限制性内切酶的一般原则和建议!
限制性内切酶
限制性内切酶限制性内切酶（又称限制酶）首先是在细菌体内发现的，但后来在部分古细菌中也发现了这种成分。
通常，限制性内切酶会切割双链DNA，每个限制性内切酶会识别特定的DNA序列，根据不同的内切酶类型，可在识别序列内或距识别序列不远的位置处切割DNA，识别序列长度通常为4-8bp，酶切之后会形成粘性末端和平末端。
上世纪50年代初期，许多研究团队观测到了噬菌体对于同一物种的不同细菌宿主菌株存在感染效率差异[1,2]，即：使用在一种细菌菌株（例如，大肠杆菌C）内繁殖的噬菌体λ感染同一种类的灵异菌株（例如大肠杆菌K），结果发现，相比于重新感染宿主菌株（大肠杆菌C），大肠杆菌K的感染率出现明显下降。
新的宿主（大肠杆菌K）似乎可以选择性抵御或“耐受”侵入的噬菌体。
研究人员还发现，这一现象并没有遗传性，因为经过一轮感染后，在新菌株中生长的噬菌体还可以以正常的感染率感染该菌株。
这种现象被称为“宿主控制变异”，有关其背后的机制也成为了频繁研究的领域[3]。
直到上世纪60年代，人们才发现宿主变异的机制，其与噬菌体DNA的酶切有关，进而发现并分理出了限制性内切酶。
上世纪60年代初Werner Arber观测发现，宿主范围内的决定性遗传物质都存在于噬菌体DNA中，而后续实验证明甲硫氨酸参与宿主的自我保护[4]。
这些发现最终催生了限制性修饰（R-M）体系的概念，通过该体系，来自于宿主的限制性内切酶和甲基化酶共同作用，切割外来病毒（非甲基化）DNA，同时保护宿主的DNA不受甲基化[5]。
随着DNA连接酶的发现以及位点特异性限制性内切酶的家族不断壮大，重组DNA 技术应运而生。
限制性内切酶的命名规则，考虑到内切酶来源的三种特性——属名、种名和菌株或血清型——组成了一个简短的名称，后面加上罗马数字，代表来自同一菌株的多个限制性内切酶[6]。
例如，以HindⅢ酶为代表：“H”代表Haemophilus“in”代表influenzae“d”代表血清型d“Ⅲ”用于区分来自于Haemophilusinfluenza血清型d的其它限制性内切酶限制性内切酶的分类，根据结构的复杂程度、识别序列、切割位点位置以及辅助因子要求，限制性内切酶分为四类：TypeⅠ：同时具有限制性和甲基化活性的多亚基蛋白需要ATP切割位点与识别位点间的间距不定TypeⅡ：特异性的识别序列切割位点位于识别序列内或邻近识别序列在切割位点生成5＇磷酸基和3＇羟基末端需要M2+TypeⅢ：由两个相反的识别序列组成切割位点与其中一个识别序列的间距恒定需要ATPTypeⅣ：仅切割甲基化的DNA切割位点大约距离识别位点30bp由于自身特殊的特点，TypeⅡ限制性内切酶已经成为分子克隆、法医学DNA分析等许多研究应用最常用的限制性内切酶。
限制性内切酶的说明
限制酶使用说明一、分类目前，已被发现的限制酶，根据其反应的必须因子和切断点等特性，被分为以下三大类：类别反应必须因子切点酶例 I 型 s-腺苷基蛋氨酸、ATP、Mg2+识别部位和切点不同，切断部位不定Eco B、Eco KII 型 Mg2+切断识别部位或其附近的特定部位Eco R I、Bam H I III 型 ATP、Mg2+识别部位和切点不同，但切断特定部位Eco P I、Hin f III 应用于基因工程研究用的限制酶，一般全是II型酶，现在市场上销售的酶都属于II型酶, 这些限制酶由于其反应条件和底物DNA种类的不同，其切断状况及出现Star活性的频率等各有不同，并且其程度也根据酶的不同而千差万别。
因而在使用限制酶时，必须对这些要素充分注意，确保目标序列的切断反应能顺利进行，下面具体介绍一下使用限制酶时的一些注意点。
二、注意事项1. 甲基化的影响从带有DNA甲基化酶基因的宿主菌中制备的DNA，其碱基的一部分已经被甲基化，因此即便使用能够识别、切断被甲基化部分的序列的限制酶，也几乎无法切断被甲基化的部分。
被甲基化的部位，根据底物DNA及宿主种类的不同而不同。
例如宿主菌为大肠杆菌的情况下，根据宿主的种类有以下两种情况：在进行转化时，通常使用的菌株为C600、HB101、JM109等，因为都带有dam、dcm甲基化酶，所以使用这些菌株制备的DNA时，必须注意。
另外，动物由来的DNA，CG序列多为5m CG；植物由来的DNA，CG及CNG序列多为5m CG和5m CNG。
2. Star活性限制酶在一些特定条件下使用时，对于底物DNA的特异性可能降低。
即可以把与原来识别的特定的DNA序列不同的碱基序列切断，这个现象叫Star活性。
Star活性出现的频率，根据酶、底物DNA、反应条件的不同而不同，可以说几乎所有的限制酶都具有Star活性。
并且，它们除了识别序列的范围增大之外，还发现了在DNA的一条链上加入切口的单链切口活性，所以为了极力抑制Star活性，一般情况下，即使会降低反应性能，我们也提倡在低甘油浓度、中性pH、高盐浓度条件下进行反应。
