等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点教学提纲
IEF-PAGE聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳法
【实验目的】1.掌握聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦的基本原理2.学习用等电聚焦电泳测定蛋白质等电点的操作和方法【实验原理】等电聚焦法是一种特殊的聚丙烯酰胺凝胶电泳法。
它的特点是在凝胶柱中加入两性电解质载体-Ampholine，从而使凝胶柱上产生pH梯度。
当向两性载体凝胶施加电场时，即可形成pH梯度，pH梯度的顺序是从阳极到阴极pH值逐渐增大。
蛋白质为两性电解质，其所带电荷的性质和数量随所处环境的pH而变化。
当蛋白质在等电聚焦凝胶柱中进行电泳时，带电荷的蛋白质离子即在凝胶柱上泳动：带负电荷的蛋白质分子向阳极移动，带正电荷的蛋白质分子向阴极移动。
当蛋白质样品泳动到凝胶的某一部位，这一部位的pH值正好相当于该蛋白质的等电点时，蛋白质的净电荷为零不再移动，则聚焦形成一条蛋白质区带。
这种按等电点的大小在pH梯度某一相应位置进行聚焦的方法称为等电聚焦。
利用这种方法，在蛋白质聚焦的相应位置测定凝胶的pH值，就可得知该蛋白质的等电点。
【实验材料】1.实验器材小玻璃管：内径0.5cm，长10cm 2支；小玻管架；圆盘电泳槽；注射器和长针头；移液管；pH计2.实验试剂(1) 两性电解质载体凝胶：丙烯酰胺3.5g，N-甲叉双丙烯酰胺0.1g，pH3～10的Ampholine 2.5ml，核黄素溶液（4mg/100ml）12.5ml，加水至50ml。
(2) 蛋白质溶液：纯牛血清白蛋白7mg，溶于1ml蒸馏水。
此蛋白溶液应无盐离子。
(3) 5%磷酸溶液(4) 2%氢氧化钠溶液(5) 考马斯亮蓝R-250染色液：称取考马斯亮蓝R-250 0.25g，加入50%甲醇91ml和冰醋酸9ml。
(6) 40%蔗糖溶液(7) 12%三氯醋酸溶液(8) 脱色液乙醇：冰醋酸：蒸馏水=25：10：65（v/v）。
【实验操作】1. 取4ml两性电解质载体凝胶，置于抽气瓶中，加入0.07ml蛋白质溶液，轻轻摇动混匀，抽去气泡。
2. 取干净的小玻璃管2支，垂直放置，底端塞以橡皮塞，加入40%蔗糖溶液3～4滴，然后吸取抽气瓶中的两性电解质载体-蛋白质混合液1.8ml缓缓放入玻璃管中，加入胶液后立即用注射器加上一薄层水（3～5 mm高），使混合液表面与空气隔绝。
等电聚焦电泳测定血清蛋白质等电点
等电聚焦电泳测定血清蛋白质等电点【实验原理】等电聚焦电泳是利用具有pH梯度的两性电解质为载体，分离等电点(pI)不同的蛋白质等两性分子的电泳技术。
在IEF电泳系统中，具有一个从阳极到阴极，pH值逐渐增大的连续而稳定的pH梯度，处于此系统的各种蛋白质分子，将根据各自的pI值与所处位点的pH值的差别带上正电或负电。
当蛋白质分子向相反电极移动的过程中，其逐渐靠近与其DI相同的pH位点，直至到达pH=pI，净电荷为零而停止移动，从而达到聚焦。
因此，将pI不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一段时间后，各组分会分别聚焦在各自pI相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。
根据电泳装置的不同，IEF可分为管型IEF和平板型IEF，本实验介绍管犁PAGE—IEF．【试剂与器材】1．凝胶贮备液称取丙烯酰胺(Acr)20g，甲叉双丙烯酰胺(Bis)0．8g，蒸馏水溶解后定容至100mL，过滤，将未溶物滤去，盛于棕色瓶中，4℃冰箱保存。
2．1％(V/V)TEMED溶液。
3．5g/L过硫酸铵称取过硫酸铵0．5g，溶于蒸馏水100mL，冰箱存放，每周新配。
4．40％两性电解质载体。
5．0．5mmol/L磷酸溶液量取85％磷酸16mL，加蒸馏水定容至500mL。
6．0．5mmol/L NaOH溶液称取NaOH10g，加蒸馏水溶解并定容至500mL。
