Westernblotting溶液配制
Western Blotting 所用溶液
1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) 500 ml
Tris-base 90.85 g
ddH2O 400 ml
用浓盐酸调pH 至8.8
定容至500 ml，高压灭菌，室温保存。
1 M Tris-HCl (pH 6.8) 500 ml
Tris-base 60.57 g
ddH2O 400 ml
用浓盐酸调pH 至6.8
定容至500 ml，高压灭菌，室温保存。
10%(w/v) AP (过硫酸铵) 20 ml
AP 2g
ddH2O 20 ml
分装到1.5ml离心管，1ml/tube，-20°C保存
10%(w/v) SDS (十二烷基硫酸钠) 100 ml
SDS 10g
ddH2O 90 ml
用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解，用水定容至100ml，室温保存。
10x Running Buffer (电泳缓冲液) 500 ml
1X Running Buffer?: 0.025M Tris, 0.25M Glycine, 0.1% SDS
10X Running Buffer?: 0.25M Tris, 2.5M Glycine, 1% SDS
配方：Tris 15.1 g
甘氨酸93.75 g
SDS 5.0 g
ddH2O 400ml，搅拌直至完全溶解后，定容至500ml，室温保存。
电泳时10x Running Buffer取100ml，加ddH2O 900ml，定容至1L，配成1X Running Buffer.
1X Running Buffer可反复使用4-5次。
10x Transfer Buffer (转膜缓冲液) 500 ml
1X Transfer Buffer: 0.025M Tris, 0.192M Glycine, 0.037% SDS，20% Methanol
10X Transfer Buffer: 0.25M Tris, 1.92M Glycine, 0.37% SDS
配方：Tris 15.1 g
甘氨酸72 g
SDS 1.85 g
ddH2O 400ml，搅拌直至完全溶解后，定容至500ml，4°C保存。
转膜时10x Transfer Buffer取100ml，加ddH2O 500ml，Methanol 200ml，再定容至1L，配
成1X Transfer Buffer，冷却至4°C。
湿转法1X Running Buffer可反复使用2-3次。
10x TBS (缓冲液) 1L （20 mM Tris-HCl, pH 7.5）
Tris 24.23 g
NaCl 80.06 g
ddH2O 800ml
pH to 7.5 with HCl.
Top up to 1 L.
高压灭菌，室温保存。
TBST
For 1 L: 100 ml of 10x TBS + 900 ml ddH2O + 1ml Tween20。
WesternBlot相关试剂配方及详细实验步骤
WesternBlot相关试剂配方及详细实验步骤Western Blot详细实验步骤及试剂配方1. 溶液配置1.1 5×SDS-PAGE上样缓冲液（Loading buffer）药品用量1 M Tris-HCl (PH=6.8) 1.25 mLSDS 0.5 gBPB（溴酚蓝，有毒）25 mg甘油 2.5 mL去离子水up to 5 mL分装至1.5 mL离心管中，每管500 μL，室温保存，使用前每管加入25 μL的β-巯基乙醇。
1.2 10×SDS-PAGE电泳缓冲液（Running buffer 母液）药品用量Tris 30.3 gGlycine (甘氨酸) 144.2 gSDS 10 gddH2O up to 1 L室温保存即可，使用时稀释为1×的工作液，可回收反复使用4~5次。
1.3 Tris-HCl缓冲液（1）1.5 M Tris-HCl (PH=8.8)→制分离胶Tris (MW: 121.14) 45.43 gH2O up to 250 mL浓盐酸调PH 8.8（2）1.0 M Tris-HCl (PH=6.8)→制浓缩胶Tris (MW: 121.14) 30.29 gH2O up to 250 mL浓盐酸调PH 6.8二者高压灭菌后，置于室温保存即可。
