正相色谱与反相
高效液相色谱法及其在药物分析中的应用
高效液相色谱法及其在药物分析中的应用以液体为流动相的色谱法称为液相色谱法。
用常压输送流动相的方法为经典液相色谱法，这种色谱法的柱效能低、分离周期长。
高效液相色谱法（highperformanceliquidchromatography，简称HPLC）是在经典液相色谱的基础上发展起来的一种色谱方法。
与经典的液相色谱法相比，高效液相色谱法具有下列主要优点：①应用了颗粒极细（一般为10µm以下）、规则均匀的固定相，传质阻抗小，柱效高，分离效率高；②采用高压输液泵输送流动相，流速快，一般试样的分析需数分钟，复杂试样分析在数十分钟内即可完成；③广泛使用了高灵敏检测器，大大提高了灵敏度。
目前，已经发展了多种不同的固定相，有多种不同的分离模式，使高效液相色谱法的应用范围不断扩大。
下面介绍高效液相色谱法的有关知识，新的方法和技术以及在药物分析中的应用。
一、分类高效液相色谱法按分离机理的不同可分为以下几类：（一）吸附色谱法（adsorptionchromatography）以吸附剂为固定相的色谱方法称为吸附色谱法。
使用最多的吸附色谱固定相是硅胶，流动相一般使用一种或多种有机溶剂的混合溶剂。
在吸附色谱中，不同的组分因和固定相吸附力的不同而被分离。
组分的极性越大、固定相的吸附力越强，则保留时间越长。
流动相的极性越大，洗脱力越强，则组分的保留时间越短。
（二）液-液分配色谱法（liquid-liquidchromatography)液-液分配色谱的固定相和流动相是互不相溶的两种溶剂，分离时，组分溶入两相，不同的组分因分配系数（K)的不同而被分离。
目前广泛使用的化学键合固定相是将固定液的官能团键合在载体上而制成的，使用化学键合固定相的色谱方法（简称键合相色谱法）可以用分配色谱的原理加以解释。
键合相色谱法在HPLC中占有极其重要的地位，是应用最广的色谱法。
按照固定相和流动相极性的不同，分配色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法两类。
正相色谱和反相色谱
正相色谱和反相色谱正相色谱（Normal Phase Chromatography）正相色谱是一种将物质分离的方法，是一种基于极性差异的液相色谱法。
所谓正相色谱，是因为在正相色谱柱中，填充物通常是一些极性较高的固体相，例如硅胶（silica gel）和氧化铝（alumina）等。
正相色谱柱可以分离无电荷的极性化合物，例如一些羟基化合物和醇类分子。
在正相色谱中，毒理学家可以分离和鉴定一些有机物。
反相色谱（Reverse Phase Chromatography）反相色谱是一种将物质分离的方法，是一种基于亲疏水性质差异的液相色谱法。
所谓反相色谱，是因为在反相色谱柱中，填充物通常是由一个疏水的固体相组成，例如碳颗粒、聚合物等。
反相色谱柱可以分离各种极性分子，例如对有机药物、蛋白质、核酸等进行分离和纯化。
毒理学家可以使用反相色谱技术进行药物开发和毒性评估。
正相色谱和反相色谱之间的不同在正相色谱中，爱保者可以利用样品和固相之间的极性差异来分离和纯化物质。
正相色谱通常用于分离和纯化极性药物和天然产物，如氨基酸，多肽和糖。
在反相色谱中，爱保者利用样品和固相之间的非极性差异来分离和纯化化合物。
反相色谱通常用于分离和纯化疏水药物和天然产物，如脂肪酸，核酸和激素。
正相色谱和反相色谱在毒理学中的应用正相色谱和反相色谱都广泛应用于毒理学，尤其是药物开发和毒性评估。
毒理学家可以利用这些技术来分离和纯化化合物。
毒理学家应用表面增强拉曼光谱（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）联用反相色谱分离和纯化天然产物，从而破解其分子结构。
结论正相色谱和反相色谱是两种最常用的色谱技术之一，它们是一种高效的分离和纯化化合物的方法。
在毒理学研究和药物开发中，正相色谱和反相色谱可广泛应用。