7．1g/L考马斯亮蓝固定染色液称取考马斯亮蓝R250 lg，溶于含甲醇200mL、乙酸100mL和蒸馏水700mL的混合液中，过滤后备用。
8．酸性乙醇脱色液乙醇25份，蒸馏水25份，冰醋酸8份，混匀备用。
9．血清样本血清无须稀释，但最好透析去除离子。
10．电泳仪选用电子管或晶体管整流电源，电压0~600V，电流0~300mA。
11．电泳槽圆盘电泳槽及电泳玻管。
12．锥形瓶，250px长针头或腰椎穿刺针头，5mL或10mL注射器。
食品安全检测农药兽药残留土壤成分分析焦炭成分分析【操作步骤】1．凝胶制备取洁净干燥的电泳玻璃管2支，将管底用胶布封闭，垂直放置在电泳管架上。
生物化学实验@凝胶等电聚焦法测定蛋白质等电点
相同： 1、都是蛋白质电泳 2、都用聚丙烯酰胺做载体 不同： 1、分离原理不同，IEF按pI, SDS-PAGE按分子量 分离。 2、载体形状不同， IEF-柱状， SDS-PAGE-平板。 3、IEF中聚丙烯酰胺为抗对流介质，SDS-PAGE中 聚丙烯酰胺为分子筛。
蛋白质的分离模式图 箭头代表移动方向，箭头长短代表移动速度， 右图为平衡时蛋白质的分离状态。
三、实验方法及流程
电聚焦流程： 制备载体（加样）→电泳4h→剥胶 →固定（本次省略）→测定距离 ∟ →制作pH梯度→测定（电脑作图） 实验方法： 预先准备洁净玻璃管（0.5ⅹ9cm）两根，下端封闭垂直插在管架上。 按下列配方在小烧杯内配制凝胶溶液（5mL） 1、凝胶贮备液 2.5mL 2、两性电解质载体 0.25mL（老师处） 3、2%TEMED 0.25mL 4、蛋白质样品 （经计算有1mg左右） 5、蒸馏水(超纯水） （适量） 6、10%过硫酸铵 0.05mL（最后加） 轻轻混匀，立即用滴管装管至离上端0.5cm处，再缓慢加蒸馏水 3-5mm高，静止聚合30分钟。待凝胶与水之间有明显界面时，即聚合 完毕。
聚合后，在电泳槽中电泳2-4小时。 剥胶（用长针头注射器） 量距离（整条胶长，条带至正极长度） 制作pH梯度，0.5cm从正极端切，放在细胞盘里，加1mL蒸 馏水，摇床0.5-1小时，用精密pH试纸测定。 电脑作图（找出等电点）。
SDS-PAGE和IEF的异同
凝胶等电聚焦法测定蛋白质等电点
一、原理:
IEF 1966年由瑞典科学家发明。
蛋白质分子由不同数量和比例的各种氨基酸组成，氨基酸侧 链在不同的pH值环境中所带的电荷不同，当蛋白质处于等电点时， 它的净电荷为零，因此可利用等电点差异分离。 凝胶等电聚焦法的关键是建立稳定的连续的pH梯度。用于建 立pH梯度的物质是两性电解质载体，它是一种多羧基多氨基的脂 肪族化合物，分子量在300-1000之间。国产和进口的两性电解质 载体均有各种规格。可以根据需要选择使用。良好的两性电解质 混合物，它的各种成分在等电点时有方法
实验九、等电聚焦电泳讲解材料
四、操作方法
1. 凝胶柱的制备
（1）玻璃管的一端插在橡皮帽中(与橡皮接触的部分凝胶不易 聚合，可在橡皮帽中先加一滴40%的蔗糖)
（2）配胶
表 10mL 7.5%凝胶的配制
试剂名称
体积(mL)
凝胶贮液
2.5
两性电解质载体
0.5
10%TEMED
0.1
蛋白质混合样品
(2) 加样量则取决于样品中蛋白质的种类、数目以 及检测方法的灵敏度。如用考马斯亮蓝R-250 染色，加样量可为50-150 g；如用银染色， 加样量可减少到1 g。一般样品浓度以0.5-3 mg/mL为宜，最适当加样体积为10-30 l。
六、思考题
(1)简述聚丙烯酰胺等电聚焦电泳的基本原理。
(2)进行聚丙烯酰胺等电聚焦电泳时的注意 事项有哪些？
3．剥胶
电泳结束后，取下凝胶管，用蒸馏水充分洗净两端电极 液，在凝胶条的正极端插一铜丝为标记。用灌满水的注射器 长针头插入凝胶与玻管管壁之间，边压水边慢慢转动玻管， 推针前进，同时注入水，靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁 与凝胶分开，凝胶条即可流出。
4 .固定染色
