LAMP技术原理和引物设计
环介导等温扩增技术
简单，快速，准确的基因扩增法
四、问题分析
1.随机采取鸽子翅或尾部羽髓样，用试剂盒提取DNA
01
2.在家鸽在W染色体上找到保守基因并以LAMP引物设计
02
软件设计引物
3.进行应用LAMP法扩增目的基因、不断优化dNTPs、
03
Mg2+、甜菜碱浓度，反应体系温度，反应结果由紫红色
变为天蓝色为雌性，否则为雄性
80℃水浴，5min，结束反应，加指示剂
LAMP反应体系
三、应用
1、LAMP在食品安全中的应用：
水产品和水体中灿烂弧菌现场可视化环介导等温扩增快检方法的建立及应用；环介导等温扩增 技术快速检测植物蛋白饮料中大豆成分等
2、LAMP在动植物疫病检测中的应用：
环介导等温扩增技术检测鼠疫感染动物敏感性的应用性研究；
感谢各位观看
Thank You
3、LAMP在人类疾病检测中的应用：
环介导等温扩增技术在新型冠状病毒检测中的应用研究进展；环介导等温扩增技术（LAMP） 在肺结核诊断中的应用研究
四、问题分析
生产上的鸽子性别 鉴定主要通过PCR 和翻肛鉴别，不太 适用于养殖户
鉴别方法比较
LAMP法
PCR法
翻肛鉴别
温度 时间 产物量 特异性 检测
试剂
二、原理
设计四条引物，包括两条内引 物和两条外引物，利用DNA链在 60-65℃的恒温条件下处于解链 和退火的动态平衡状态，在DNA 聚合酶的驱动下结合靶序列启 动DNA合成，反应中生成LAMP反 应特有的焦磷酸镁白色沉淀， 运用HNB指示剂显色反应。
二、流程
制作LAMP反应体系，12.5uL，如右图 放入200uL PCR管中，离心混匀 64℃水浴，90min
lamp等温扩增技术原理
lamp等温扩增技术原理LAMP等温扩增技术是一种高灵敏度的基于序列特异性寡核苷酸探针的新型核酸检测方法，由于其极高的灵敏度、特异性和快速性，广泛应用于疾病的诊断与研究中。
该技术的原理可以分为以下步骤：第一步：沙门氏菌DNA引物的特异性结合并扩增LAMP等温扩增技术采用一组详细的引物设计，使其具有高度特异性，能够在目标核酸序列的正常条件下，加速酶间反应来扩增目标序列。
针对沙门氏菌的DNA扩增，引物组成为2个反向外部引物、2个内部引物和一个环引物。
反向外部引物的特异性结合在目标DNA序列的外侧，内部引物则在外部引物结合后依次将产物扩增。
环引物在推进反向内外部引物的条件下，促进并加速扩增反应的进行。
该技术最大的优势在于，即使非特异性的DNA序列存在，也能在反应系统中抑制它们的扩增，从而提高扩增产物的特异性。
第二步：单管内扩增反应LAMP等温扩增技术在单个反应管中完成扩增，因此省去了扩增过程中由于分离和清洗产物所需的步骤，从而能够提高扩增的效率。
同时，该技术利用因特异性扩增反应而产生的大量产物来实现放大反应信号。
由于其不需要复杂的设备，仅需要水槽温度控制器和能够给温度控制提供稳定电源的仪器即可完成。
整个扩增过程中，所有反应物成分的变化均与恒定温度下运行。
第三步：利用Dye负电荷的反应性质由于在反应中引物的选取和调额完全根据目标DNA的序列比对所进行，因此LAMP等温扩增技术具有绝对的特异性。
同时，其采用的是特殊的Dye（反应染色），具有负电荷和荧光反应性质，在在反应完成后，在阳性结果的情况下，消耗成本非常低。
而在负性结果的情况下，由于该Dye信号使读取结果清晰方便。
由此，LAMP等温扩增技术结果得到广泛的应用，例如疾病的检测、环保检测等领域，得到了广泛应用。
疫情爆发的现实情况促使LAMP等温扩增技术得到了更广泛的应用，因为该技术的使用，并不需要高技术门槛和特别条件，能够在不同的场景中提供高效、可靠、精确的检测结果，不仅在意大利等高发疫区广泛应用，也得到了世界范围内各国科研人员和医务行业的关注和使用。
lamp原理
lamp原理和应用情况
LAMP 原理:
环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，是一种新型的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerasc)的作用下，60--65℃恒温扩增，15-60rain左右即可核酸扩增，效率可达109～10m个数量级，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。
在DNA合成时，从脱氧核酸三磷酸基质(dNTPs) 中析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的镁离子反应，产生大量焦磷酸镁沉淀，呈现白色。
因此，可以把浑浊度作为反应的指标，只用肉眼观察白色浑浊沉淀，就能鉴定扩增与否，而不需要繁琐的电泳和紫外观察。
由于LAMP反应不需要PCR 仪和昂贵的试剂，有着广泛的应用前景。
LAMP法的应用领域:
灵活运用能够简单、快速地进行基因扩增的特征,在各个领域得到广泛应用
食品领域:食物中毒致病菌的检测,食品的卫生管理,食物中毒的防止;
临床领域:病原菌、病毒的检测及鉴定,通过SNP多态性分型决定用药量;
农业领域:植物病害的早期发现及蔓延防止,转基因作物的检测;
环境领域:环境、水中病原微生物的检测;
工业领域:工业产品用大量DNA的生产成为可能;
畜牧业领域:雌雄性别判断,病原微生物的检测,遗传病的发现.。
LAMP技术及其在微生物检测中的应用
LAMP技术及其在微生物检测中的应用近年来，随着食品安全事件的频繁发生，食品安全问题受到了越来越多的重视。
然而，在食品微生物检测过程中，传统的检测方法已经远远不能满足微生物快速、简易、高特异性的鉴定要求。
随着分子生物学技术的发展，核酸扩增法已经被广泛应用于病原微生物的鉴定，LAMP法（即环-媒恒温核酸扩增方法）就是近几年发展起来的新技术之一。
1 LAMP技术简介1.1 LAMP技术原理LAMP法是由Notomi等[1]于2000年开发出来的一种连续、恒温、基于酶反应的新型核酸扩增方法，其原理是针对靶基因的6个区域设计两对特殊的内、外引物，利用一种链置换DNA聚合酶（Bst酶）在恒温条件（60-65℃）下启动循环链置换反应。
在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物。
LAMP反应过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过肉眼观察判定扩增与否。
