝胶上进行免疫学分析的弊端，极大地提高了其利用率、分辨率和灵敏度，使其成为使用最广泛的免疫化学方法之一。
第一阶段为SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。
抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰膪凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。
此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。
第二阶段为电转移。
将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流（1～2A），通电45min 转移即可完成。
此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。
第三阶段为酶免疫定位。
将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。
常用的HRP底物为3，3，—二氨基联苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）。
阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDS-PAGE时加人的分子量标准，确定各组分的分子量。
本法综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段，不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断。
Western Blotting(半干转) 超级详细步骤
Western Blotting Analysis Guide（半干转）Western blotting (半干转)可分为以下9个步骤：一、蛋白的提取A．总蛋白提取1. 将收集的细胞或组织(约0.1 g)从-80°C冰箱取出，按1:10 (w:v)加入冰浴的蛋白裂解液(RIPA)；并加入1/10体积的蛋白酶抑制剂（PMSF）2. 用Dounce 手动匀浆器或电动匀浆器，匀浆细胞或组织（注意：全程冰上操作，每个样品用Dounce 上下抽动相同的次数，电动匀浆器匀浆相同的转速及时间）3. 冰上静置20 min 后，12000 rpm 离心，4 °C，15 min，取上清。
B．核蛋白提取1. 称取100 mg 肝脏冰冻组织置于Dounce 手动匀浆器，加入1 mL 冰浴的核蛋白裂解液A，上下抽动5下（注意：全程冰上操作，不同组织上下抽动需摸条件，匀浆后能看到些许小组织块）2. 将匀浆液倒入1.5 mL 离心管，瞬时离心30 s3. 上清倒入另一1.5 mL 离心管，冰浴5 min4. 3000 rpm 离心，4 °C，10 min，上清倒入另一1.5 mL 离心管收集（此为胞浆蛋白）5. 沉淀加入50 μL 核蛋白裂解液B 吹打，冰浴20 min6. 12000 rpm 离心，4 °C，20 min，将上清吸入0.5 mL 离心管收集（此为核蛋白）。
二、蛋白浓度的测定在碱性条件下，BCA 与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合二个BCA 分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物，最大光吸收强度与蛋白质浓度成正比。
1．BCA标准品和样品的准备：（BCA标准品为5mg/mL）配制1mg/mL的标准品：取10 μL原标准品+ 40 μL PBS缓冲液混匀，浓度为1mg/mL 配制0.25 mg/mL的标准品：取5 μL上述1mg/mL的标准品+ 15 μL PBS缓冲液混匀，浓度为0.25 mg/mL样品用水以1– 5倍稀释，并且将蛋白裂解液用PBS缓冲液按相同的比例稀释作为样品的空白对照（建议样品稀释2倍，不同组织使用不同稀释倍数）。
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Western印迹法这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。
Western使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。
这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。
仪器：高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、—20℃低温冰箱、垂直板电泳转移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。
试剂：单去污剂裂解液、0.01mol/L PBS (pH7.3)、10％分离胶、4％浓缩胶、G250考马斯亮蓝溶液、0.15mol/L NaCl 溶液、2X（5X）SDS上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、10X丽春红染液、封闭液、TBST、TBS、洗脱抗体缓冲液、显影液、定影液、抗体、化学发光试剂。