取其中一条凝胶条放在一块洁净的玻板上，用尺量出固 定前的凝胶条长度。放入染色液中同时进行固定染色1-2 h， 用蒸馏水漂洗数次后用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰， 量出蛋白带距正极端的距离。
实验九 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦 电泳测定蛋白质的等电点
一、目的要求
1.学习和掌握圆盘电泳技术 2.学习和掌握等电聚焦电泳测定蛋白Байду номын сангаас的等
电点方法
二、原理
聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(Isoelectric Focusing-PAGE，简称IEF-PAGE)：利用各种蛋白质 pI不同，以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，并在其 中加入两性电解质载体(carrier ampholytes)，两 性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极 到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。在电场作 用下，蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH 值等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区 带。
蛋白质等电点的测定实验报告
蛋白质等电点的测定实验报告一、实验目的1、了解蛋白质等电点的概念及其重要性。
2、掌握测定蛋白质等电点的基本原理和方法。
3、学会使用酸度计等仪器进行实验操作。
二、实验原理蛋白质是两性电解质，在溶液中会发生解离。
当蛋白质溶液处于某一 pH 值时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即净电荷为零，此时溶液的 pH 值称为该蛋白质的等电点（pI）。
在等电点时，蛋白质的溶解度最低，容易沉淀析出。
利用这一性质，可以通过调节溶液的 pH 值，使蛋白质沉淀，从而测定蛋白质的等电点。
本实验采用醋酸纤维素薄膜电泳法来测定蛋白质的等电点。
醋酸纤维素薄膜具有均一的微孔结构，对蛋白质分子的吸附作用小，电泳时泳动速度快，分辨率高。
在一定的电场强度下，不同 pH 值的缓冲溶液中，蛋白质分子会向与其所带电荷相反的电极方向移动。
当溶液的 pH值等于蛋白质的等电点时，蛋白质分子的净电荷为零，泳动速度为零。
三、实验材料与仪器1、材料新鲜鸡蛋醋酸纤维素薄膜巴比妥缓冲液（pH 86、pH 74、pH 64、pH 54）蛋白质染色液（氨基黑 10B）漂洗液2、仪器电泳仪酸度计培养皿镊子剪刀直尺四、实验步骤1、醋酸纤维素薄膜的处理将醋酸纤维素薄膜剪成 2×8cm 的小条，在巴比妥缓冲液（pH 86）中浸泡 30 分钟，使其充分浸透。
用镊子取出薄膜，用滤纸吸干多余的缓冲液。
2、点样用毛细管吸取少量鸡蛋清样品，在薄膜的无光泽面距一端 15cm 处轻轻点样，点样宽度不超过 05cm。
3、电泳将点样后的薄膜光滑面朝下，搭在电泳槽的支架上，两端分别与电泳槽的正、负极相连。
在电泳槽中加入巴比妥缓冲液（pH 86），使薄膜完全浸没在缓冲液中。
接通电源，调节电压为 160V，电泳 40 分钟。
4、染色与漂洗电泳结束后，将薄膜取出，放入氨基黑 10B 染色液中染色 10 分钟。
取出薄膜，放入漂洗液中漂洗数次，直至背景无色，蛋白质条带清晰可见。
5、测定 pH 值分别配制 pH 74、pH 64、pH 54 的巴比妥缓冲液。
等电点聚焦测蛋白质等电点
实验四等电点聚焦测蛋白质等电点宫魁六组200928006841083一、实验原理：等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，IEF实质就是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。