1.4 10% SDS (十二烷基硫酸钠)SDS 10 gddH2O up to 100 mL室温保存即可。
1.5 10% AP (过硫酸铵)→1.5 mL 离心管配制过硫酸铵（刺激性，腐蚀性） 0.1 g超纯水up to 1 mL混匀后，锡箔纸包住，避光处理，置于-20℃保存。
1.6 30% 丙烯酰胺溶液丙烯酰胺 150 g甲叉双丙烯酰胺 4 gMilli-Q水 30 mL滤纸过滤，Milli-Q水定容至500 mL，装入棕色瓶子中，4℃保存。
1.7 10×转膜缓冲液(Trans buffer 母液)Tris (MW: 121.14) 30.3 gGlycine (甘氨酸) 144 g去离子水 up to 1 L室温保存即可，其1×的工作液配制为：100 mL母液+200 mL甲醇（有毒）+700 mL水。
Westernblot试剂配制及操作流程
Westernblot试剂配制及操作流程试剂配制：1.电泳缓冲液：a. 准备1×蛋氨酸－甘氨酸缓冲液（Tris-Glycine缓冲液）：每一升缓冲液中加入30.3g Tris base、288g glycine，并调节pH至8.3±0.1b. 准备3×SDS-凝胶缓冲液：每一升缓冲液中加入30g Tris base、144g glycine、10g SDS，并调节pH至8.3±0.12.蛋白提取缓冲液：a. 准备RIPA缓冲液：每一升缓冲液中加入5g Tris base、15g NaCl、5g sodium deoxycholate、1g NP-40，并将pH调节至7.4b.按需添加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。
操作流程：1.样品制备：a. 收集细胞或组织样品，加入适量的蛋白提取缓冲液，并使用超声波细胞破碎仪或玻璃Dounce破碎器破碎细胞，释放蛋白。
b.在4℃下离心细胞提取物，收集上清液，并在离心后尽快使用或存储在-80℃的冰箱中。
2.SDS-凝胶制备：a. 准备15%缩胆凝胶：加入7.5mL 30%丙烯酰胺、10mL 10×SDS-凝胶缓冲液、7.5mL去离子水和20uL 10%Tetramethylethylenediamine (TEMED)，混合均匀。
b.将混合液倒入立方形凝胶模具中，插入两根不锈钢导电丝作为电极，并进一步注入10%胶解剂。
c.待凝胶定形后，用1×蛋氨酸－甘氨酸缓冲液冲洗凝胶表面。
3.蛋白电泳：a.加载样品：将样品加入离心管中，加入1×电泳缓冲液以使样品浓度均匀。
b. 加载样品：将样品加入凝胶孔中，通常每孔加入20-30ug样品。
c.进行电泳：将装有凝胶的电泳槽放入电泳缓冲液中，将蛋白电泳至凝胶顶部。
d.转移凝胶：根据需求选择湿式或半湿式转印方式，将蛋白转移到PVDF或NC膜上。
4.免疫印迹：a.封闭膜：将转印膜放入封闭溶液中（如5%脱脂奶粉或3%BSA）封闭非特异性结合位点。
western-blot 通用配方
1.Western Blotting 相关溶液及抗体1)转膜缓冲液（running buffer）(10×)(1L)Tris 30.3g甘氨酸144g不调pH转膜工作液（1×)(1L)（现配现用）(10×)转膜缓冲液（running buffer）100ml无水乙醇100ml水800ml2)TBS 缓冲液(5×)（1L）Tris-HCl 12.15gNaCl 146.4g用36-37%浓盐酸调节pH值至约7.4（约5ml浓盐酸，pH试纸检测即可）TBST：TBS+Tween-20 0.1%（1ml for 1L）3) 封闭液TBST 缓冲液中加入5%脱脂奶粉或者(3% Gelatine)4）Western Blotting 第一抗体适合于自己蛋白的抗体5）Western Blotting 第二抗体辣根过氧化物酶-羊抗兔IgG/(羊抗鼠IgG)4.实验步骤（1）SDS-PAGE 电泳分离蛋白质：(浓缩胶70V，30-40min；分离胶120V，1h)5×loading buffer: 4mlddH2O 1.76ml 1M Tris-HCl pH 6.8 0.24ml甘油1ml 10%（w/v）SDS 0.8mlß-巯基乙醇0.2ml（2）将4 张滤纸剪成与海棉大小一致的方形（3）配（1×)转膜工作液(10×)转膜缓冲液（running buffer）80ml无水乙醇80ml水640ml800ml（4）将胶泡在（1×)转膜工作液中（防止胶干掉，最好不要用水，水泡胶会涨）（5）用尺子量胶大小，裁PDVF膜（不要用手蹭膜，手上有蛋白）（6）PDVF膜先在无水乙醇中泡约1min,然后泡到（1×)转膜工作液中。