杂品与耗材：各种规格的吸头、离心管和加样器；各种规格的烧杯、量筒和平皿等玻璃器材；硝酸纤维素膜，乳胶手套，保鲜膜，搪瓷盘（>20×20cm），X-光片夹，X-光片，玻棒长短各一根，计时器，吸水纸试剂配制：（一）母液1、2.0 mol/L Tris·HCl母液Tris (MW121.14) 242.28 g蒸馏水800 ml溶解后，最后用蒸馏水定容至1000 ml，高温灭菌后室温下保存。
（1）1.0 mol/L Tris·HCl2.0 mol/L Tris·HCl母液250 ml蒸馏水200 mlHCl pH约19 ml 6.8约16 ml7.5约10 ml8.0用浓盐酸调pH至接近所需点（见上所示），冷却到室温，再用1 mol/l的盐酸调到所需PH, 最后用蒸馏水定容至500 ml，高温灭菌后室温下保存。
（2）1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8）2.0 mol/L Tris·HCl母液300 ml蒸馏水150 mlHCl pH约8 ml8.8用浓盐酸调pH至接近所需点（见上所示），冷却到室温，再用1 mol/l的盐酸调到所需PH, 最后用蒸馏水定容至500 ml，高温灭菌后室温下保存。
2、40％Acr/Bic（37.5：1）丙稀酰胺（Acr）37.5 g甲叉双丙稀酰胺（Bic） 1 g超纯水至100 ml室温溶解后，过滤，4℃保存。
使用时恢复至室温且无沉淀。
3、10％SDSSDS 10 g蒸馏水至100 ml50℃水浴下溶解，室温保存。
如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
4、10％过硫酸胺（AP）过硫酸胺0.5 g超纯水0.5 ml分装到1.5 ml的指管中，每管为0.5 g，－20℃避光保存，现用现配。
5、20％Tween20Tween20 20 ml蒸馏水至100 ml混匀后4℃保存。
6、1.74 mg/ml (10 mmol/L)PMSFPMSF 0.174 g异丙醇100 ml溶解后，分装于1.5 ml离心管中，－20℃保存。
（二）使用液1、单去污剂裂解液（50 mmol/L Tris·HCl pH8.0，150 mmol/L NaCl，1％TritonX－100，100 μg/ml PMSF）：1 mol/L Tris·HCl（pH8.0） 2.5 mlNaCl 0.438 gTritonX－100 0.5 ml蒸馏水至50 ml混匀后，4℃保存。
使用时，加入PMSF至终浓度为100 μg/ml（0.87 ml裂解液加入1.74 mg/ml PMSF50μl）。
2、0.01 mol/L PBS（ pH 7.2-7.4）NaCl 8 gKCl 0.2 gNa2HPO4 1.44 g (Na2HPO4·12H2O, 1.56 g)KH2PO4 0.24 g800 ml溶解后，调节ph到7.2，最后用蒸馏水定容至1000 ml，高温灭菌后室温下保存。
3、10％分离胶和4％浓缩胶（最后附配制不同体积和浓度凝胶所需各成分的体积表）10％分离胶（10 ml）4％浓缩胶（5 ml）超纯水 4.85 ml 3.16 ml40％Acr/Bic（37.5：1） 2.5 ml 0.5 ml1.5 mol/L Tris·HCl（pH8.8）2.5 ml －0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8）－ 1.26 ml10％SDS 100 μl 50 μl10%AP（过硫酸胺）100 μl 50 μlTEMED 5 μl 5 μl加TEMED后，立即混匀即可灌胶。
4、还原型5XSDS上样缓冲液（0.25 mol/L Tris·HCl pH6.8，0.5 mol/L二硫叔糖醇，10％SDS，0.5％溴酚蓝，50％甘油）0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8） 2.5 ml二硫叔糖醇（DTT，MW154.5）0.39 gSDS 0.5 g溴酚蓝0.025甘油 2.5 ml混匀后，分装于1.5 ml离心管中，-20℃保存，使用前离心3 min。
5、电泳液缓冲液（25 mmol/L Tris，0.25 mol/L甘氨酸，0.1％SDS）Tris（MW121.14） 3.03 g甘氨酸（MW75.07）18.77 gSDS 1 g蒸馏水至1000 ml溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次，重复使用时调PH8.3。
6、转移缓冲液（48 mmol/L Tris，39 mmol/L甘氨酸，0.037％SDS，20％甲醇）甘氨酸（MW75.07） 2.9 gTris（MW121.14） 5.8 gSDS 0.37 g甲醇200 ml蒸馏水至1000 ml溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次, 重复使用时调PH8.3。
7、碧云天生物技术有限公司直接购买，直接用即可8、TBS缓冲液（100 mmol/ L Tris·HCl pH8.0,150 mmol/L NaCl）1 mol/ LTris·HCl（pH8.0）20 mlNaCl 8.8 g蒸馏水至1000 ml9、TBST缓冲液（含0.05％Tween20的TBS缓冲液）20％Tween20 2.5 mlTBS 1000 ml混匀后即可使用，最好现用现配，尽量减少气泡的产生。
10、封闭液（含10％脱脂奶粉的TBST缓冲液）脱脂奶粉（国产，安怡牌）10 gTBST 100 ml充分溶解后4℃保存。
