化学遗传学方法

细胞外形上的变化
inhibitors of SARS冠状病毒-CoV
第三节 化学遗传学方法
二十年前，编码蛋白的发现引起了细胞周期调节领域 的一场革命。它们作为重要的信号传导组分的确认加 速了在这个领域的研究，为进一步生物化学研究提供 了必要的起点。在近些年，生物活性的小分子化合物 已经在细胞生物学中起到类似的作用，化学生物学这 一新领域把那些致力于了解和模拟自然世界的化学家 和生物学家带到一起。 1994，哈佛大学的Tim Mitchison[1]教授在首期的 “Chemistv &Bio1ogy"《化学和生物学》上阐述了化 学遗传学(chemical genetics)的基本概念。他指出要 探索生命过程必须有干扰生命过程的手段，然后才能 了解其后果。随后，哈佛大学stuart L.Schreiber教 授和Tim Mitchison教授开始利用小分子来系统地探索 细胞和蛋白质的生理功能。
荧光酶标仪是用来进行荧光的检测，通过激发 光栅分光后的特定波长的光照射到被荧光物质 标定的样品上后，会发出波长更长的发射光， 通过发射光栅后到达检测器。荧光的强度与样 品的浓度呈一定的比例。荧光检测灵敏度高， 可实时检测，使用方便，检测模式多样，但是 容易受外界干扰，激发光与发射光容易互相影 响，干扰检测。 化学发光是来自生物化学反应中的自发光，可 分为辉光型和闪光型两种类型。辉光型发光持 久，稳定，能持续一段时间；闪光型发光时间 短，变化快，稳定性不强，需要应用自动加样 器才可以进行。化学发光中发出的光子数与样 品量呈一定比例关系，化学发光酶标仪灵敏度 非常高，动力学范围广。
2，多功能酶标仪
多功能酶标仪又称多功能微孔板检测仪，可对 以微孔板为体系的实验提供多种不同模式的检 测。通常，多功能酶标仪至少可提供“吸收 光”、“荧光”、“发光”三种不同的检测模 式。一些中高端多功能酶标仪还可完成“时间 分辨荧光”、“荧光偏振”、“荧光共振能量 转移”等高级荧光检测实验。
多功能酶标仪工作站 Flexstation® 3具有双 光栅提供1nm步径全波长 检测，可对6-384孔微孔 板进行光吸收(紫外-可 见)(200-1000nm)、荧光 强度(250-850nm)、化学 发光(250-850nm)、荧光 偏振(400-750nm)和时间 分辨荧光(250-850nm)五 大功能的检测。
一、化学遗传学的基本方法
根据人类基因组的草图，基因的表达产物-蛋白质的数 量在100，000到数百万个，其中大部分属于目前还不清 楚的未知蛋白质，而化学遗传学通过使用小分子作为探 针研究细胞内或完整组织中蛋白质的功能，通过这些分 子探针作用模型的生物化学解释，有助得到关于复杂细 胞过程中蛋白质功能的新信息。 化学遗传学的第一个关键环节是合成可供筛选的小分子 库，第二个关键环节是发展准确、高速和低成本的化学 库筛选方法，获得尽可能多的机理和特异性信息，第三 个关键环节是确证筛选得到的化合物结构，并确认蛋白 标靶以及优化化合物的蛋白亲和性。
化学遗传学采用小分子活性化合物作为探针，以多种方 式影响靶蛋白的功能，探索和控制细胞过程。从另一方 面来说，化学遗传学研究所获得的成果-小分子化合物 及其生物学效应，除了被用来揭示生命的基本活动规律 外，还可能成为候选药物。 也就是说化学遗传学的研究活动不是单纯的基础研究， 而与应用紧密相联。所以很多大型制药公司都非常关注 化学遗传学。 例如，哈佛大学在成立一个以从事化学遗传学为核心的 “化学与细胞生物学研究所”时，著名的默克制药公司 （Merck）就成为了该所的主要赞助者之一。可以说， 化学遗传学的出现把传统的学术研究实验室引进了药物 开发的战场。
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高通量筛选技术
高通量药物筛选技术是将多种技术方法有机结合而形 成的新的技术体系，它以分子水平和细胞水平的实验 方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动 化操作系统执行实验过程，以灵敏快速的检测仪器采 集实验数据，以计算机对实验获得的数据进行分析处 理，在同一时间内对数以千、万计的样品进行检测， 并以相应的数据库支持整个技术体系的正常运转。 分子水平和细胞水平的实验方法(或称筛选模型)是实 现高通量药物筛选的技术基础。由于高通量药物筛选 要求同时处理大量样品，实验体系必须微量化。这些 微量化的实验方法有些是应用传统的实验方法加以改 进建立的，更多的是根据新的科学研究成果建立的。