（PDVF膜为疏水性的，先在乙醇中泡会使其亲水性好）（7）将海绵和滤纸在水中浸湿，然后按照一下顺序(整个操作过程中保证膜不能干)：白板—海绵—两层滤纸--PDVF膜（靠正极）--胶（靠负极）（用小试管排气泡）--两层滤纸—海绵（用小试管排气泡）--夹住—放入胶槽中（白板靠红，黑板靠黑，保证电极方向不要错）--在胶槽中加入转子—倒入（1×)转膜工作液—在胶槽中放入冰袋—80V～100V 恒压，60min(该条件可以转移25kD～90kD的蛋白)(8)封闭：在封闭液中室温，摇1h或者4℃静置过夜。
Westernblot所需溶液的配制
WB所需溶液的配制1Tris-甘氨酸电泳缓冲液(Running buffer) 5×Tris base 15.14gGlycine(甘氨酸) 72.0gSDS 5.0g蒸馏水溶解至1000ml5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：15.1g Tris碱和72ｇ甘氨酸，5ｇ电泳级的SDS，双蒸水定容至1L，pH值为8.3。
使用前，将5×稀释到1×：取200ml 5×，定容到1000ml。
2转膜缓冲液（Sending buffer）（现用现配）1000 ml 1500 mlGlycine(甘氨酸) 14.413 g 21.6 g1.0 M Tris.HCl (pH8.3) 25 ml 37.5ml10% SDS 1 ml 1.5 ml甲醇(methanol) 200 ml 300 ml蒸馏水溶解至1000 ml 溶解至1500 ml必须新鲜配置，因为甘氨酸溶于水后易分解。
小片段可不加SDS。
310% SDS配置电泳级十二烷基硫酸钠也叫SDS（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS,C12H25O4NaS）溶液: 10g SDS，100ml去离子水配制，50-68度搅拌溶解，浓盐酸调pH到7.2，室温保存。
4Tris.HCl的配置1.0M Tris.HCl (pH8.8) Tris 30.28 g 加入到250ml水中浓盐酸调pH到8.81.5 M Tris.HCl (pH8.8) Tris 45.43 g 加入到250ml水中浓盐酸调pH到8.81.0 M Tris.HCl (pH6.8) Tris 30.28 g 加入到250ml水中浓盐酸调pH到6.81.0 M Tris.HCl (pH8.3) Tris 30.28 g 加入到250ml水中浓盐酸调pH到8.3，需要大约8毫升。
注：Tris的分子量是121.4. 4度储存。
5 10% APS (Ammonium persulfate ; 过硫酸铵)的配置称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，负30度冻存。
weston blot相关试剂配方-机能实验室
Western-Blot试剂配制1母液1.1 1.0mol/L Tris•HClTris (MW121.14) 30.29g、蒸馏水200ml溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
1.2 1.74mg/ml (10mmol/L)PMSFPMSF 0.174g、异丙醇100ml溶解后，分装于1.5ml离心管中，-20℃保存。
1.3 0.2mol/L NaH2PO4NaH2PO4（MW119.98）12g蒸馏水至500ml溶解后，高压灭菌，室温保存。
1.4 0.2mol/L Na2HPO4Na2HPO •12H2O（MW 358.14）71.6g，蒸馏水至1000ml，溶解后，高压灭菌，室温保存。
1.5 10％SDSSDS 10g，蒸馏水至100ml，50℃水浴下溶解，室温保存。
如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
1.6 10％过硫酸胺（AP）过硫酸胺0.1g，超纯水 1.0ml，溶解后，4℃保存，保存时间为1周。
