Annexin V---PI双染方法
AnnexinV-PI双染方法
Annexin V是一种检测细胞凋亡的试剂，在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡早期，膜磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。
Annexin V作为一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，它通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。
因此Annexin V是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。
细胞凋亡是细胞的基本特征之一，它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面起着十分重要的作用。
在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。
AnnexinⅤ是一种分子量为35-36kD的Ca依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的PS高亲和力特异性结合。
用标记了FITC的AnnexinⅤ作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生，正常细胞和早期凋亡细胞的细胞膜是完整的。
Propidium iodide（PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜与细胞核结合呈现红色。
将AnnexinⅤ与PI匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。
离心收集悬浮细胞，微量离心机转速2000RPM，离心时间5min，弃培养基；用冷PBS洗涤细胞两次；用400ul 1X Binding Buffer悬浮细胞，浓度大约为1 X 10 cells/ml；在细胞悬浮液中加入5ul Annexin V-FITC，轻轻混匀后于2-8°C避光条件下孵育15分钟。
5. 加入10ul PI后轻轻混匀于2-8°C避光条件下孵育5分钟；在1小时内用流式细胞仪或荧光显微镜检测。
使用流式细胞仪正确分析Annexin V-FITC/PI双染的细胞前要求仪器的荧光补偿来去除两种染料激发光之间的叠加。
因为荧光补偿设置与PMT的电压直接相关，所以不同仪器之间的补偿不同。
FITC-AnnexinVPI双染色法检测凋亡细胞
FITC-AnnexinV/PI双染色法检测凋亡细胞一、实验目的a)了解凋亡细胞的变化及检测方法。
b)了解FITC-AnnexinV/PI双染色法检测凋亡细胞的原理及方法。
二、实验原理a)细胞凋亡是细胞内由多个基因控制的死亡程序被活化而导致的细胞自杀（cell suicide）。
膜磷脂酰丝氨酸原来位于细胞膜的内部。
在细胞凋亡早期，细胞膜上的膜磷脂酰丝氨酸外翻与AnnexinV结合，使其被染成绿色。
在细胞凋亡晚期，细胞膜破裂，使得PI进入细胞当中与DNA结合，使其被染成红色。
b)细胞坏死（cell necrosis）：是由外部化学、物理或生物因素的侵袭而造成的细胞崩溃裂解，也被描述为细胞谋杀（cell murder）。
c)喜树碱（camp tothecin，CPT）是一种植物来源的抗肿瘤药物，可诱导肿瘤细胞凋亡。
d)Annexin V是一种可与磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）特异结合但不能通过正常细胞膜的物质。
碘化丙啶（propidium iodide，PI）是一种发出红色荧光的DNA结合染料，也不能透过活细胞完整细胞膜。
e)细胞凋亡早期，细胞膜PS由膜脂双层内侧转位至外侧，FITC标记的AnnexinV（AnnexinV-FITC）即可与其结合，使细胞膜处呈绿色。
细胞凋亡中晚期，膜通透性变大，PI可进入细胞与核内DNA结合。
f)激光共聚焦显微镜（LSCM）以单色激光作为光源，并用附设光源针孔(pinhole)使光源成为点光源.除此之外，在检测器前方也有一个检测针孔，点光源对标本内焦平面上的每一检测针孔后的光电点扫描，标本上的被照射点在检测针孔成像，由倍增管或冷电耦合器件逐点或逐线接受，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像，光源针孔与检测针孔的位置相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于光源针孔和检测针孔，焦平面以外的点不会在检测针孔成像，这就是所谓的“共聚焦”，这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面，克服了普通显微镜图像模糊的缺点。
流式细胞仪检测细胞凋亡Annexin VPI双染色法
流式细胞仪检测细胞凋亡——Annexin V/PI双染色法
实验步骤
1. 细胞收集：悬浮细胞直接收集到10ml的离心管中，每样本细胞数为（1~5）×106，/mL 500~1000r/min离心5min，弃去培养液。
2. 用孵育缓冲液洗涤1次，500~1000r/min离心5min。
3. 用100ul的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10~15min。
4. 500~1000r/min离心5min沉淀细胞孵育缓冲液洗1次。
5. 加入荧光（SA-FLOUS）溶液4℃下孵育20min，避光并不时振动。