限制性内切酶使用
用Universal Buffer和Basal Buffer进行限制酶活性表示TaKaRa公司，为了方便限制酶的统一使用，采用了通用缓冲液 (Universal Buffer) 测定限制酶活性的体系 (5种通用缓冲液中，用标注的)，以此时的活性值作为100%。
并把在其它通用缓冲液中的相对活性表示如下表。
有 ( ) 标记的是易受Star活性影响的缓冲液，为了避免Star活性的影响，希望尽量使用或标注的缓冲液。
每种限制酶都有其自身的基本缓冲液 (Basal Buffer)，其中AccⅢ、BalⅠ、BcnⅠ、BglⅠ、Bpu1102Ⅰ、Cfr10Ⅰ、Eam1105Ⅰ、Eco52Ⅰ、NruⅠ、Psh BⅠ、Sna BⅠ、SspⅠ、TaqⅠ、VpaK11B Ⅰ(共14种)由于没有十分合适的通用缓冲液，只能使用基本缓冲液(Basal Buffer)。
各种限制酶的基本缓冲液组成不同，相互之间不能通用。
各种限制酶在基本缓冲液中的相对活性也被列于下表，供参考。
限制酶在各种缓冲液中的相对活性附带·活性测定用Buffer 推荐使用的Buffer*1+0.01%BSA→100%: Afl II, Aor13H I, Eco O65 I, Fok I, Hin1 I, Mun I, Nco I, Pvu I, Sse8387 I, Xba I *2 +0.01%BSA+0.01%Triton X-100→100%: Not I按Universal Buffer分类的限制酶各Universal Buffer的组成■ 使用注意事项10×Buffe r都为10倍浓度的缓冲液。
此外，10×T溶液中不含BSA，在使用时将BSA添加进去，使最终浓度为0.01%，有些限制酶(带有*1或*2标记)的反应体系中需加BSA或Triton X-100，添附的溶液是10倍浓度 (0.1%) 的液体，使用时，请在反应体系中添加1/10量进行反应。
限制性内切酶
特征和种类
1．限制与修饰现象 早在 50 年代初，有许多学者发现了限制与修饰现象，当时称作寄主 控制的专一性（host controlled specificity）。 l 噬菌体表现的现 象便具有代表性和普遍性，其在不同宿主中的转染频率可明这一问题 （表 2-1）。 l 在感染某一宿主后，再去感染其它宿主时会受到限制。 E.coli 菌株 λ噬菌体感染率 lK lB lC E.coli K 1 10-4 10-4 E.coli B 10-4 1 10-4 E.coli C 1 1 1 说明 K 和 B 菌株中存在一种限制系统，可排除外来的 DNA 。 104 的存活率是由宿主修饰系统作用的结果，此时限制系统还未起作用。 而在 C 菌株不能限制来自 K 和 B 菌株的 DNA 。限制作用实际就是限 制酶降解外源 DNA ，维护宿主遗传稳定的保护机制。甲基化是常见的 修饰作用，可使腺嘌呤 A 成为 N6 甲基-腺膘呤，胞嘧啶 C 成为 5' 甲 基胞嘧啶。通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目 的。
Ⅰ 型（type Ⅰ）限制与修饰系统的种类很少，只占 1% ，能识别 专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的 双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。如 EcoK 和 EcoB。其限制酶和甲基化酶 （即 R 亚基和 M 亚基） 各作为一个亚基 存在于酶分子中，另外还有负责识别 DNA 序列的 S 亚基，分别由 hsdR、hsdM 和 hsdS 基因编码，属于同一操纵子（转录单位）。 EcoK 编码基因的结构为 R2M2S。 EcoB 编码基因的结构为 R2M4S2 。 EcoB 酶的识别位点如下，其中两条链中的 A 为甲基化位点， N 表示任意碱基。 TGA*（N）8TGCT EcoK 酶的识别位点如下，其中两条链中的 A 为可能的甲基化位点。 AA°C（N）6GTGC 但是 EcoB 酶和 EcoK 酶的切割位点在识别位点 1000bp 以外， 且无特异性。 Ⅲ 型（type Ⅲ）限制与修饰系统的种类更少，所占比例不到 1% ， 也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序。它在识别顺序旁边几个 核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对则是任意的，如 EcoP1 和 EcoP15 。它们的识别位点分别是 AGACC 和 CAGCAG ， 切割位点则在下游 24-26bp 处。 在基因操作中，一般所说的限制酶或修饰酶，除非特指，均指 Ⅱ 型 系统中的种类。