时加入超纯水即可）1.7 1.5mol/L Tris•HCl（pH8.8）Tris (MW121.14) 45.43g，超纯水200ml，溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。
1.8 0.5mol/L Tris•HCl（pH6.8）Tris (MW121.14) 15.14g，超纯水200ml，溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。
1.9 40％Acr/Bic（37.5:1）丙稀酰胺（Acr）37.5g、甲叉双丙稀酰胺（Bic）1g，超纯水至100ml溶解后4℃保存。
使用时恢复至室温且无沉淀。
1.10 30％Acr/Bic（29:1）丙稀酰胺（Acr）29g、甲叉双丙稀酰胺（Bic）1g，超纯水至100ml溶解后4℃保存。
使用时恢复至室温且无沉淀。
1.11 20％Tween20Tween20 20ml，蒸馏水至100ml，混匀后4℃保存。
westernblotting试剂配制
westernblotting试剂配制Western Blot试剂配制Lower buffer（PH8.8）Tris base 18.15g⽤1mol/LHCl 调PH⾄8.8加ddH2O完全溶解后定容⾄100mlUpper buffer （PH6.8）Tris base 12.1g⽤1mol/LHCl 调PH⾄6.8加ddH2O完全溶解后定容⾄100ml10%SDS SDS 粉末10g加ddH2O完全溶解后定容⾄100ml10%AP(4℃保存)过硫酸铵固体0.1g1ml ddH2O30%Acr/Bic: 丙烯酰胺29g甲叉双丙烯酰胺1g加ddH2O完全溶解后定容⾄100ml5%脱脂奶粉（封闭液）脱脂奶粉5g加TBST完全溶解后定容⾄100ml5×电泳缓冲液 Tris Base 15.1g⽢氨酸94gSDS 5g加ddH2O完全溶解后定容⾄1L1×电泳缓冲液5×电泳缓冲液100ml400ml ddH2O1×转移缓冲液Tris 5.8g（半⼲转）⽢氨酸2.9gSDS 0.37g---可以少加甲醇200ml(有毒，最后加)----可以200-250之间，⽤途是固定作⽤加ddH2O完全溶解后定容⾄1L1×TBS缓冲液 TBS缓冲液粉末⼀包加ddH2O完全溶解后定容⾄2LTBST缓冲液500ml 1×TBS缓冲液250ul Tween20显影液⼤包5.2g⼩包0.6g加ddH2O完全溶解后定容⾄100ml定影液⼤包6.6g⼩包1.9g加ddH2O完全溶解后定容⾄100ml脱⾊液甲醇30mlddH2O60ml冰⼄酸10ml六楼(湿转技术) 10X转移缓冲液：Tris 30.26克⽢氨酸151克1000ml双蒸⽔湿转技术; 1X转移缓冲液：10X转移缓冲液100ml⽆⽔甲醇200ml 1000ml双蒸⽔SDS-PAGE蛋⽩电泳胶配制Reagents Separating GEL(12%) Stacking GEL(4%) Distilled water 3.2 ml 2.4mlLower buffer 2.6ml(1.5m PH8.8) ----Upper buffer10% SDS Acrylamide/Bis(30%) 10%Ap(fresh)TEMED----100ul4.0ml100ul5ul1ml(PH6.8)40ul0.536ml20ul4ulTotal 10ml 4ml注意：Acrylamide/Bis(30%)是调节配制胶的浓度，据柳鹏讲10ml体系中1.5mol PH8.8的Lower buffer固定在2.5ml，⽽Distilled water 和Acrylamide/Bis(30%)之和等于7.3ml。
Westernblot所需溶液的配制
.WB所需溶液的配制5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：15.1g Tris碱和72ｇ甘氨酸，5ｇ电泳级的SDS，双蒸水定容至1L，pH值为8.3。
使用前，将5×稀释到1×：取200ml 5×，定容到1000ml。
必须新鲜配置，因为甘氨酸溶于水后易分解。
小片段可不加SDS。