6. 流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515nm 的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560nm的滤器检测PI。
7. 结果判断：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。
细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。
因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。
正常活细胞与此相似。
在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）。
热点实验：Annexin V凋亡流式双染与Tunel凋亡免疫组化案例介绍
原位末端凋亡法（Tunel）实验服务TUNEL实验技术简介：TUNE技术，即脱氧核苷酸末端转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT )介导的2dUTP 缺口末端标记(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL ) 技术是目前原位检测细胞凋亡最敏感、快速、特异的新方法，已广泛用于生物、医学研究领域。
TdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL)是一种用来检测细胞凋亡(apoptosis)的分析方法。
细胞凋亡有一项重要的特征为细胞内的DNA会碎裂成片段(DNA fragmentation)，TUNEL可以有效的去探测DNA片段的产生，所以可以传达细胞凋亡的讯息。
TdT为terminal deoxynucleotidyl transferase，此种酵素可以在没有DNA模板的情形下，连结核甘酸到DNA的3'-OH处。
1992年，以色列科学家Gavrieli等人将TdT引为为标定DNA片段的一个酵素，自此衍生出TUNEL此项技术。
TUNEL的好处是可以在细胞凋亡发生的早期，即可侦测到DNA片段的产生，并且可以直接使用在组织切片上，观察细胞凋亡发生的位置。
所以TUNEL目前为广泛接受与使用的一种细胞凋亡的分析方法。
实验服务注意事项1. 实验委托者提供实验分组情况及实验背景资料，有具体要求请事先说明；2. 实验委托者可提供组织块（以中性福尔马林或多聚甲醛固定，如组织块极小请事先说明）、蜡块或切片（使用免疫组化专用切片，以避免实验过程中掉片）；3. TUNEL染色完毕后，照相1-2张/每切片，如需要图片分析请事先说明；4. TUNEL试剂盒的购买：事先咨询嘉美生物，明确是否有该抗体可使用，如无则由双方协商公司代购。
标本收集、保存、运输1. 组织标本：事先应以10%的福尔马林或4%的多聚甲醛固定（后者同时适合免疫荧光检测）；2. 细胞检测：由实验室负责准备检测样本，实验委托者提供细胞或实验室负责提供细胞；3. 样本运输：样本密封完毕，建议以塑料瓶装好标本寄送以免路途损坏；如寄送切片则选择纸盒包装完好，周围加以泡沫或纸巾填塞以免路途损坏，常温寄送即可。
AnnexinV-PI 步骤
1.细胞处理，注意设置阴性对照。
2.准备1x Annexin-binding buffer(Component C)，5ml5X Annexin-binding buffer+20ml去离子水.3.准备100ug/ml的PI工作液。
（初始保存液(Component B) 浓度为1mg/ml，用1X Annexin-binding buffer 稀释10倍。
5ul(Component B) +45ul 1x Annexin-binding buffer）,将没用完的储存起来。
下次使用。
4.用预冷的PBS洗两次细胞，然后用500ul pbs将细胞吹下来，然后4°离心，1500r,7min,弃上清，然后用100ul 1xbuffer重悬，每管加入5ulannexinV和1ul PI工作液。
5.室温孵育15min.搜集细胞。
上流式1.细胞处理，注意设置阴性对照。
2.准备1x Annexin-binding buffer(Component C)，1ml5X Annexin-binding buffer+4ml去离子水.3.准备100ug/ml的PI工作液。
（初始保存液(Component B) 浓度为1mg/ml，用1X Annexin-binding buffer 稀释10倍。
5ul(Component B) +45ul 1x Annexin-binding buffer）,将没用完的储存起来。
下次使用。
4.配制染液（每孔100ul 1X buffer+5ul AnnexinV+1ul 1X PI）5.用预冷的PBS洗两次细胞，然后每孔加100ul上述染液。
6.室温孵育15min.7.每孔补加400ul1XAnnexin-binding buffer。
吹下来。
上流式。
AnnexinV-FITCPI双染法流式细胞术检测细胞凋亡
AnnexinV-FITCPI双染法流式细胞术检测细胞凋亡看到来我们眼科公共平台来使用Fortessa检测凋亡时，看到很多人都是泪流满面，鉴于此，作者大找网络资源结合自己的理解，针对普遍的问题给眼科的童鞋们一个交代，期待对大家有用，期待大家板砖！！Reference1. Galluzzi L, Aaronson SA, Abrams J, et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death Differ 2009; 16:1093-107.一、原理在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。
Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。
