Westernblotting溶液配制
WesternBlot相关试剂配方及详细实验步骤
WesternBlot相关试剂配方及详细实验步骤Western Blot详细实验步骤及试剂配方1. 溶液配置1.1 5×SDS-PAGE上样缓冲液（Loading buffer）药品用量1 M Tris-HCl (PH=6.8) 1.25 mLSDS 0.5 gBPB（溴酚蓝，有毒）25 mg甘油 2.5 mL去离子水up to 5 mL分装至1.5 mL离心管中，每管500 μL，室温保存，使用前每管加入25 μL的β-巯基乙醇。
1.2 10×SDS-PAGE电泳缓冲液（Running buffer 母液）药品用量Tris 30.3 gGlycine (甘氨酸) 144.2 gSDS 10 gddH2O up to 1 L室温保存即可，使用时稀释为1×的工作液，可回收反复使用4~5次。
1.3 Tris-HCl缓冲液（1）1.5 M Tris-HCl (PH=8.8)→制分离胶Tris (MW: 121.14) 45.43 gH2O up to 250 mL浓盐酸调PH 8.8（2）1.0 M Tris-HCl (PH=6.8)→制浓缩胶Tris (MW: 121.14) 30.29 gH2O up to 250 mL浓盐酸调PH 6.8二者高压灭菌后，置于室温保存即可。
1.4 10% SDS (十二烷基硫酸钠)SDS 10 gddH2O up to 100 mL室温保存即可。
1.5 10% AP (过硫酸铵)→1.5 mL 离心管配制过硫酸铵（刺激性，腐蚀性） 0.1 g超纯水up to 1 mL混匀后，锡箔纸包住，避光处理，置于-20℃保存。
1.6 30% 丙烯酰胺溶液丙烯酰胺 150 g甲叉双丙烯酰胺 4 gMilli-Q水 30 mL滤纸过滤，Milli-Q水定容至500 mL，装入棕色瓶子中，4℃保存。
1.7 10×转膜缓冲液(Trans buffer 母液)Tris (MW: 121.14) 30.3 gGlycine (甘氨酸) 144 g去离子水 up to 1 L室温保存即可，其1×的工作液配制为：100 mL母液+200 mL甲醇（有毒）+700 mL水。
Westernblot试剂配制及操作流程
Westernblot试剂配制及操作流程试剂配制：1.电泳缓冲液：a. 准备1×蛋氨酸－甘氨酸缓冲液（Tris-Glycine缓冲液）：每一升缓冲液中加入30.3g Tris base、288g glycine，并调节pH至8.3±0.1b. 准备3×SDS-凝胶缓冲液：每一升缓冲液中加入30g Tris base、144g glycine、10g SDS，并调节pH至8.3±0.12.蛋白提取缓冲液：a. 准备RIPA缓冲液：每一升缓冲液中加入5g Tris base、15g NaCl、5g sodium deoxycholate、1g NP-40，并将pH调节至7.4b.按需添加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。
操作流程：1.样品制备：a. 收集细胞或组织样品，加入适量的蛋白提取缓冲液，并使用超声波细胞破碎仪或玻璃Dounce破碎器破碎细胞，释放蛋白。
b.在4℃下离心细胞提取物，收集上清液，并在离心后尽快使用或存储在-80℃的冰箱中。
2.SDS-凝胶制备：a. 准备15%缩胆凝胶：加入7.5mL 30%丙烯酰胺、10mL 10×SDS-凝胶缓冲液、7.5mL去离子水和20uL 10%Tetramethylethylenediamine (TEMED)，混合均匀。
b.将混合液倒入立方形凝胶模具中，插入两根不锈钢导电丝作为电极，并进一步注入10%胶解剂。
c.待凝胶定形后，用1×蛋氨酸－甘氨酸缓冲液冲洗凝胶表面。
3.蛋白电泳：a.加载样品：将样品加入离心管中，加入1×电泳缓冲液以使样品浓度均匀。
b. 加载样品：将样品加入凝胶孔中，通常每孔加入20-30ug样品。
c.进行电泳：将装有凝胶的电泳槽放入电泳缓冲液中，将蛋白电泳至凝胶顶部。
d.转移凝胶：根据需求选择湿式或半湿式转印方式，将蛋白转移到PVDF或NC膜上。
4.免疫印迹：a.封闭膜：将转印膜放入封闭溶液中（如5%脱脂奶粉或3%BSA）封闭非特异性结合位点。
western-blot 通用配方