我们期待在今后研究中看到更多正相色谱和反相色谱的应用，以便更好地了解各种疾病和药物与人体的相互作用。
亲水作用(Hilic)色谱简介,以及和正相色谱相、反相色谱比较
亲水作用（H i l i c）色谱，有时被称为“含水正相色谱”，有时又被称为“反反相色谱”，简单来说，是极性的固定相和极性的流动相组成，参考表1，在固定相方面，看似和正相色谱一样，那么，同一款色谱柱是否既可以用于正相色谱，又可以用于H i l i c色谱？在流动相方面，和反相色谱接近，那两种模式保留行为和流动相对保留的影响规律有什么差异？你对H i l i c色谱是否也疑惑重重？接下来让我们一起揭开亲水作用（H i l i c）色谱的神秘面纱吧。
表1 反相、正相、Hilic色谱对比一、Hilic简介1.1流动相在大多数的Hilic分离中，采用的流动相为含有少量水/缓冲液与有机相混合（典型的是乙腈），水的比例为3%-40%之间。
水的比例不低于3%是由于Hilic色谱的保留机理决定的，普遍认为Hilic色谱流动相中的水会被吸附到极性固定相的表面形成水膜，然后分析物在水膜和流动相之间进行液液分配作用，加上极性官能团和固定相之间的氢键作用力，离子官能团之间的静电作用力等，实现被分析物的保留。
水膜的作用非常重要，所以Hilic流动相中至少含有3%的水。
当水的比例大于40%时，保留一般很弱（k≈0）。
1.2固定相应用于Hilic色谱的固定相有：纯硅胶柱、氨基柱、二醇基柱、酰胺基柱等。
纯硅胶柱有固定相不易流失的优点，在使用CAD、ELSD和LC-MS检测器时，最受欢迎；氨基柱，在Hilic 色谱中的应用，特别适合碳水化合物（糖类）分离；二醇基柱，亲水性很好，可以提供不同的选择性。
二、Hilic和正相色谱相比2.1固定相的区别同样是Silica，NH2，Diol柱，与用于正相色谱中的色谱柱不同，专为Hilic色谱设计的色谱柱，可以用于水/有机物的流动相中，换句话说，Hilic色谱对固定相的耐水性要求更高，否则会因固定相的水解，出现基线噪音大、色谱柱寿命短等问题。
所以用于正相色谱中的色谱柱，不一定能用于Hilic色谱。
反相色谱切换为正相色谱操作步骤
反相色谱切换为正相色谱操作步骤
a先将色谱柱用相应的溶剂冲洗干净，然后将色谱柱拆下来密封保存。
用双通将进样器与检测器连接。
b将贮液瓶内装入300ml的二次蒸馏水，将流速渐次提高到2.0ml/min冲洗系统1.5小时。
注意观查泵压。
c将流速渐次降到0ml/min，把二次蒸馏水更换为甲醇（HPLC），将流速渐次提高到2.0ml/min冲洗系统1小时。
d用相同的方法将甲醇依次更改为异丙醇、四氢呋喃（HPLC），冲洗系统各1小时。
e最后将四氢呋喃更换为预先配制好的流动相：异丙醇/正己烷＝15/85（V/V）混合液冲洗系统1小时(根据不同样品更换不同的流动相)。
同时将柱塞杆清洗系统内的10％异丙醇换为流动相，保持每分钟50-60滴的速度清洗柱塞杆。
然后将双通更换为Si60 250mm*4.6mm*5um色谱柱，待色谱柱平衡好以后分析样品。
正相色谱一定要确保系统内无水。
品管科
傅忠
2006-7-2。
反相色谱
反相色谱资料reversed phase chromatography 根据流动相和固定相相对极性不同，液相色谱分为正相色谱和反相色谱。
流动相极性大于固定相极性的情况，称为反相色谱。
非极性键合相色谱可作反相色谱。
反相色谱法是以表面非极性载体为固定相，面以比固定相极性强的溶剂为流动相的一种液相色谱分离模式．反相色谱固定相大多是硅胶表面键合疏水基团，基于样品中的不同组分和疏水基团之间疏水作用的不同而分离．亲核试剂的亲和能力。
如F阴离子、Cl阴离子、Br阴离子、I阴离子的碱性依次递减；在非质子溶剂中，F阴离子、Cl阴离子、Br阴离子、I阴离子的亲核能力递减；然而在质子性溶剂中却递增。
1、吸光度。
乙腈HPLC级的小.。
乙腈和甲醇的市销HPLC级和优级的吸收光谱中，乙腈HPLC吸收最小（特别是在短波长上小）。
所谓HPLC级是除去具有吸收UV的杂质，在规定的波长上吸光度限制在规格值以内。