11、抗体按说明书的指示，用TBST稀释或一抗稀释液至一定浓度。
12、购自北京中山公司，为Santa Cruz产品，分A和B两种试剂。
操作步骤：（一）蛋白样品制备（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：a. 蛋白提取前的准备工作：1、预冷PBS（0.01 M pH7.2～7.3）；2、吸水纸；3、冰盒及冰；4、提前开离心机预冷；5、提前配制裂解液。
1 ml裂解液加10 μl PMSF（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合，可适量的增加。
）b. 蛋白提取：1、倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
2、每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS（0.01 M pH7.2～7.3）。
平放轻轻摇动1 min洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
3、按1 ml裂解液加10 μl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。
（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。
）4、每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
5、裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中（提前预冷）。
（整个操作尽量在冰上进行。
）6、于4 ℃下12000 rpm离心20 min。
（提前开离心机预冷）7、将离心后的上清分装转移倒0.5 min的离心管中放于－20℃保存。
或者直接加5×的SDS上样缓冲液，沸水煮沸5分钟，变性4度保存。
（2）组织中总蛋白的提取：1、将少量组织块置于1～2 ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
2、加400 μl单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。
然后置于冰上。
3、几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。
4、裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5 ml离心管中，然后在4℃下12000 rpm离心5 min，取上清分装于0.5 ml离心管中并置于－20℃保存。
（3）加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。
以下是培养液中细胞总蛋白的提取：1、将培养液倒至15 ml离心管中，于2500 rpm离心5 min。
2、弃上清，加入4 ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500 rpm离心5 min。
弃上清后用PBS重复洗涤一次。
3、用枪洗干上清后，加100 μl裂解液（含PMSF）冰上裂解30 min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。
4、将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000 rpm离心5 min，取上清分装于0.5 ml离心管中并置于－20℃保存。
（二）蛋白含量的测定(按碧云天BCA试剂盒说明进行)（1）制作标准曲线1、从－20 ℃取出0.5 mg/ml BSA，室温融化后，备用。
2、从4 ℃取出A,B液按50:1的体积比混匀。
3、新接双蒸水。
4、干净的96孔板。
6、混匀后，37℃放置30 min。
在生物分光光度计（Bio－Photometer，Eppentoff）上比色分析。
7、根据标准曲线计算样品蛋白含量（三）SDS－PAGE电泳（1）从冰箱中取出制胶试剂室温放置，使其恢复至室温，10%SDS室温放置也会沉淀，放50℃水浴锅中，溶解。
（2）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后, 装上玻璃板。
防止指纹留在玻璃板上。
（3）灌胶与上样1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上(操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
），灌入双蒸水，试看是否漏胶，反复三次相当于冲洗玻璃板，再灌入无水酒精一次，倒掉酒精，再灌入双蒸水。
2、按前面方法配10％分离胶和4%的浓缩胶（加入前三种试剂），倒掉玻璃板内的水，将残留的水吸干。
3、加入APS和TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，玻璃板倾斜，用15 ml指管沿玻璃倒入，待胶面升到指定高度时即可(7.5 ml)。
然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。
（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。