因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。
将Annexin V进行荧光素（FITC）标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞早期凋亡的发生。
碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。
因此将Annexin V与PI（7-AAD也可以）匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。
二、注意事项1．Annexin V-EGFP，Propidium Iodide （PI）避光保存及使用。
2． Propidium Iodide （PI）有毒，操作时要戴手套。
3．推荐使用悬浮培养细胞，如果是贴壁细胞，用胰酶消化不当，会引起假阳性，而用细胞刮子会造成细胞粘连成团，而影响检测。
ANNEXIN V-FITC PI 凋亡检测试剂盒说明书
第1页，共3页ANNEXIN V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒说明书注意：本产品试剂浓度发生变化，使用前请仔细阅读说明书。
货号：CA1020规格：20T/50T /100T保存：2-8°C ，避光保存，有效期1年。
产品说明：细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS 暴露在细胞膜外表面。
PS 是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS 暴露在细胞膜外。
Annexin V 具有易于结合到磷脂类如PS 的特性，对PS 有高度的亲和性。
因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS 。
PS 转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。
两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。
因此，可以采用Annexin V 与PI 双染的方法，通过流式检测细胞早期凋亡。
操作步骤:1.细胞样品的准备：a)对于贴壁细胞：小心收集细胞培养液到一离心管内备用。
用不含EDTA 的胰酶消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。
再次收集到离心管内。
1000rpm 左右离心5min ，沉淀细胞。
对于特定的细胞，如果细胞无法完全离心至离心管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。
小心吸除上清，可以残留约50µl 左右的培养液，以避免吸走细胞。
加入约1ml 4℃预冷的PBS ，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。
b)对于悬浮细胞：1000rpm 左右离心5min ，沉淀细胞。
对于特定的细胞，如果细胞无法完全离心至离心管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。
小心吸除上清，可以残留约50µl 左右的培养液，以避免吸走细胞。
AnnexinV-FITCPI双染法细胞凋亡检测试剂盒操作说明
AnnexinV-FITCPI双染法细胞凋亡检测试剂盒操作说明细胞凋亡是细胞的基本特征之一,它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面起着十分重要的作用。
在细胞凋亡过程中,细胞内膜的磷酯酰丝氨酸外翻到细胞外膜,而Annexin V(膜联蛋白V)对其有天然的高亲和能力,故可以用FITC标记(绿色荧光)的Annexin V来检测细胞凋亡,但本方法的缺点是不能区分早期和晚期的凋亡细胞。
早期和晚期的凋亡细胞的一个重要区别在于细胞膜的完整性(凋亡早期细胞没有丧失膜的完整性),故可以用碘化丙啶(PropidiumIodide,PI)来染色加以区分。
图源：网络Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒特点：1. 即开即用,不需要专门花时间准备各种成分。
2. 整合了Annexin V-FITC和PI检测法的优点,提高了凋亡细胞检测的灵敏度和特异性,本方法是目前极为灵敏的细胞凋亡检测方法。
3. 跟流式细胞仪、荧光显微镜或其它荧光检测兼容。
Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒操作步骤：(一)获得目的基因1、通过PCR方法:以含目的基因的克隆质粒为模板,按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点),PCR循环获得所需基因片段。
2、通过RT-PCR方法:用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA,以mRNA为模板,逆转录形成cDNA第一链,以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
(二)构建重组表达载体1、Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒载体酶切:将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切,酶切产物行琼脂糖电泳后,用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
2、PCR产物双酶切后回收,在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