在UV检测时，产生的噪声小，因此在进行UV短波长上的高灵敏度分析时乙腈HPLC级最适宜。
另外，在UV检测中的梯度基线上也是乙腈HPLC级产生鬼峰少，虽然，其他与水相溶性高的有机溶剂有各种各样，但很难能找到比乙腈HPLC级吸收更小的。
另外，甲醇的HPLC级和优级，虽然所得的光谱相差不大，但是优级不能保证吸光度，有可能产生偏差，价格也相差不大，所以尽量使用HPLC 级。
5、峰形。
用时出现差异。
像水杨酸化合物（在邻位上具有羧基或甲氧基的苯酚化合物）等，用乙腈类时拖尾大，用甲醇类可抑制。
可是，一般情况下，聚合物类反相柱，与硅胶柱相比，更具有峰形宽的倾向，特别是用聚苯乙烯分析柱芳香族化合物等时常见。
这在流动相是甲醇时非常显著，而用乙腈时不明显。
为此，用聚合物类反相用柱时建议采用后者（乙腈类），这是因为乙腈使凝胶膨润。
正相色谱vs反相色谱
正相色谱vs反相色谱点击次数：986 发布时间：2009-11-9现代高效液相色谱中,分离效果好坏很大程度上取决于色谱填料的选择.但是色谱填料的选择范围很宽,要做合适的选择,必须对此有一定的认识和了解.1,正相色谱正相色谱用的固定相通常为硅胶(Silica),以及其他具有极性官能团,如胺基团 (NH2,APS)和氰基团(CN,CPS)的键合相填料.由于硅胶表面的硅羟基(SiOH)或其他团的极性较强,因此,分离的次序是依据样品中的各组份的极性大小,即极性强弱的组份最先被冲洗出色谱柱. 正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低,如:正乙烷(Hexane),氯仿(Chloroform),二氯甲烷(Methylene Chloride)等.2,反相色谱反相色谱填料常是以硅胶为基础,表面键合有极性相对较弱的官能团的键合相. 反相色谱所使用的流动相极性较强,通常为水,缓冲液与甲醇,已腈等混合物. 样品流出色谱柱的顺序是极性较强组合最先被冲出,而极性弱的组份会在色谱柱上有更强的保留. 常用的反相填料有C18(ODS),C8(MOS),C4(B),C6H5(Phenyl)等.二,聚合物填料聚合物调料多为聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等,其主要优点是在PH值为1～ 14均可使用. 相对与硅胶基质的C18填料,这类填料具有更强的疏水性;大孔的聚合物填料对蛋白质等样品的分离非常有效. 现在的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料,色谱柱柱效较低. 三,其他无机填料其它HPLC的无机填料色谱柱也已经商品化.由于其特殊的性质,一般仅限于特殊的用途.如石墨化碳也用于正逐渐成为反相色谱填料.这种填料的分离不同与硅胶基质烷基键合相,石墨化碳的表面即是保留的基础,不再需其它的表面改性,该柱填料一般比烷基键合硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强,石墨化碳可用于分离某些几何导构体,又由于HPLC流动相中不会被溶解,这类柱可在任何PH与温度下使用.氧化铝也可用于HPLC, 氧化铝微粒刚性强,可制成稳定的色谱柱柱床,其优点是可在PH高达12的流动相中使用. 但由于氧化铝与碱性化合物作用也很强,应用范围受到一定的限制,所以未能广泛应用, 新型氧化锆填料也可用于HPLC,商品化的仅有聚合物涂层的多孔氧化锆微球色谱柱,应用PH范围1～14,温度可达100℃.由于氧化锆填料几年才开始研究,加之面临的实验难度,其重要用途与优势尚在进行中.怎样选择填料粒度目前,商品化的色谱料粒度从1um到超过30um均有销售,而目前分析分离主要用3um, 5um和10um填料,填料的粒度主要影响填充柱的两个参数,即柱效和背压.粒度越小,填充柱的柱效越高;小于3um的填料应用,在相同选择性条件下,提高柱效可提高分离度, 但不是唯一的因素.如果固定相选择是正确,但是分离度不够,那么选择更小粒度的填料是很有用的,3um填料填充柱的柱数比相同条件下的5um填料的柱效提高近30%;然而, 3um的色相谱的背压却是5um的2倍.与此同时,柱效提高意味着在相同条件下可以选择更短的色谱柱,以缩短分析时间,另外,可以采用低粘度的溶剂做流动相或增加色谱柱的使用温度,比如用乙腈代替甲醇,以降低色谱柱的压力.如何选择液相色谱仪发布日期：[2009-10-30] 共阅[241]次如何选择液相色谱仪一台品质优良的液相色谱系统应从以下几个方面考虑：一．主要技术指标优异首先是如何看指标。