在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极之间逐步建立起稳定的pH梯度，当蛋白质分子或其它两性分子存在于这样的pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终到达一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是这种分子的pI。
聚焦在等电点的分子也会不断地扩散。
一旦偏离其等电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI迁移。
因此，这些分子总是处于不断地扩散和抗扩散的平衡之中，在pI处得以“聚焦”。
二、实验仪器和用具：玻璃管（4支）、封口膜、试管架、细长滴管、注射器和长针头、培养皿、刀片、烧杯、微量移液器、圆盘电泳槽及电泳仪三、试剂：0.1M磷酸（500ml）、0.1M氢氧化钠（1000ml）、丙烯酰胺储液、两性载体电解质、TEMED、牛血清蛋白样品（0.5mg/ml）、过硫酸铵（10%）、三氯乙酸（10%）等四、实验步骤：1、先将玻管洗净，用封口膜封的一端垂直放在架上；2、配胶：丙烯酰胺储液0、67ml两性载体电解质0、2mlTEMED 0、004ml牛血清蛋白质样品0、04ml蒸馏水 2.9ml过硫酸铵0.02ml3、用细长滴管加入溶液至10cm高处，胶面上加3—3cm高水层，进行封闭，聚合10—50min，吸出上层水，用滤纸稍微吸取；4、在电泳槽上槽加800ml磷酸，下槽500ml氢氧化钠；5、将管接入电泳槽，要求上端浸入液面，下端不接触下槽底面，注意排除凝胶下表面的气泡；6、接上电源，正极接酸，负极接碱；恒定160v，4h左右，电泳至电流为“0”；7、取胶将聚胶后的含蛋白质样品的凝胶借助注射器针头注水取出；8、量取三条胶的长度；9、pH梯度的测定取KCl溶液分别加入2ml于10只小管中，将欲测pH 梯度的胶条置于玻片上，用刀片切成1cm长的小段，按顺序放入有标号的小管中，盖好盖子，室温下过夜；10、次日用pH计测每只小瓶中浸泡液的pH值。
实验三等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点
实验三等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点一、实验目的了解等电聚焦的原理。
通过蛋白质等电点的测定，掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直管式等电聚焦电泳技术。
二、实验原理等电聚焦（Isoelectric focusing，简称IEF）是六十年代中期出现的新技术。
近年来等电聚焦技术有了新的进展，已迅速发展成为一门成熟的近代生化实验技术。
目前等电聚焦技术已可以分辨等电点（pI）只差0.001pH单位的生物分子。
由于其分辨力高，重复性好，样品容量大，操作简便迅速，在生物化学、分子生物学及临床医学研究中得到广泛的应用。
蛋白质分子是典型的两性电解质分子。
它在大于其等电点的pH环境中解离成带负电荷的阴离子，向电场的正极泳动，在小于其等电点的pH环境中解离成带正由荷的阳离子，向电场的负极泳动。
这种泳动只有在等于其等电点的pH环境中，即蛋白质所带的净电荷为零时才能停止。
如果在一个有pH梯度的环境中，对各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，则在电场作用下，不管这些蛋白质分子的原始分布如何，各种蛋白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH梯度中相对应的位置处进行聚焦，经过一定时间的电泳以后，不同等电点的蛋白质分子便分别聚焦于不同的位置。
这种按等电点的大小，生物分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为就称为“等电聚焦”。