1.Western Blotting 相关溶液及抗体1)转膜缓冲液（running buffer）(10×)(1L)Tris 30.3g甘氨酸144g不调pH转膜工作液（1×)(1L)（现配现用）(10×)转膜缓冲液（running buffer）100ml无水乙醇100ml水800ml2)TBS 缓冲液(5×)（1L）Tris-HCl 12.15gNaCl 146.4g用36-37%浓盐酸调节pH值至约7.4（约5ml浓盐酸，pH试纸检测即可）TBST：TBS+Tween-20 0.1%（1ml for 1L）3) 封闭液TBST 缓冲液中加入5%脱脂奶粉或者(3% Gelatine)4）Western Blotting 第一抗体适合于自己蛋白的抗体5）Western Blotting 第二抗体辣根过氧化物酶-羊抗兔IgG/(羊抗鼠IgG)4.实验步骤（1）SDS-PAGE 电泳分离蛋白质：(浓缩胶70V，30-40min；分离胶120V，1h)5×loading buffer: 4mlddH2O 1.76ml 1M Tris-HCl pH 6.8 0.24ml甘油1ml 10%（w/v）SDS 0.8mlß-巯基乙醇0.2ml（2）将4 张滤纸剪成与海棉大小一致的方形（3）配（1×)转膜工作液(10×)转膜缓冲液（running buffer）80ml无水乙醇80ml水640ml800ml（4）将胶泡在（1×)转膜工作液中（防止胶干掉，最好不要用水，水泡胶会涨）（5）用尺子量胶大小，裁PDVF膜（不要用手蹭膜，手上有蛋白）（6）PDVF膜先在无水乙醇中泡约1min,然后泡到（1×)转膜工作液中。
（PDVF膜为疏水性的，先在乙醇中泡会使其亲水性好）（7）将海绵和滤纸在水中浸湿，然后按照一下顺序(整个操作过程中保证膜不能干)：白板—海绵—两层滤纸--PDVF膜（靠正极）--胶（靠负极）（用小试管排气泡）--两层滤纸—海绵（用小试管排气泡）--夹住—放入胶槽中（白板靠红，黑板靠黑，保证电极方向不要错）--在胶槽中加入转子—倒入（1×)转膜工作液—在胶槽中放入冰袋—80V～100V 恒压，60min(该条件可以转移25kD～90kD的蛋白)(8)封闭：在封闭液中室温，摇1h或者4℃静置过夜。
Westernblot所需溶液的配制
WB所需溶液的配制1Tris-甘氨酸电泳缓冲液(Running buffer) 5×Tris base 15.14gGlycine(甘氨酸) 72.0gSDS 5.0g蒸馏水溶解至1000ml5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：15.1g Tris碱和72ｇ甘氨酸，5ｇ电泳级的SDS，双蒸水定容至1L，pH值为8.3。
使用前，将5×稀释到1×：取200ml 5×，定容到1000ml。
2转膜缓冲液（Sending buffer）（现用现配）1000 ml 1500 mlGlycine(甘氨酸) 14.413 g 21.6 g1.0 M Tris.HCl (pH8.3) 25 ml 37.5ml10% SDS 1 ml 1.5 ml甲醇(methanol) 200 ml 300 ml蒸馏水溶解至1000 ml 溶解至1500 ml必须新鲜配置，因为甘氨酸溶于水后易分解。
小片段可不加SDS。
310% SDS配置电泳级十二烷基硫酸钠也叫SDS（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS,C12H25O4NaS）溶液: 10g SDS，100ml去离子水配制，50-68度搅拌溶解，浓盐酸调pH到7.2，室温保存。
4Tris.HCl的配置1.0M Tris.HCl (pH8.8) Tris 30.28 g 加入到250ml水中浓盐酸调pH到8.81.5 M Tris.HCl (pH8.8) Tris 45.43 g 加入到250ml水中浓盐酸调pH到8.81.0 M Tris.HCl (pH6.8) Tris 30.28 g 加入到250ml水中浓盐酸调pH到6.81.0 M Tris.HCl (pH8.3) Tris 30.28 g 加入到250ml水中浓盐酸调pH到8.3，需要大约8毫升。
注：Tris的分子量是121.4. 4度储存。
5 10% APS (Ammonium persulfate ; 过硫酸铵)的配置称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，负30度冻存。