限制性内切酶酶切反应的标准操作规程
限制性内切酶酶切反应的标准操作规程限制性内切酶酶切反应的标准操作规程（编号：007）1、目的及适用范围利用限制性内切酶在特异性的识别位点上或附近切割双链DNA分子，用于特定基因的克隆等分子生物学研究。
2、主要试剂及仪器微量移液器、恒温水浴锅、限制性内切酶 EcoR I, BamH I 等、通用缓冲液10× Buffer3、操作步骤按顺序加入下列反应物，放入37℃水浴锅内反应2h。
反应物体积（μL）灭菌水3DNA4010× Buffer K 5EcoR I1BamH I1总体积504、问题向导4.1 建立一个标准的酶切反应：目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。
通常，一个50μL的反应体系中，1μL的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1h即可降解1μg已纯化好的DNA。
如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16h）也可完全反应。
4.2 选择正确的酶：选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。
识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。
假设一个GC含量50%的DNA链，一个识别4个碱基的酶将平均在每44（256）个碱基中切割一次；而一个识别6个碱基的酶将平均在每46（4096）碱基切割一次。
内切酶的产物可以是粘端的（3\'或5\'突出端），也可以是平端的片段。
粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接。
4.3 内切酶：内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。
酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。
酶的用量视在底物上的切割频率而定。
例如，超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超过1U/μg的酶才能被完全切割。
21。
质粒DNA的限制性内切酶酶切分析讲解
质粒 DNA 的限制性内切酶酶切分析实验目的学习和掌握限制性内切酶的特性掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法重组技术的关键工具。
并理解限制性内切酶是 DNA 重组技术的关键工具。
2. 相关基础知识限制性核酸内切酶：是一类能识别双链 DNA 分子特异性核酸序列的 DNA 水解酶。
它是基因工程中用于体外剪切基因片段的重要工具酶。
上世纪七十年代，当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限制性内切酶。
首批被发现的限制性内切酶包括来源于大肠杆菌的 EcoR I 和 EcoR II，以及来源于流感嗜血杆菌(Heamophilus influenzae)的 Hind II 和 Hind III。
这些酶可在特定位点切开 DNA，产生可体外连接的基因片段。
研究者很快发现内切酶是研究基因组成、功能及表达非常有用的工具。
1) 寄主控制的限制与修饰现象限制与修饰系统是细菌细胞的一种防卫手段。
各种细菌都能合成一种或几种能够切割 DNA 双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源 DNA 存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的 DNA 不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的DNA 进行了修饰，限制性酶对修饰过的 DNA 不能起作用。
这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。
2)限制性核酸内切酶的类型及特性按限制酶的亚基组成和切断核酸情况的不同，分为三类：Ⅰ型Ⅱ型* Ⅲ型第一类（I 型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，它们在识别位点很远的地方任意切割 DNA 链，其切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。