等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的pH梯度，使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦，从而达到分离、测定和鉴定的目的。
两性电解质载体，实际上是许多异构和同系物的混合物，它们是一系列多羧基多氨基脂肪族化合物，分子量在300~1000之间。
常用的进口两性电解质为瑞典Pharmacia-LKB公司生产的Ampholine 和Pharmalyte，价格昂贵。
国产的有中国军事医学科学院放射医学研究所和上海生化所生产的两性电解质，价格便宜，质量尚佳。
两性电解质在直流电场的作用下，能形成一个从正极到负极的pH值逐渐升高的平滑连续的pH梯度。
聚丙烯酰胺凝胶平板等电聚焦电泳测定蛋白质等电点
聚丙烯酰胺凝胶平板等电聚焦电泳测定蛋白质等电点一、目的：学习聚丙烯酰胺凝胶平板等电聚焦电泳测定蛋白质等电点的原理及方法。
二、原理：等电点聚焦（isoelectric focusing, IEF）或简称电聚焦（electrof ocusing），也曾称等电点分离聚焦电泳等。
它是60年代中期出现的技术，克服了一般电泳易扩散的缺点。
近年来，等电点聚焦电泳又有了新的进展，可以分辨等电点只差0.001pH单位的生物分子。
由于它的分辨力高、重复性好、样品容量大、操作简便、迅速，在生物化学、分类学、分子生物学及临床医学研究等诸方面，都得到广泛应用。
等电点聚焦电泳产生pH 梯度的方法有两种：一是用两种不同的pH缓冲液相互扩散，在混合区形成pH梯度，此为人工pH梯度。
这种pH梯度不稳定，常用于制备电泳；另一种是利用载体两性电解质在电场作用下形成自然pH梯度。
本实验就是利用载体两性电解质形成的自然pH梯度进行蛋白质样品等电焦聚电泳的。
理想的载体两性电解质应该在其本身的等电点处有足够的缓冲能力和良好的导电性，且分子量要小，组成与被分析样品有所区别，对分析样品无变性作用或发生化学反应。
常用的载体两性电解质是一系列脂肪族多氨基和多羧基类的混合物，即是一系列的异构物和同系物，分子量在300—1000之间，各组分的等电点(pI)既有差异又相接近，pI的范围在2.5—11之间。
合成载体两性电解质的原料是丙烯酸和多乙烯多胺，合成反应如下：R1 和R2为氢或带有氨基的脂肪基。
这一反应的特点是生成众多的异构物和同系物的混合物，而不是均一的化合物。
混合物中各成分的含量、等电点的分布，取决于原材料的性质、比例和合成条件。
目前常用的载体两性电解质的商品有：Ampholine（LKB公司）、Pharmlyte（Phar macia公司）、 Serralyty（Serva公司），近来已有国产商品了。
不同厂家合成的方法不同，电泳的条件也略有不同。
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实验三等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点
一、实验目的
了解等电聚焦的原理。
通过蛋白质等电点的测定，掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直管式等电聚焦电泳技术。
二、实验原理
等电聚焦（Isoelectric focusing，简称IEF）是六十年代中期出现的新技术。
近年来等电聚焦技术有了新的进展，已迅速发展成为一门成熟的近代生化实验技术。
目前等电聚焦技术已可以分辨等电点（pI）只差0.001pH单位的生物分子。
由于其分辨力高，重复性好，样品容量大，操作简便迅速，在生物化学、分子生物学及临床医学研究中得到广泛的应用。
蛋白质分子是典型的两性电解质分子。
它在大于其等电点的pH环境中解离成带负电荷的阴离子，向电场的正极泳动，在小于其等电点的pH环境中解离成带正由荷的阳离子，向电场的负极泳动。
这种泳动只有在等于其等电点的pH环境中，即蛋白质所带的净电荷为零时才能停止。