weston blot相关试剂配方-机能实验室
Western-Blot试剂配制1母液1.1 1.0mol/L Tris•HClTris (MW121.14) 30.29g、蒸馏水200ml溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
1.2 1.74mg/ml (10mmol/L)PMSFPMSF 0.174g、异丙醇100ml溶解后，分装于1.5ml离心管中，-20℃保存。
1.3 0.2mol/L NaH2PO4NaH2PO4（MW119.98）12g蒸馏水至500ml溶解后，高压灭菌，室温保存。
1.4 0.2mol/L Na2HPO4Na2HPO •12H2O（MW 358.14）71.6g，蒸馏水至1000ml，溶解后，高压灭菌，室温保存。
1.5 10％SDSSDS 10g，蒸馏水至100ml，50℃水浴下溶解，室温保存。
如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
1.6 10％过硫酸胺（AP）过硫酸胺0.1g，超纯水 1.0ml，溶解后，4℃保存，保存时间为1周。
时加入超纯水即可）1.7 1.5mol/L Tris•HCl（pH8.8）Tris (MW121.14) 45.43g，超纯水200ml，溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。
1.8 0.5mol/L Tris•HCl（pH6.8）Tris (MW121.14) 15.14g，超纯水200ml，溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。
1.9 40％Acr/Bic（37.5:1）丙稀酰胺（Acr）37.5g、甲叉双丙稀酰胺（Bic）1g，超纯水至100ml溶解后4℃保存。
使用时恢复至室温且无沉淀。
1.10 30％Acr/Bic（29:1）丙稀酰胺（Acr）29g、甲叉双丙稀酰胺（Bic）1g，超纯水至100ml溶解后4℃保存。
使用时恢复至室温且无沉淀。
1.11 20％Tween20Tween20 20ml，蒸馏水至100ml，混匀后4℃保存。
westernblotting试剂配制
westernblotting试剂配制Western Blot试剂配制Lower buffer（PH8.8）Tris base 18.15g⽤1mol/LHCl 调PH⾄8.8加ddH2O完全溶解后定容⾄100mlUpper buffer （PH6.8）Tris base 12.1g⽤1mol/LHCl 调PH⾄6.8加ddH2O完全溶解后定容⾄100ml10%SDS SDS 粉末10g加ddH2O完全溶解后定容⾄100ml10%AP(4℃保存)过硫酸铵固体0.1g1ml ddH2O30%Acr/Bic: 丙烯酰胺29g甲叉双丙烯酰胺1g加ddH2O完全溶解后定容⾄100ml5%脱脂奶粉（封闭液）脱脂奶粉5g加TBST完全溶解后定容⾄100ml5×电泳缓冲液 Tris Base 15.1g⽢氨酸94gSDS 5g加ddH2O完全溶解后定容⾄1L1×电泳缓冲液5×电泳缓冲液100ml400ml ddH2O1×转移缓冲液Tris 5.8g（半⼲转）⽢氨酸2.9gSDS 0.37g---可以少加甲醇200ml(有毒，最后加)----可以200-250之间，⽤途是固定作⽤加ddH2O完全溶解后定容⾄1L1×TBS缓冲液 TBS缓冲液粉末⼀包加ddH2O完全溶解后定容⾄2LTBST缓冲液500ml 1×TBS缓冲液250ul Tween20显影液⼤包5.2g⼩包0.6g加ddH2O完全溶解后定容⾄100ml定影液⼤包6.6g⼩包1.9g加ddH2O完全溶解后定容⾄100ml脱⾊液甲醇30mlddH2O60ml冰⼄酸10ml六楼(湿转技术) 10X转移缓冲液：Tris 30.26克⽢氨酸151克1000ml双蒸⽔湿转技术; 1X转移缓冲液：10X转移缓冲液100ml⽆⽔甲醇200ml 1000ml双蒸⽔SDS-PAGE蛋⽩电泳胶配制Reagents Separating GEL(12%) Stacking GEL(4%) Distilled water 3.2 ml 2.4mlLower buffer 2.6ml(1.5m PH8.8) ----Upper buffer10% SDS Acrylamide/Bis(30%) 10%Ap(fresh)TEMED----100ul4.0ml100ul5ul1ml(PH6.8)40ul0.536ml20ul4ulTotal 10ml 4ml注意：Acrylamide/Bis(30%)是调节配制胶的浓度，据柳鹏讲10ml体系中1.5mol PH8.8的Lower buffer固定在2.5ml，⽽Distilled water 和Acrylamide/Bis(30%)之和等于7.3ml。