(三) 获得含重组表达质粒的表达菌种1、将连接产物转化大肠杆菌DH5α,根据重组载体的标志(抗Amp 或蓝白斑)作筛选,挑取单斑,碱裂解法小量抽提质粒,双酶切初步鉴定。
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Annexin V是一种检测细胞凋亡的试剂，在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡早期，膜磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。
Annexin V作为一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，它通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。
因此Annexin V是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。
细胞凋亡是细胞的基本特征之一，它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面起着十分重要的作用。
在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。
AnnexinⅤ是一种分子量为35-36kD的Ca依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的PS高亲和力特异性结合。
用标记了FITC的AnnexinⅤ作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生，正常细胞和早期凋亡细胞的细胞膜是完整的。
Propidium iodide（PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜与细胞核结合呈现红色。
将AnnexinⅤ与PI匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。
离心收集悬浮细胞，微量离心机转速2000RPM，离心时间5min，弃培养基；
用冷PBS洗涤细胞两次；
用400ul 1X Binding Buffer悬浮细胞，浓度大约为1 X 10 cells/ml；
在细胞悬浮液中加入5ul Annexin V-FITC，轻轻混匀后于2-8°C避光条件下孵育15分钟。
5. 加入10ul PI后轻轻混匀于2-8°C避光条件下孵育5分钟；
在1小时内用流式细胞仪或荧光显微镜检测。
使用流式细胞仪正确分析Annexin V-FITC/PI双染的细胞前要求仪器的荧光补偿来去除两种染料激发光之间的叠加。
因为荧光补偿设置与PMT的电压直接相关，所以不同仪器之间的补偿不同。
建议在实验开始阶段分析经Annexin V、PI分别单染的细胞来调整荧光补偿去除光谱重叠。
根据未处理细胞空白对照和经Annexin V、PI分别细胞染色后的单染对照的分析设定十字门的位置。
1.上样未经染色的细胞，在线性FS-SS点图上显示细胞并设门圈出目标细胞群体。
2.建立LogFL1-LogFL2（最好用FL3）双参数点图并分析以上光散射图中设门的细胞；保证>98%的细胞处于在X、Y轴Log 1为边界的左下象限中心区域。
3.检测annexin V-FITC单染的细胞并检查FL1-FL2（或FL3）散点图，保证在左上和右上象限内没有颗粒。
如果有颗粒出现在上端象限则说明有荧光渗漏；此时FL1的荧光被FL2 （或FL3）PMT检测到了。
为了纠正这种现象，增加FL1漏到FL2（或FL3）荧光的补偿%（这可能在1-5%之间）。
如果这个调节没有有效地去除FL2的阳性信号，此时要降低FL2（或FL3）PMT的电压。
4.检测PI单染的细胞并检查FL1-FL2（或FL3）散点图，保证在右上和右下象限内没有颗粒。
如果有颗粒出现在右侧象限则说明有荧光渗漏；此时PI的荧光被FL1 PMT检测到了。
为了纠正这种现象，增加FL2（或FL3）漏到FL1荧光的补偿%（这可能在15-25%之间）。
如果这个调节没有有效地去除FL1的阳性信号，此时要降低FL1 PMT的电压。
注：如果在以上调节补偿过程中更改了PMT的电压，建议重复3、4步骤，确保不引起过度荧光补偿。
过度补偿可以从阳性细胞十分贴近从标这一现象观察出来。
一个恰当的补偿应该是单阳性细胞荧光强度与落在左下Log 1为边界象限中间阴性细胞的荧光强度一致。
5.设定十字门的位置，FL1和FL2（或FL3）的划定方法如下：
5.1设定FL1标尺位置: 处于左下象限内的大群细胞是Annexin V染色阴性的细胞（一般这些细胞会在FL1轴方向上升至2个对数坐标值）。
将垂直的FL1标尺设定在紧靠Annexin V阴性群体右侧0.1-0.2Log单位的地方。
5.2 设定FL2 （或FL3）标尺位置: 可以通过一定数据的双阳性细胞来区分PI+和PI-的细胞群体。
在此条件下可能会识别出两群细胞，一是位于散点图的右下方（ANN+/PI-）还有就是右上方（ANN+/PI+）。
水平线可以置于这两群细胞的中间。
如果在分析的细胞群体中没有PI+细胞，区分PI+细胞最好是参照双阴性细胞群体，将水平线设在双阴性细胞以上0.1-0.3 Log单位的地方。
注：在阴性群体门以外的细胞可被识为Annexin V或Annexin V和PI阳性的细胞。
荧光显微镜观察：
滴一滴用Annexin V-FITC/PI双染的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞。
注：对于贴壁细胞，可直接用盖玻片培养细胞并诱导细胞凋亡。
在荧光显微镜下用双色滤光片观察。
Annexin V-FITC荧光信号呈绿色，PI 荧光信号呈红色。