如果在一个有pH梯度的环境中，对各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，则在电场作用下，不管这些蛋白质分子的原始分布如何，各种蛋白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH梯度中相对应的位置处进行聚焦，经过一定时间的电泳以后，不同等电点的蛋白质分子便分别聚焦于不同的位置。
这种按等电点的大小，生物分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为就称为“等电聚焦”。
等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的pH梯度，使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦，从而达到分离、测定和鉴定的目的。
两性电解质载体，实际上是许多异构和同系物的混合物，它们是一系列多羧基多氨基脂肪族化合物，分子量在300~1000之间。
常用的进口两性电解质为瑞典Pharmacia-LKB公司生产的Ampholine 和Pharmalyte，价格昂贵。
国产的有中国军事医学科学院放射医学研究所和上海生化所生产的两性电解质，价格便宜，质量尚佳。
两性电解质在直流电场的作用下，能形成一个从正极到负极的pH值逐渐升高的平滑连续的pH梯度。
若不同的pH值的两性电解质的含量与pI值的分布越均匀，则pH梯度的线性就越好。
对Ampholine两性电解质的要求是缓冲能力强，有良好的导电性，分子量要小，不干扰被分析的样品等。
在聚焦过程中和聚焦结束取消了外加电场后，如保持pH梯度的稳定是极为重要的。
为了防止扩散，稳定pH梯度，就必须加入一种抗对流和扩散的支持介质，最常用的这种支持介质就是聚丙烯酰胺凝胶。
当进行聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳时，凝胶柱内即产生pH梯度，当蛋白质样品电泳到凝胶柱内某一部位，而此部位的pH值正好等于该蛋白质的等电点时，该蛋白质即聚焦形成一条区带，只要测出此区带所处部位的pH值，即为其等电点。
电泳时间越长，蛋白质聚焦的区带就越集中，越狭窄，因而提高了分辨率。
这是等电聚焦的一大优点，不像一般的其他电泳，电泳时间过长则区带扩散。
所以等电聚焦电泳法不仅可以测定等电点，而且能将不同等电点的混合的生物大分子进行分精品文档
离和鉴定。
早期的等电聚焦电泳是垂直管式的，其特点是体系是封闭的，不与空气接触，可防止样品氧化。
近年来，又发展了超薄层水平板式等电聚焦电泳。
此法的优点是加样数量多，节省两性电解质，电泳后固定、染色、干燥都十分迅速简便，其最大优点是防止了电极液的电渗作用而引起正负两极pH梯度的漂变。
测定pH梯度的方法有四种：
1. 将胶条切成小块，用水浸泡后，用精密pH试纸或进口的细长pH复合电极测定pH值，然后作图。
2. 用表面pH微电极直接测定胶条各部分的pH值，然后作图。
3. 用一套已知不同的pI值的蛋白质作为标准，测定pH梯度的标准曲线。
4. 将胶条于－70℃冰冻后切成1mm的薄片，加入0.5ml 0.01M KCl，用微电极
测其pH。
三、仪器和用具
1. 电泳仪
2. 垂直管式园盘电泳槽一套
3. 注射器与针头
4. 移液管：10ml、5ml、2ml、1ml、0.1ml
5. 小烧杯若干
6. 培养皿一套
7. 直尺
8. 小刀
9. 精密pH试纸和带细长复合pH电极的pH计
10. 塑料薄膜和橡皮筋
四、试剂
1. 丙烯酰胺
2. 甲叉双丙烯酰胺
3. 两性电解质Ampholine（40%，pH3.5~9.5）
4. 过硫酸胺（催化剂）
5. TEMED（四甲基乙二胺）（加速剂）
6. 磷酸
7. NaOH
8. 三氯乙酸（TCA）
五、溶液配制
1. 丙烯酰胺贮液（30%丙烯酰胺，交联度
2.6%）：，30g丙烯酰胺和0.8g甲叉双丙烯酰胺溶于H2O，定容至100ml，滤去不溶物后存于棕色瓶，4℃可保存数月。
（全班公用）（另一配方为29.1g 丙烯酰胺和0.9g 甲叉双丙烯酰胺溶于H2O，定容至100ml，交联度为
3.0%）。