Westernblot所需溶液的配制
.WB所需溶液的配制5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：15.1g Tris碱和72ｇ甘氨酸，5ｇ电泳级的SDS，双蒸水定容至1L，pH值为8.3。
使用前，将5×稀释到1×：取200ml 5×，定容到1000ml。
必须新鲜配置，因为甘氨酸溶于水后易分解。
小片段可不加SDS。
310% SDS配置电泳级十二烷基硫酸钠也叫SDS（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS,CHONaS）41225溶液: 10g SDS，100ml去离子水配制，50-68度搅拌溶解，浓盐酸调pH到7.2，室温保存。
注：Tris的分子量是121.4. 4度储存。
5 10% APS (Ammonium persulfate ; )的配置过硫酸铵称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，负30度冻存。
使用时尽量现配现用，短期内实验频繁可多配。
4度存则两周内用完，最多不能超过一个月。
负20度可存两个月，但一旦解冻后尽快用完。
加HCl调pH到7.6，室温储存。
1 / 3.SDS-PAGE加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris1:21:1或H2O 32ml混匀备用。
按3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，12.8ml，巯基乙醇，总蛋20-25ul3min比例与蛋白质样品混nonfat dried milk 或者0.01% antifoam A (Sigma)0.01%(v/v) sodium azide丽春红溶液：12 10毫升。
微升冰醋酸，加入0.05克丽春红，用水稀释至100 毫升）（10004%1）多聚甲醛（PFA）的配制微升氢氧化钠，全300毫升水，60度搅拌溶解，加入40克多聚甲醛，加入800毫升。
调1000PBS，加水定容到度，再加入100毫升的10×部溶解后冷却到4 4。
通风橱过滤，度保存。
pH到7.2-7.4步骤：；至7.4pH0.2%NaOHEDTA,10-20首先加毫升的水溶解再加入使溶解，再调应溶解一个再加另外一个；然后分别加入其他成分，去氧胆酸钠开盖后会飞出，2 / 3.戴口罩。
Western blotting溶液配置以及操作
Western blotting溶液配置：1.裂解液的配置（可以直接买）50mmol/L Tris-CL PH=8.0150mmol/L Nacl0.1% SDS100μg/ml PMSF（可以直接买）1% NP-401%Triton X-1002.10*TBST 1L的配置：（需要）1MTris-base 50ml5M Nacl 30mlTween-20 1ml去离子水800ML 调节PH至7.6 定容至1000ML 3.转膜缓冲液1L 的配置：（需要）甘氨酸14.4gTris-base 3.03g甲醇200ml 加去离子水定容至1L4. 10%脱脂奶粉溶液（安怡）5. 分离胶（10ml）水 3.3ml30%Arc+Bis 4ml分离胶缓冲液 2.5ml10%SDS 0.1ml10%AP 0.1mlTEMED 0.008ml6.浓缩胶(5ml)水 3.4ml30%Arc+Bis 0.83ml浓缩胶缓冲液0.63ml10%SDS 0.05ml10%AP 0.05mlTEMED 0.01ml7.电泳缓冲液(10*)终浓度1倍10倍Tris base 2.5mM 15.1g 60.4gGlycine 192mM 72.1g 288.4gSDS 0.1% 5.0g 20g去离子水到5L 到2L8. 