1.2 LAMP技术的优缺点1.2.1 优点1.2.1.1 特异性强、灵敏度高4条引物可以严格识别靶核酸序列上的6个独立区域，反应过程不会受到反应混合物种非靶序列DNA的影响，保证了LAMP扩增的高度特异性。
在检测过程中可以根据是否扩增就能判断目标基因是否存在，可用于细菌或病毒的定性检测。
1.2.1.2 等温高效L AMP在等温条件下扩增，不会因温度改变而造成时间的损失，在1h 内可将靶序列扩增至109~1010倍。
而且受非靶序列的影响小，模板也不需要热变性。
1.2.1.3 整个扩增反应操作简便、快捷LAMP反应过程中会产生白色的焦磷酸镁沉淀，肉眼即可直接观察，是鉴定反应是否进行的最直接方法。
另外，LAMP扩增产物可以像PCR 反应利用凝胶电泳结合成像系统进行鉴定，通过产生的不同梯型来区分特异性扩增和非特异性扩增。
1.2.1.4 实验装置简单，费用相对较低LAMP反应不需要进行模板的热变性、长时间的温度循环、繁琐的电泳和紫外观察等，在操作过程中，仅需要普通的水浴锅或其他可以得到稳定热源的设备即可。
LAMP技术原理和引物设计
LAMP技术原理和引物设计LAMP技术（Loop-mediated isothermal amplification），中文称为环介导等温扩增技术，是一种于2000年由Eiken Chemical Co. Ltd.日本公司开发的基于异十四链聚合酶反应（Bst聚合酶）的异源DNA快速扩增技术。
LAMP技术通过引物设计和反应条件的优化，实现在等温条件下对目标DNA的高效扩增。
下面将分别介绍LAMP技术的原理和引物设计。
LAMP技术的核心原理是通过酶的协同作用，在等温条件下进行DNA的扩增。
它利用一种特殊的DNA聚合酶（Bst聚合酶），能够在不需要高温退火的情况下，具有高度特异性和高效率地进行DNA合成。
LAMP技术本身具有极高的扩增速度，优势在于其在等温下，不需要复杂的设备和严格的实验条件，可以简化扩增过程。
同时采用特殊设计的引物组合，能够提高扩增特异性。
1.初始化反应：将反应体系中的DNA片段与引物（包括2个外端引物和2个补体引物）结合；2. 引物扩增：引物与Bst聚合酶作用，反应体系中的DNA得到扩增；3.聚合物合成：一种特殊的引物结合到目标DNA的5'末端，通过内端引物和内部位点进行扩增；4.循环放大：扩增产物作为新的模板参与反应，进行连续循环扩增。
通过这种等温扩增的方法，LAMP技术可以在短时间内获得大量的目标DNA，且具有很高的扩增特异性和灵敏度，可以用于分子生物学、诊断医学和病原检测等领域。
引物设计：引物设计是LAMP技术成功应用的重要因素之一、LAMP技术使用了4个单链引物，包括2个外端引物（forward outer primer，F3和reverse outer primer，B3）和2个内端引物（forward inner primer，FIP和reverse inner primer，BIP）。
外端引物负责扩增DNA的初始段，内端引物负责扩增DNA的中间段。
在引物设计中，需要注意以下几个方面：1.引物的特异性：要求引物能够有高度特异地结合到目标DNA的区域，确保扩增的目标是准确的；2.引物的长度和碱基组成：引物的长度通常为20-24个碱基，碱基组成要尽量避免重复序列和形成组内结构，以保证扩增效率和特异性；3.引物的位置和方向：合理选择引物的位置和方向，以确保扩增产物的特异性和有效性；4.引物的浓度：引物的浓度需要进行优化，以获得最佳的扩增效果。
lamp引物设计入门
选中Nucleotide 在此处输入需要查找的信息LAMP引物设计简介第一部分，如何查找序列首先，登录NCBI(美国国立生物技术信息中心)的网站，网址/，查找我们所需要的序列，具体操作如下：点开NCBI的主页，点开All Datebases，选中下拉菜单中的Nucleotide，然后在右边对话框中输入我们所需要查找的物种的拉丁名以及基因的英文名称。
比如说我要查找大肠杆菌的16S rDNA的序列，那么只需要将大肠杆菌的拉丁名Escherichia coli以及16S rDNA输入即可，如下图所示，然后点击search。
如果NCBI的GenBank数据库有这些序列，那么我们就可以找到我们所需要的序列了。
当然，数据库中可能会出现很多相关的序列，这时我们需要自己慢慢查找自己需要的序列信息，如下图所示：接下来我们就浏览这些信息，然后将我们需要的信息复制下来，粘贴到TXT或者Word里。
这里我们示例选中的是第20条信息，当然你可以打开所有的你需要的信息。
如下图所示，我们可以得到基因的全部信息，包括来源、出自那片文献、核酸序列等等。
这样，我们的序列查找就完成了。
当然并不是所有物种的基因都可以在这里找到，在查不到的情况下，就需要我们自己通过PCR的方法将我们所需要的基因扩增出来，然后测序获得序列信息。
第二部分序列比对目前有一些分子生物学软件可以用于序列比对分析，像DNASTAR、ClustalW、MEGA等等，这里我们以MEGA5.0为例进行讲解。
首先，将目标序列和其它需要与其比对的序列放入一个文本文档中，以大肠杆菌的16S rDNA为例，格式如下图所示：打开MEGA5.0软件，点击Alignment的下拉菜单，选取Alignment的下拉菜单，选取Edit/Build Alignment，出现一个Alignment Editor的对话框，然后选择Creat a new alignment，点击OK。
出现下面的对话框，选择DNA软件就会出现下图的界面，单击Edit，选择下拉菜单中的Insert Sequence From File然后我们就把大肠杆菌的16S rDNA的序列及其他细菌的16S rDNA序列上传，出现下图的对话框，点击Alignment，选择下拉对话框的Align by ClustalW，对这个序列进行比对。
LAMP实验简介
通过LAMP实现DNA的线性扩增一、LAMP 原理60-65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态。
因此，DNA在此温度下合成是可能的。
利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶。
使得链置换DNA合成在不停地自我循环。
扩增分两个阶段。
第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。