2. 两性电解质Amphline（40%）的加入量为：50 l /ml 胶液。
3. 过硫酸胺：配成1mg/ml的浓度，当天配制，配100ml全班公用。
胶液中的加入精品文档
精品文档
量为0.5mg/ml 胶液。
4. TEMED ：胶液中的加入量为1μl/ml 胶液。
5. 蛋白质样品：选用两种等电点相差较大的蛋白质，每根垂直管中每种蛋白质的加样量控制在<100μg 。
蛋白质样品配制成各为5mg/ml 的浓度。
配2.5ml 全班公用。
6. 固定液：10%的三氯乙酸，每组配50ml 。
7. 阳极电极液：0.1M H 3PO 4
3.4ml 浓磷酸（85%）加H 2O 至500ml ，每个电泳槽用500ml 。
8. 阴极电极液：0.5M NaOH
2g NaOH 加H 2O 溶解至500ml ，每个电泳槽用500ml 。
六、操作步骤
1. 配胶
过硫酸铵是胶聚合的催化剂，因此最后加入，加毕，立即摇匀，因胶很快就会聚合，必须立即装管。
通常化学聚合的胶液，需在过硫酸铵加入前进行减压抽气处理，本实验将此抽气步骤省略并不影响实验结果。
2. 装管
每个学生装两支管，每组装四支。
先用肥皂洗手，然后将圆盘电泳槽的玻璃管洗净，底端用塑料薄膜和橡皮筋封口，垂直放在试管架上，用移液管将配好的胶液移入管内，（每根玻璃管的容量约为1.5~1.8ml ）,液面加至距管口1mm 处，用注射器轻轻加入少许%
100⨯⨯=
胶液总体积
贮液加入量
丙烯酰胺贮液浓度胶浓度T %
100⨯+=
b
a b
C 甲叉双丙烯酰胺的量胶液中丙烯酰胺的量的量胶液中甲叉双丙烯酰胺交联度%
6.2%1008
.0308
.0=⨯+=
C 交联度
精品文档
H 2O ，进行水封，以消除弯月面使胶柱顶端平坦。
胶管垂直聚合约30分钟，聚合完成时可观察到水封下的折光面。
3. 装槽和电泳
用滤纸条吸去胶管上端的水封，除去下端的薄膜，水封端向上，将胶管垂直插入圆盘电泳槽内，调节好各管的高度，记下管号。
每支管约1/3在上槽，2/3在下槽。
上槽加入500ml 0.1M H 3PO 4，下槽加入500ml 0.1M NaOH ，淹没各管口和电极，用注射器或滴管吸去管口的气泡。
上槽接正极，下槽接负极，开启电泳仪，恒压160V ，聚焦2至3小时，至电流近于零不再降低时，停止电泳。
4. 剥胶
取下胶管，用H 2O 将胶管和两端洗2次，用注射器沿管壁轻轻插入针头，在转动胶管和内插针头的同时分别向胶管两端注入H 2O 少许，胶条即自行滑出，若不滑出可用洗耳球轻轻挤出。
胶条置于小培养皿内，记住正极端为“头”，负极端为“尾”，若分不清时，可用pH 试纸鉴定，酸性端为正，碱性端为负。
5. 固定
取2支胶条置于一个小培养皿内，倒入10%三氯乙酸溶液至没过胶条，进行固定，约半小时后，即可看到胶条内蛋白质的白色沉淀带。
固定完毕，倒出固定液，用直尺量出胶条长度“L 2”和正极端到蛋白质白色沉淀带中心（即聚焦部位）的长度“L ’”。
固定后的胶条可在康强860紫外/可见分光光度计上用280nm 或238nm 波长作凝胶扫描，然后用扫描图作相应的测量和计算。
6. 测定pH 梯度
将放在另一个培养皿内未固定的胶条，用直尺量出待测pH 胶条的长度“L 1”。
按照由正极至负极的顺序，用镊子和小刀依次将胶条切成10mm 长的小段，分别置于小试管中，加入1ml H 2O ，浸泡半小时以上或过夜，用仔细校正后的带细长pH 复合电极的pH 计测出每管浸出液的pH 值。
七、数据处理
1. 以胶条长度（mm ）为横座标，pH 值为纵座标作图，得到一条pH 梯度曲线。
所测每管的pH 值为10mm 胶条的pH 的混合平均值。
作图时将此pH 值取为10mm 小段中心即5mm 处的pH 值。
2. 用下式计算蛋白质聚焦部位至胶条正极端的实际长度L ：
上式中： L’——量出蛋白质的白色沉淀带中心至胶条正极端的长度。
L 1——测pH 的胶条的长度 L 2——固定后胶条的长度
3. 根据计算出的L ，由pH 梯度曲线上查出相应的pH 值，即为该蛋白质的等电点。
4. 画出固定后所测胶条的示意图。
2
1'L L L L ⨯
=。