30%Arc+Bis溶液(29gArc +1gBis)/100ml 一般配500ml,过滤,用锡纸避光,4度保存9. 分离胶缓冲液:Tris-HCL PH=8.8 1.5mol/LTris-base: 1.5*121/1000ml=18.15g/100ml 调PH值到8.8,定容到100ml10.浓缩胶缓冲液Tris-HCL PH=6.8 1mol/LTris-base 1*121/1000ml=12.1/100ml 调PH到6.8,定容到100ml 11.10%SDS10gSDS加去离子水到100ml12.10%AP0.1gAP 加去离子水到1ml提取及测定蛋白浓度1．加裂解液，按照1：5（重量/体积），1g组织加5ml裂解液2．冰上匀浆6000rpm*5s*5次3．超声300w 4秒，间隔14秒，共6次（保护复位，工作复位）4．静置1小时5．15000rpm离心15分钟，4度，取上清，测蛋白含量Braford法测浓度（单位：μl）管号0 1 2 3 4 5 Braford 1000 1000 1000 1000 1000 1000 BAS 0 2.5 5 10 15 20 NACL 100 97.5 95 90 85 801．做标准曲线。
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Western Blotting 所用溶液
1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) 500 ml
Tris-base 90.85 g
ddH2O 400 ml
用浓盐酸调pH 至8.8
定容至500 ml，高压灭菌，室温保存。
1 M Tris-HCl (pH 6.8) 500 ml
Tris-base 60.57 g
ddH2O 400 ml
用浓盐酸调pH 至6.8
定容至500 ml，高压灭菌，室温保存。
10%(w/v) AP (过硫酸铵) 20 ml
AP 2g
ddH2O 20 ml
分装到1.5ml离心管，1ml/tube，-20°C保存
10%(w/v) SDS (十二烷基硫酸钠) 100 ml
SDS 10g
ddH2O 90 ml
用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解，用水定容至100ml，室温保存。
10x Running Buffer (电泳缓冲液) 500 ml
1X Running Buffer?: 0.025M Tris, 0.25M Glycine, 0.1% SDS
10X Running Buffer?: 0.25M Tris, 2.5M Glycine, 1% SDS
配方：Tris 15.1 g
甘氨酸93.75 g
SDS 5.0 g
ddH2O 400ml，搅拌直至完全溶解后，定容至500ml，室温保存。
电泳时10x Running Buffer取100ml，加ddH2O 900ml，定容至1L，配成1X Running Buffer.
1X Running Buffer可反复使用4-5次。
10x Transfer Buffer (转膜缓冲液) 500 ml
1X Transfer Buffer: 0.025M Tris, 0.192M Glycine, 0.037% SDS，20% Methanol
10X Transfer Buffer: 0.25M Tris, 1.92M Glycine, 0.37% SDS
配方：Tris 15.1 g
甘氨酸72 g
SDS 1.85 g
ddH2O 400ml，搅拌直至完全溶解后，定容至500ml，4°C保存。
转膜时10x Transfer Buffer取100ml，加ddH2O 500ml，Methanol 200ml，再定容至1L，配
成1X Transfer Buffer，冷却至4°C。
湿转法1X Running Buffer可反复使用2-3次。
10x TBS (缓冲液) 1L （20 mM Tris-HCl, pH 7.5）
Tris 24.23 g
NaCl 80.06 g
ddH2O 800ml
pH to 7.5 with HCl.
Top up to 1 L.
高压灭菌，室温保存。
TBST
For 1 L: 100 ml of 10x TBS + 900 ml ddH2O + 1ml Tween20。