上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合，在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。
外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链。
FIP上的F1c与此单链上的Fl为互补结构。
自我碱基配对形成环状结构。
以此链为模板。
下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。
迅速以3' 末端的Fl区段为起点。
以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。
该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。
第2阶段是扩增循环阶段。
以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合。
开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构。
迅速以3’末端的B1区段为起点，以自身为模板。
进行DNA合成延伸及链置换．形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交。
启动新一轮扩增。
且产物DNA长度增加一倍。
在反应体系中添加2条环状引物LF 和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成，周而复始。
扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物。
且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。
二、实验流程二、阶段实验及需要解决的问题(一) 实验准备阶段1、引物设计2、模板中引入合适的酶切位点3、不同梯度拷贝数模板的准备4、反应仪器的准备5、具有链置换活性的DNA聚合酶的选择6、扩增产物的检测方法7、扩增产物量的检测(二) 实验阶段1、反应体系的确定2、模板浓度的优化3、反应时间的优化4、扩增产物的检测5、以PCR的扩增作为对照三、具体实验方案(一) 引物的设计LAMP引物设计的在线网站(http://primerexplorer.jp/e/)，只要导入靶基因就能自动生成成组引物。
LAMP技术剖析
• • •
3 LAMP的特点 LAMP与以往的核酸扩增方法相比具有如下优点： (1)操作简单，LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，对于中小医院只需要水浴锅即可， 产物检测用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度即可判断。对于RNA的扩增只需要在反应 体系中加入逆转录酶就可同步进行(RT．LAMP)，不需要特殊的试剂及仪器。 (2)快速高效，因为不需要预先的双链DNA热变性．避免了温度循环而造成 的时间损失．核酸扩增在l h内均可完成，添加环状引物后时间可以节省1／2，多数情 况在20。30 rain均可检测到扩增产物。且产物可以扩增至109倍，达0.5 mg／mL．应 用专门的浊度仪可以达到实时定量检测。 (3)高特异性，由于是针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。6个区域中任何区域 与引物不匹配均不能进行核酸扩增。故其特异性极高。 (4)高灵敏度，对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR高出数量级的差异。
•2.引物的Trn值
• 引物的Tm值采用近邻分析法(the nearest-neighbor method)来计算，这种方法是目前 认为计算值最接近真实值的一种方法。计算Tm值的时候会受到盐浓度(salt concentration), 寡核苷酸的浓度等实验条件的影响，所以最好是在确定的实验条件下来计算Tm值。
•2．扩增原理 • 60—65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态。因此，DNA在此 温度下合成是可能的。利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成在不 停地自我循环。扩增分两个阶段。 • 第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离， 变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合（如图B所示），在链置换型DNA聚合酶的作 用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链 （如图C所示）。FIP上的F1c与此单链上的Fl为互补结构。自我碱基配对形成环状结构（如图C所示）。 以此链为模板。下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3’ 末端的Fl区段为起点．以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循 环的起始结构。 • 第2阶段是扩增循环阶段。以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合。开始链置换合成，解离出 的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的B1区段为起点，以自身为模板。进行DNA合成延伸及 链置换．形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交。启动新一轮扩增。且产 物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动链置 换合成，周而复始。扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物。且产物DNA为 扩增靶序列的交替反向重复序列。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