这类限制性内切酶在 DNA 重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析 DNA 结构或克隆基因。
这类酶如 EcoB、EcoK 等。
第三类（III 型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。
但这几个核苷酸对也不是特异性的。
因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度 DNA 片段，具有各种单链末端。
限制性核酸内切酶相关知识归纳
限制性核酸内切酶相关知识归纳限制性核酸内切酶是基因工程中最难把握的知识点，高考中对这种酶的考察特别重视，我们有必要对其相关的知识进行归纳，才有利于解答试题。
1 限制性核酸内切酶的基本知识①来源及化学本质:主要是从原核生物中分离纯化出来的。
化学本质为蛋白质。
②作用：催化作用，可用于DNA的切割获取目的基因和载体的切割，切割的化学键为磷酸二酯键。
③作用特点：特异性,即限制酶可识别特定的脱氧核苷酸序列,切割特定位点。
④切割方式：错位切--产生两个相同的黏性末端，平切--形成平末端。
如果是错位切则将一个基因从DNA分子上切割下来,需要破坏4个磷酸二酯键,同时产生4个黏性末端，增加4个游离的磷酸基团。
2 限制性核酸内切酶的难点解析2.1 目的基因切割要点归纳①要把目的基因切割下来需要在目的基因的两边都进行切割，但绝对不可以破坏目的基因的结构。
②切割目的基因的酶可以用同一种限制酶，也可以用两种不同的限制酶。
③切割产生的末端有三种情况：都是平末端、都是粘性末端、一边是粘性末端，一边是平末端。
2.2 质粒切割要点归纳①质粒的切割可以切一个切口，也可以切两个切口。
如果是一个切口，则连接时可能会产生一些我们不需要的连接物(如自身环化等)；如果是两个切口则质粒会丢失一段DNA片段，但可以控制连接物就是我们需要的目的基因和质粒的连接。
切割时注意不要破坏了载体上的标记基因（至少保留有一个标记基因）、终止子、启动子、复制原点等。
②切割质粒的酶可以用同一种限制酶，也可以用两种不同的限制酶。
③切割产生的末端有三种情况：都是平末端，都是粘性末端，一边是粘性末端，一边是平末端。
2.3 限制性核酸内切酶的说明不同的酶识别序列一般不同，但也有识别序列相同的。
如果识别序列相同，切割点也相同则切割产生的粘性末端一样。
一种酶的识别序列中可能包含另外一种酶的识别序列，切割时可以产生相同的粘性末端。
不同的酶识别的序列一般不同，但有时也可能相同，这时切割产生的粘性末端也相同。
限制性内切酶酶切的常见问题及解决方法
限制性内切酶酶切的常见问题及解决方法限制性内切酶酶切的常见问题及解决方法限制性内切酶酶切的常见问题及解决方法，个人觉得总结得很好，特转贴供本供大家分享。
酶切现问题，看内切酶说明书，相应试剂公司目录。
不同公司出产的内切酶，菌株来源、制备工艺、纯度活力、酶切活性优化可能不同，。
可在上面找到酶单位定义、保存条件、酶切体系[buffer及与其它酶双切的buffer等]、酶切反应温度[有些酶是在50、55或30等温度下反应的]、酶是否受甲基化影响、是否有星号活性及出现星号活可能因素、保护性碱基，同尾酶、同裂酶1. 酶切不开或不完全1.1 质粒问题纯度差或残留酶切抑制物最为常见。
杂蛋白存在会影响酶切，表现为A260/A280低于1.8；抑制物常见酚、盐、乙醇等；【重新提DNA，使用可靠试剂盒或可靠手工提取试剂，1.2 酶的问题：确认内切酶有效[很多内切酶虽然有过期时间，但过期后只要能够有效酶切，可用。
确认酶切效果不好，做标记，更换] 。
【题外话：用内切酶注意】a. 内切酶如无特殊要求，保存-20~-30度。
并非越低越好，酶通常是保存在50％甘油缓冲液中，温度过低时，酶会发生冻结（运输过程例外，由于酶需要低温运输，所以方便的情况下是使用干冰，酶会冻结，但冻结次数有限，相对是一种比较好的选择），如果是经常使用的话，酶会被反复冻融，从而降低了活性。
当然如果温度过高，呵呵，你就自己想去吧。
b. 酶在使用时应置于冰盒中取酶。
这点大家都清楚，不过多强调也没坏处。
因为实验室有些同学，酶取出后是放在冰盒上的，但有两点忽略了：拿酶的时候，手不是抓着管子上端，而握在管子的底部，相当于用手在给酶进行加热；有些酶是放在冰盒中，但吸酶的时候，还是将酶拿出来。
偶尔一次没有大碍，反复如此，可能会影响酶活。
c. 酶使用完后应尽快旋紧盖子。
有时我们可以发现，即使是-20~-30度放置，酶仍然会冻结。
个人认为的可能原因是由于在配置酶切反应时，酶管的盖子在较长时间的开着，甘油会吸取空气中的水分，对于常用的大包装的酶有时就会出现冻结现象。
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限制性内切酶的一般原则和建议!