310% SDS配置电泳级十二烷基硫酸钠也叫SDS（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS,CHONaS）41225溶液: 10g SDS，100ml去离子水配制，50-68度搅拌溶解，浓盐酸调pH到7.2，室温保存。
注：Tris的分子量是121.4. 4度储存。
5 10% APS (Ammonium persulfate ; )的配置过硫酸铵称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，负30度冻存。
使用时尽量现配现用，短期内实验频繁可多配。
4度存则两周内用完，最多不能超过一个月。
负20度可存两个月，但一旦解冻后尽快用完。
加HCl调pH到7.6，室温储存。
1 / 3.SDS-PAGE加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris1:21:1或H2O 32ml混匀备用。
按3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，12.8ml，巯基乙醇，总蛋20-25ul3min比例与蛋白质样品混nonfat dried milk 或者0.01% antifoam A (Sigma)0.01%(v/v) sodium azide丽春红溶液：12 10毫升。
微升冰醋酸，加入0.05克丽春红，用水稀释至100 毫升）（10004%1）多聚甲醛（PFA）的配制微升氢氧化钠，全300毫升水，60度搅拌溶解，加入40克多聚甲醛，加入800毫升。
调1000PBS，加水定容到度，再加入100毫升的10×部溶解后冷却到4 4。
通风橱过滤，度保存。
pH到7.2-7.4步骤：；至7.4pH0.2%NaOHEDTA,10-20首先加毫升的水溶解再加入使溶解，再调应溶解一个再加另外一个；然后分别加入其他成分，去氧胆酸钠开盖后会飞出，2 / 3.戴口罩。
Western blotting溶液配置以及操作
Western blotting溶液配置：1.裂解液的配置（可以直接买）50mmol/L Tris-CL PH=8.0150mmol/L Nacl0.1% SDS100μg/ml PMSF（可以直接买）1% NP-401%Triton X-1002.10*TBST 1L的配置：（需要）1MTris-base 50ml5M Nacl 30mlTween-20 1ml去离子水800ML 调节PH至7.6 定容至1000ML 3.转膜缓冲液1L 的配置：（需要）甘氨酸14.4gTris-base 3.03g甲醇200ml 加去离子水定容至1L4. 10%脱脂奶粉溶液（安怡）5. 分离胶（10ml）水 3.3ml30%Arc+Bis 4ml分离胶缓冲液 2.5ml10%SDS 0.1ml10%AP 0.1mlTEMED 0.008ml6.浓缩胶(5ml)水 3.4ml30%Arc+Bis 0.83ml浓缩胶缓冲液0.63ml10%SDS 0.05ml10%AP 0.05mlTEMED 0.01ml7.电泳缓冲液(10*)终浓度1倍10倍Tris base 2.5mM 15.1g 60.4gGlycine 192mM 72.1g 288.4gSDS 0.1% 5.0g 20g去离子水到5L 到2L8. 30%Arc+Bis溶液(29gArc +1gBis)/100ml 一般配500ml,过滤,用锡纸避光,4度保存9. 分离胶缓冲液:Tris-HCL PH=8.8 1.5mol/LTris-base: 1.5*121/1000ml=18.15g/100ml 调PH值到8.8,定容到100ml10.浓缩胶缓冲液Tris-HCL PH=6.8 1mol/LTris-base 1*121/1000ml=12.1/100ml 调PH到6.8,定容到100ml 11.10%SDS10gSDS加去离子水到100ml12.10%AP0.1gAP 加去离子水到1ml提取及测定蛋白浓度1．加裂解液，按照1：5（重量/体积），1g组织加5ml裂解液2．冰上匀浆6000rpm*5s*5次3．超声300w 4秒，间隔14秒，共6次（保护复位，工作复位）4．静置1小时5．15000rpm离心15分钟，4度，取上清，测蛋白含量Braford法测浓度（单位：μl）管号0 1 2 3 4 5 Braford 1000 1000 1000 1000 1000 1000 BAS 0 2.5 5 10 15 20 NACL 100 97.5 95 90 85 801．做标准曲线。