LAMP原理及引物设计与实例
．LAMP引物的设计
LAMP引物的设计主要是针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3' 端的F3c、F2c和Flc区以及5' 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。
FIP(Forward Inner Primer)：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因5' 端的Flc区域序列相同。
F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补。
BIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer )，由B1C和B2区域组成，B2区与靶基因3' 端的B2c区域互补，B1C域与靶基因5' 端的Blc区域序列相同.
B3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer )，由B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。
2．扩增原理
60-65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态。
因此，DNA在此温度下合成是可能的。
利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶。
使得链置换DNA合成在不停地自我循环。
扩增分两个阶段。
第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。
上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合（如图B所示），在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。
外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链（如图C所示）。
FIP上的F1c与此单链上的Fl 为互补结构。
自我碱基配对形成环状结构（如图C所示）。
以此链为模板。
下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。
迅速以3' 末端的Fl区段为起点。
以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。
该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。
第2阶段是扩增循环阶段。
以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合。
开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构。
迅速以3’末端的B1区段为起点，以自身为模板。
进行DNA合成延伸及链置换．形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交。
启动新一轮扩增。
且产物DNA长度增加一倍。
在反应体系中添加2条环状引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成，周而复始。
扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物。
且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。
MP的特点
LAMP与以往的核酸扩增方法相比具有如下优点：
(1)操作简单，LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，对于中小医院只需要水浴锅即可，产
物检测用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度即可判断。
对于RNA的扩增只需要在反应体系中加入逆转录酶就可同步进行(RT．LAMP)，不需要特殊的试剂及仪器。
(2)快速高效，因为不需要预先的双链DNA热变性．避免了温度循环而造成的时间损失．核酸扩增在l h内均可完成，添加环状引物后时间可以节省1／2，多数情况在20。
30 rain均可检测到扩增产物。
且产物可以扩增至109倍，达0.5 mg／mL．应用专门的浊度仪可以达到实时定量检测。
(3)高特异性，由于是针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。
6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增。
故其特异性极高。
(4)高灵敏度，对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR高出数量级的差异。
缺点：由于LAMP扩增是链置换合成，靶序列长度最好在300 bp以内。
>500 bp则较难扩增。
故不能进行长链DNA的扩增。
由于灵敏度高。
极易受到污染而产生假阳性结果。
故要特别注意严谨操作，以及在产物的回收鉴定、克隆、单链分离方面均逊色于传统的PCR方法。
4.引物设计实例
LAMP引物设计的在线网站(http://primerexplorer.jp/e/)，只要导入靶基因就能自动生成成组引物。
以某一微生物的鞭毛基因为例讲解一下LAMP相物设计的过程：
首先，单击浏览按钮选择靶基因序列文件，靶序列默认的是小于22 kbp。
支持三个类型的文件，普通文本格式（仅含序列）。
FASTA格式和GenBank 格式文件。
第二，从下面三个选项中选择定参数设定（引物设计条件）条件。
基于GC含量的自动判断, 起始的参数是特定的：如果GC含量小于或等于45%，则选取AT丰度高的区，如果GC含量高于60%，则选取GC丰度高的区,其它情况是标准设定状态。