1．如何做酶切反应？
该问题看似什么简单： DNA中加上酶，然后保温一段时间就可以了。
但是在实际操作过程中，我们不断听到：切不动，装不上。
问题在什么地方？能系列生产限制性内切酶的公司国际上，就那么几个，位列前 3 的是NEB, Fermentas, SibEnzyme。
这些公司提供酶的品质一般都能得到保证。
您可以怀疑酶的质量问题，但是更多的问题来源于模板是否合适酶切要求。
下面几点对你的酶切是有帮助的。
1) 成功酶切的关键是准备好模板DNA。
DNA样品中不能含有有机溶剂（会使酶变性或产生星号货性），不能含有干扰酶活性的污染物质，不能含有高浓度的EDTA (TE中的EDTA浓度较低，对Mg的浓度影响较小)；同时要对DNA甲基化程度及其对酶切效率的影响要做到心中有数。
2) 选用合适的酶。
根据酶切序列选用，特别注意选用甲基化对酶活性的干扰。
3) 正确使用和保存酶。
酶需要保存在-20度的低温环境中，只是在需要用酶才从冰箱中取出来。
运输和临时存放时需要将酶至于冰上。
手拿酶管时不要接触酶管下步含酶的部分，移酶时尽可能用长TIP, 避免污染。
用完后需要及时送回原处。
注意：酶通常是最后加。
所有4) 反应体积需要根据实验目的定，常规的酶切一般要维持在10-50ul，酶切鉴定10-20ul就可以了。
5) 模板浓度问题：浓度过高，溶液黏度过大，酶不能有效扩散，酶切效果不会好。
浓度过低，也会影响酶活性。
6) 注意模板用量和反应体积的关系。
对酶用量，模板用量，反应体积等要素的确定需要的是时间和经验的积累。
7) 酶切反应的各个组分加完后，需要用TIP小心混匀几次，short spin 一下就可以保温了。
一般不能使用振荡器混匀。
8) 反应温度的选择。
一般反应都用37度，但是 Sma I 的最适合温度是25度，37度时酶仍表现出活性，但是效率下降50%。
部分从耐热菌制备的酶需要在37度以上的温度反应，如Taq I的最适温度为65度，37度保温，效率仅为前者的1/10。
9) 反应时间的选择。
一般酶切鉴定30分钟就可以了。
要完全酶切可以采用少量的酶长时间反应，或较高的酶量短时间处理都可以达到。
在使用高酶量的时候需要注意甘油的最终浓度不要超过5%，也就是说10ul的体系，酶的用量不要超过1ul。
10) 是否和如何终止反应？酶切鉴定之类的实验不需要特殊处理。
灭活的手段：加入高浓度的EDTA；65度或80度热处理20-30分钟；部分从高温菌纯化出来的内切酶由于最适的反应温度比较高，热处理灭活不一定完全，需要用苯酚/氯仿/乙醇方法纯化；电泳回收也是实验室常用除酶的手段。
2．如果遇到酶切不动或切不完全，该怎么办？
要回答这么问题常常需要了解酶活性单位是如何确定，我们多次接到这样的问题：1个单位的酶能在60分钟内切1ug的DNA,为什么我们的DNA那么少切那么长时间也不能切开或切完全？从下面几个因素去考虑： 1) 酶是否有活性：酶的活性单位通常是在60分钟酶切1ug lambda DNA或特定线状DNA所需要的酶量。
鉴定酶的活性高低不是用您待切的DNA模板，也不是别的公司的酶来判定。
因为不同公司酶可能是从不同系统中纯化的，虽然识别位点相同，但是酶的特性可能是有差异的。
鉴定酶必须使用使用说明书上认定的酶活确定的方式，通常需要用lambda DAN做模板来判定。