高效液相色谱法的分类及原理
高效液相色谱法的分类及其分离原理高效液相色谱法分为：液-固色谱法、液-液色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法。
1.液-固色谱法（液-固吸附色谱法）固定相是固体吸附剂，它是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分配的。
①液-固色谱法的作用机制吸附剂：一些多孔的固体颗粒物质，其表面常存在分散的吸附中心点。
流动相中的溶质分子X（液相）被流动相S带入色谱柱后，在随载液流动的过程中，发生如下交换反应：X（液相）+nS（吸附）<==>X（吸附）+nS（液相）其作用机制是溶质分子X（液相）和溶剂分子S（液相）对吸附剂活性表面的竞争吸附。
吸附反应的平衡常数K为：K值较小：溶剂分子吸附力很强，被吸附的溶质分子很少，先流出色谱柱。
K值较大：表示该组分分子的吸附能力较强，后流出色谱柱。
发生在吸附剂表面上的吸附-解吸平衡，就是液-固色谱分离的基础。
②液-固色谱法的吸附剂和流动相常用的液-固色谱吸附剂：薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛、聚酰胺等。
一般规律：对于固定相而言，非极性分子与极性吸附剂（如硅胶、氧化铜）之间的作用力很弱，分配比k较小，保留时间较短；但极性分子与极性吸附剂之间的作用力很强，分配比k大，保留时间长。
对流动相的基本要求：试样要能够溶于流动相中流动相粘度较小流动相不能影响试样的检测常用的流动相：甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等。
③液-固色谱法的应用常用于分离极性不同的化合物、含有不同类型或不；数量官能团的有机化合物，以及有机化合物的不同的异构体；但液-固色谱法不宜用于分离同系物，因为液-固色谱对不同相对分子质量的同系物选择性不高。
2.液-液色谱法（液-液分配色谱法）将液体固定液涂渍在担体上作为固定相。
①液-液色谱法的作用机制溶质在两相间进行分配时，在固定液中溶解度较小的组分较难进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定液中溶解度较大的组分容易进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达到分离的目的。
反相色谱柱
反相色谱柱
反相色谱柱（Reverse Phase Chromatography Column）就是指交换相相反的色谱柱，它与正相色谱柱最大的不同就是其固定相成分是疏水性的，相比之下，正相色谱柱的固定相成分是亲水性的。
反相色谱柱能够在样品分离中提供更高的选择性和特异性，因此在生化、医学或化学领域的样品分离中都得到了广泛的应用。
反相柱的工作原理
反相柱的固定相为一种亲油类材料，如碳氢化合物、疏水性聚合物等，通过与移动相中的亲水类化合物发生静电交换而实现手段分离。
由于反相色谱柱的固定相是疏水材料，因此它可以随着溶剂极性的变化而改变样品吸附和洗脱的性质。
反相柱的应用
反相柱在生物学、医学、化学和食品领域中应用广泛，是鉴别和分离化合物的最基本技术之一。
在生物学领域，反相柱用于分离复杂的蛋白质混合物，如血清等，在制药工业中，反相色谱柱被广泛应用于分离和纯化药物，如抗癌药物、抗生素等。