western blot 独家配方(全套)
10ml 6ml 1.36ml 2.5ml 40μl 20μl
SDS-PAGE 分离胶浓度 6%胶 8%胶 10%胶 12%胶 15%胶
-Cl/SDS,pH8.8（1L） 3M Tris-HCl,pH8.8 ：500ml 10%SDS ：40ml 去离子水 ：460ml
5×running buffer（1L） Tris : 15.1g Glycine : 94g SDS : 5g 溶于1L去离子水，混匀，室温保存
4×Tris-Cl/SDS,pH6.8(500ml) 1M Tris-HCl，pH6.8 ：250ml 10%SDS ：20ml 去离子水 ：230ml
1M Tris-HCl pH6.8（1L) Tris ：121.1g 800ml去离子水充分溶解 浓HCl调节pH=6.8，约 ml 定容至1L，高压灭菌，室温保存
10×transfer buffer（1L） Tris : 72.5g Glycine : 36.25g SDS : 4.625g 溶于1L去离子水，混匀，室温保存 使用时，量取80ml，加720ml去离子 水，然后加200ml甲醇
10%SDS（100ml） SDS : 10g 去离子水至100ml 50℃水浴下溶解，室温保存 若出现沉淀，水浴溶化，仍可使用
配置不同体积和浓度凝胶所需各成分的体积 3ml 4ml 5ml 6ml 1.8ml 2.4ml 3ml 3.6ml 400μl 536μl 664μl 800μl 750μl 1ml 1.25ml 1.5ml 12μl 16μl 20μl 24μl 6μl 8μl 10μl 12μl
8ml 4.8ml 1ml 2ml 32μl 16μl
10%APS<!> APS ：0.1g 溶于1ml去离子水 4℃，避光保存2-3周
westernblot相关Buffer配方
westernblot相关Buffer配方Western blot是一种常用的实验技术，用于检测和分析蛋白质的存在和表达水平。
Western blot包括蛋白质提取、电泳分离、转膜、免疫染色等步骤。
下面是一些常用的Western blot相关缓冲液（Buffer）配方。
1.RIPA缓冲液：RIPA缓冲液是一种用于蛋白质提取的常用缓冲液，可以有效地裂解细胞膜并释放蛋白质。
以下是一种常用的RIPA缓冲液配方：-氯化钠（NaCl）：150mM- 三羟甲基氧甲烷（Tris） pH 7.4: 50 mM-适量氢氧化钠（NaOH）调整pH值- 二硫化苯甲醇（β-mercaptoethanol）或 DTT：1%- 甘油（glycerol）：1%-磷酸盐缓冲液：10mM-磷酸二氢钾（KH2PO4）：1.5mM-多普酰转酶抑制剂（PMSF）：1mM-乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA）：1mM-硫酸镁（MgSO4）：1mM2.SDS-凝胶电泳缓冲液：SDS-凝胶电泳是Western blot的重要步骤之一、以下是一种常用的SDS-凝胶电泳缓冲液配方：- Tris酸：25 mM- 甘氨酸（Glycine）：250 mM-SDS：0.1%-水：适量请注意，这只是一种基本配方，可能需要根据实验的具体要求进行调整。
3.转膜缓冲液：转膜缓冲液用于将电泳分离得到的蛋白质转移到膜上进行进一步的分析。
以下是一种常用的转膜缓冲液配方：-二甲基亚砜（DMSO）：20%-甘氨酸：192mM-氯酸钠（NaClO3）：20mM- Tris酸：25 mM-水：适量4.阻断缓冲液：阻断缓冲液用于在免疫染色之前预防非特异性结合。
以下是一种常用的阻断缓冲液配方：-牛血清蛋白（BSA）：3-5%-牛血清白蛋白（BSA）：0.1-0.3%-磷酸盐缓冲液：10mM- Triton X-100或Tween-20：0.1-0.5%-NaN3：0.01-0.02%5.抗体染色缓冲液：以下是一种常用的抗体染色缓冲液配方：-磷酸盐缓冲液：10mM-硼酸：1mM-EDTA：5mM- Tween-20：0.1-0.2%-低脂牛奶粉（非脂奶粉）：5-10%-NaN3：0.02%不同实验室和研究人员可能会根据实际需要进行配方上的调整。