同时如果酶对甲基化敏感，还需要用Dcm-, Dam-的DNA.不排除由于运输或分装不当导致酶活性下降，这种情况是很少发生。
我们公
司销售的SibEnzyme公司的酶，在分装前严格检验过，不合格的东西（很少）都退回原厂，所以不合格的产品是不会送到用户手头的。
2) 模板性质是否清楚：如果 DNA的类型变了所需要的酶量也不同。
酶切效果与DNA的性质（线状，超螺旋状）、位点数目、位点左右的序列、甲基化程度、纯度等有很大的关系。
对超螺旋状DNA完全酶切所需要的酶量要比线状的高好几倍(在我们的目录上有部分酶是有标注的)，同时需要提高酶的用量（10U/ug）和延长反应时间等措施。
还有一个问题是有些时候DNA是从别人那里得到的，背景不清楚也造成困惑。
3) 模板纯度是否够：模板制备方式影响DNA的质量，制备过程中使用到乙醇，氯仿，苯酚，SDS, EDTA等如果残留在最终的DNA模板中，都会不同程度影响酶的活性。
Miniprep时如果用试剂盒抽提，需要的问题污染是变性剂和乙醇；如果是手工制备的，氯仿，乙醇，苯酚及细胞内其他杂质都会不同程度的干扰酶活性。
4) 甲基化程度对酶的活性是否有影响：细菌中主要有Dcm和Dam两种甲基化方式，在植物和动物细胞中主要是CG位被甲基化。
仔细看看使用的酶对甲基化的敏感情况，或许能找到酶切效率低或根本不能酶切的根源。
5) 反应条件是否合适：对照说明书，检查使用的温度是否正确，是否需要添加BSA, 是否使用正确的缓冲溶液。
由于缓冲液中基本都含有DTT,反复冻融会使模板使DTT降解。
注意有些研究人员将buffer长时间放在4度或室温，这是很不规范的行为。
6) 酶稀释和添加方式是否正确：一般要求在最后加酶，但是对同时做多个相同反应的时候，最后加酶有可能不很方便。
通常是将缓冲、酶和适量的水配制成一个混合物，然后分装，最后加模板。
需要提醒的是混合物（Master Mix）中由于没有底物的存在，离子强度也不对，酶可能要受到损伤。
这种提前混合的做法没有问题，只是动作要快一些，没有分装前的Mix，要求放在冰里，尽快使用。
3．如何设定PCR引物的保护碱基？
如果您想直接对PCR产物酶切，同时想获得理想的酶切效果，一般情况下需要在酶切位点序列5’端方向增加额外的保护碱基。
保护碱基的数目随酶的种类不同而不同，根据文献资料汇总，一般保护碱基有3-4个就可以了。
不提倡提供过多的保护碱基，因为太多的额外碱基会增加PCR扩增的难度，同时增加合成费用。
4．如何对PCR扩增的产物进行酶切？
Fermentas公司的研究表明，限制性内切酶在 PCR扩增体系中仍然有部分活性，可以通过稀释（3倍以上）扩增混合液，适当提高酶量和反映时间，进行酶切。
我个人认为需要对PCR产物进行酶切分析通常是为了或基因表型分析，由于Taq，Pfu等高温聚合酶在酶切温度（37度或更高）下，仍然保持一定的活性，高温聚合酶所具有的聚合或无模板添A或外切修正的功能仍在一定的程度上表现出来，可能会影响到酶切产物末端的正确性。
结果是要么装不上去，要么装上去切不下来，测序发现末端引物碱基少了。
正确安全的做法是先通过琼脂糖电泳回收产物，然后酶切，酶切可以适当提高酶的用量。
一般的做法是从50ulPCR反应中回收的产物，溶解于45ul水中，加入酶，酶切后的产物通过从溶液中回收DNA的方式直接回收，不需要跑琼脂糖电泳。