TTC根系活力测定方法

TTC溶液的配制：取3g TTC溶于1L蒸馏水或冷开水中，配制成01％的TTC溶液。

药液PH应在65～75，以PH试纸试之(如不易溶解，可先加少量酒精，使其溶解后再加水)。

【方法】
1将玉米、小麦等作物的新种子、陈种子或死种子，用温水(30℃)浸泡2～6H，使种子充分吸胀。

2随机取种子2份，每份50粒，沿种胚中央准确切开，取每粒种子的一半备用。

3把切好的种子分别放在培养皿中，加TTC溶液，以浸没种子为度。

4放入30～35℃的恒温箱内保温30Min。

也可在20℃左右的室温下放置40～60Min。

5保温后，倾出药液，用自来水冲洗2～3次，立即观察种胚着色情况，判断种子有无生活力
植物根系活力的测定（TTC法）
一、原理
氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准氧化电位为80 mV的氧化还原色素，溶于水中成为无色溶液，但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲（TTF），如下式：
生成的三苯甲（TTF）比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化，所以TTC被广泛用作酶试验的氢受体，植物根系中脱氢酶所引起的TTC还原，可因加入琥珀酸、延胡索酸、苹果酸得到增强，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。

所以TTC还原量能表示脱氢酶活性，并作为根系活力的指标。

二、实验材料、试剂与仪器设备
（一）实验材料
水培或砂培小麦、玉米等植物根系。

（二）试剂
1. 乙酸乙酯（分析纯）。

2. 次硫酸钠（Na2S2O4，分析纯），粉末。

3. 1％TTC溶液：准确称取TTC 1.0 g，溶于少量水中，定容到100 mL。

用时稀释至需要的浓度。

4. 磷酸缓冲液（1/15 mol/L，pH7.0）。

5. 1 mol/L硫酸：用量筒取比重1.84的浓硫酸55 mL，边搅拌边加入盛有500 mL蒸馏水的烧杯中，冷却后稀释至1000 mL。

6. 0.4 mol/L琥珀酸：称取琥珀酸4.72 g，溶于水中，定容至100 mL即成。

（三）仪器设备
小烧杯3个，研钵1个，移液管：0.5 mL 1支、10 mL 1支、5 mL 3支，刻度试管6支，分光光度计，分析天平（感量0.1 mg），电子顶载天平（感量0.1 g），温箱，试管架，药勺，石英砂适量，滤纸。

三、实验步骤
1. 定性测定
（1）配制反应液把1％TTC溶液、0.4 mol／L的琥珀酸和磷酸缓冲液按1:5:4比例混合。

（2）把根仔细洗净，把地上部分从茎基部切除。

将根放入三角瓶中，倒入反应液，以浸没根为度，置37℃左右暗处放1～3 h，以观察着色情况，新根尖端几毫米以及细侧根都明显地变成红色，表明该处有脱氢酶存在。

2. 定量测定
（1）TTC标准曲线的制作取0.4％TTC溶液0.2 mL放入大试管中，加9.8 mL乙酸乙酯，再加少许Na2S2O4粉末摇匀，则立即产生红色的TTF。

此溶液浓度为每毫升含有TTF 80 µg。

分别取此溶液0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL置10 mL刻度试管中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含TTF 20 µg、40 µg、80 µg、120 µg、160 µg的系列标准溶液，以乙酸乙酯作参比，在485 nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。

（2）称取根尖样品0.5 g，放入小烧杯中，加入0.4％TTC溶液和磷酸缓冲液（pH7.0）各5 mL，使根充分浸没在溶液内，在37℃下暗保温1～2 h，此后立即加入1 mol/L硫酸2 mL，以停止反应。

（与此同时做一空白实验，先加硫酸，再加根样品，37℃下暗保温后不加硫酸，其溶液浓度、操作步骤同上）。

（3）把根取出，用滤纸吸干水分，放入研钵中，加乙酸乙酯3～4 mL，充分研磨，以提出TTF。

把红色提取液移入刻度试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤2～3次，皆移入刻度试管，最后加乙酸乙酯使总量为10 mL，用分光光度计在波长485 nm下比色，以空白试验作参比测出吸光度，查标准曲线，即可求出TTC还原量。

四、结果计算
根系活力= C/(1000*W*h) [mg TTF/（g•h）]
式中：C——四氮唑还原量，μg。

W——根重，g。

h——时间，h。