在食品分析中，反相柱用于分离和分析带有不同疏水性的化合物，如蛋白质、糖类和脂质。
反相柱的优点和缺点
反相色谱柱操作简单，效率高，分离效果好，可以分离各种极性的化合物。
与正相色谱柱相比，反相柱选择性更高。
但是它并不适用于极性很高的物质，如乙醇等，同时还需要注意的是它对于多肽和糖类等高8极性物质分离效果较差，因此在使用反相柱进行样品分离时，需要根据具体的样品特性选择合适的柱型。
总之，反相色谱柱作为一种重要的色谱柱类型，已经成为分离、分析和纯化化合物的著名分析技术，为科学界和工业界提供了不少便利，然而也需要我们在使用过程中切记仔细细致地进行操作，以获得更好的分离效果。
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正相色谱
液-液色谱有正相和反相之分。
如果采用极性固定相和相对非极性流动相，就称为正相；如果采用相对非极性固定相和极性流动相，则称为反相。
由于极性化合物更容易被极性固定相所保留，所以正相液-液色谱系统一般可用于分离极性化合物。
相反，反相液-液色谱系统一般可用于分离非极性或弱极性化合物。
正相色谱的流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出；反相色谱的流出顺序正好相反。
另外，其他有些色谱如柱色谱也有正反相之分。
正反相色谱区别：
色谱柱的安装：
1、首先应确认柱和仪器的接头以及管路是否匹配。
为减少死体积，进样阀、柱子、检测器之间的连接管路内径尽可能使用内径较小的管线，同时控制进样器、色谱柱和检测器之间连接管线的长度。
安装色谱柱之前，确认流路系统中的溶剂是否正常。
对分析较复杂的样品建议安装保护柱。
2、为了使色谱柱与仪器系统达最佳的连接效果，应尽量使用与色谱柱接口相匹配的螺帽和锥形接头，如原来的接头长期匹配其他类型的色谱柱，建议在连接新色谱柱前应检查匹配情况，避免造成色谱柱的损坏或因色谱柱不匹配造成的漏液。
3、使用PEEK 材料的通用接头，只需用手拧紧不需要特定扳手，使用压力为5000psi；使用温度不得超过100℃。
流动相平衡：
1、在进行样品检测前，至少使用20倍柱体积流动相使色谱柱充分平衡。
流动相一定要使用色谱级别的溶剂。
如使用水相的缓冲液应当天配制以保持新鲜避免细菌产生。
2、流动相使用前需用微孔滤膜过滤,消除流动相中颗粒对色谱系统和色谱柱的损坏。
缓冲液与其他流动相混合后应重新过滤避免溶解度变化造成产生新的沉淀。
不应使用纯水作为流动相冲洗C18色谱柱，以免柱性能损坏（添加5％的有机溶剂冲洗色谱柱，同时可以达到对缓冲盐清洗的作用。
还可以使色谱柱更容易平衡）。
3、流动相需脱气后使用，可避免因气泡导致的泵和检测器的工作不正常。
如果测试时使用的流动相与色谱柱保存使用的流动相有较大区别，应该使用过度分布的形式进行平衡。
避免由于流动相的突然变化造成柱压增加过大或流动相缓冲盐结晶造成对色谱柱和仪器系统的损坏。
正相色谱柱比反相色谱柱需要更长的平衡时间。
样品制备与操作：
1、样品应当尽可能溶解在能与流动相相互溶的溶剂中。
除特殊指明外，如使用强溶剂溶解样品柱子的分辨率将可能降低。
2、样品溶液在进样前应使用针头式过滤器对样品预先过滤。
频繁改变流动相组成，会加速降低柱效。
3、色谱柱由高压匀浆法装填，能承受较高压力。
为获得最佳分离效果，使用时请不要超过200kgf，而且避免压力突然上升或变化，否则会造成硅胶填料的破坏，减少色谱柱的使用寿命。
除特殊要求外最高操作温度不要超过60℃。
保存色谱柱：
1、如果流动相含有酸或无机盐，应当先用去离子水（20倍柱体积）冲洗干净。
然后用用100％乙腈或甲醇保存色谱柱。
最后用柱子的接头密封，并放在稳定的环境中存放。
2、应避免色谱柱受到直接的机械冲击或摔落，避免造成色谱柱性能的降低。
色谱柱的再生：
1、用相当于20倍柱体积的溶剂按下列顺序冲洗柱子，建议按柱子的箭头方向冲洗，尽可能不反冲：冲洗时使用的的参考溶剂顺序是水、甲醇、氯仿、异丙醇、甲醇。