目前，用于高通量药物筛选的仪器种类很多，其最大 的特点是可以对各种不同规格微板中的样品直接进行 测定，如同位素放射活性的测定、化学发光测定、生 物发光测定、可见光比色、紫外光比色、荧光测定以 及电化学测定等等。 实验数据的分析处理系统是高通量筛选的必备条件。 由于高通量药物筛选可以在短时间内产生大量数据， 对这些数据的采集、储存、分析、处理，必须依靠计 算机完成。一般条件下，目前高通量药物筛选使用的 检测仪器，基本上都实现了数据采集的自动化，结果 检测完毕，试验结果就自动储存在计算机中。
①细胞表型筛选
具有一定遗传型的生物个体，在特定的外界环境中，通过 生长和发育所表现出的种种形态和生理特征的总和，是生 物体的可见特征或特性，即为其表型（phenotype）。相 同遗传型的生物，在不同的外界条件下，会呈现不同的表 型，但这不是真正的变异，因为在这种个体中，其遗传物 质结构并未发生变化。 显微镜检测技术可以检测细胞表型的变化，例如细胞形变、 增生、凋亡以及纺锤体形态。该模型是观察被筛样品对细 胞的作用，但不能反映药物作用的具体途径和靶标，只能 反映出药物对细胞生长等过程的综合作用，着眼于细胞整 体的某些功能，所以这种检测方法主要适合于初步筛选。
洗板：用适当的溶液清 洗试验用的微板，或洗 除不需要的反应液； 温孵：让反应体系在一 定的温度条件下保持一 定的时间，使之完成反 应过程，自动化工作站 可以严格控制温孵的温 度和时间； 检测：试验室自动化工 作站一般都可以与某一 种或多种检测仪器连接， 在试验操作完成后，可 以自动进行必要的检测 并自动采集储存数据， 完成整个试验过程。
高通量药物筛选的检测系统快速、高灵敏度的 检测技术是高通量药物筛选的关键技术之一。 在高通量药物筛选中，检测系统一般采用液闪 计数器、化学发光检测计数器、宽谱带分光光 度仪、荧光光度仪等。检测仪器灵敏度的不断 提高，即使对微量样品的检测，也可以得到很 好的检测效果。 常用的高通量药物筛选模型可以根据其生物学 特点分为以下几类：①受体结合分析法。②酶 活性测定法。③细胞因子测定法。④细胞活性 测定法。⑤代谢物质测定法。⑥基因产物测定 法等等。
在“化学遗传学”出现的同时，又出现了“化学基因组 学”的概念。两者的研究思路、内容基本相同，只不过 化学基因组学在化学遗传学及化学蛋白质组学的基础上 又向前一步，研究与人类疾病密切相关基因的生物功能。 考虑到本书中很少涉及到基因组学内容，因此，主要介 绍化学遗传学方法。 化学遗传学与传统的遗传学在思路上有相通之处，它还 可以分为正向化学遗传(forward chemical genetics)和 反向化学遗传(reverse chemical genetics)。 前者用动物细胞、微生物以及它们的裂解产物来寻找对 生物过程产生影响的小分子，并确定相应的蛋白靶；后 者则是先高表达某种蛋白，寻找与蛋白结合或影响纯蛋 白的功能的小分子，再对找到的小分子在体内进行对此 蛋白的功能影响实验。
3，高通量自动筛选系统
高通量药物筛选应用的实验方法总体积一般要求在2～ 250l，自动化操作系统主要是指实验室自动化工作站，俗 称药物筛选机器人，是由计算机控制的全自动实验室操作 设备。 试验室自动化工作站的基本功能是可以自动连续地完成试 验的基本操作，如 加样：即向每个反应单位(微板中的每一个孔)中加入各种 不同成分、不同浓度、不同容积的溶液； 稀释：实际上就是加入一定容积的样品或试剂溶液后，再 加入一定的溶媒； 转移：主要是完成某一试剂或样品的位置变化； 混合：将加入的不同溶液进行混合，混合的方式有震荡， 也可以用加样器反复吹吸混合；
（1）体外生化筛选模型
体外生化筛选模型主要是用来研究与生物体内重要生 理过程相关的酶与底物、受体与拮抗剂或激动剂、蛋 白质与蛋白质之间的相互作用（见第二节 相互作用与 分子识别），可以在体外通过蛋白结合能力或酶催化 活性检测的方式完成，主要采用光学如发光、光吸收 或荧光测定的方法。这些靶点往往和某个疾病过程相 关。 这是HTS中使用最多的模型。根据生物分子的类型，分 子水平的药物筛选模型主要分为受体、酶、通道、基 因和其他类型的模型，其特点是药物作用靶标明确， 应用这些模型可以直接得到药物作用机理的信息。
1、酶标仪
酶标仪是一种用途广泛的生 物检验医疗设备，利用酶联 免疫分析法，根据酶标记原 理，根据呈色物的有、无和 呈色深浅进行定性或定量分 析。 这是一种极具生命力的免疫 学技术。可用于单克隆抗体 筛分、凝血分、抗生素灵敏 度检验，以及其它需要进行 比色的分析工作中。
按照功能的划分，酶标仪可以分为光吸收酶标 仪，荧光酶标仪，化学发光酶标仪和多功能的 酶标仪。光吸收酶标仪是用来进行可见光与紫 外光吸光度的检测。 特定波长的光通过微孔板中的样品后，光能量 被吸收，而被吸收的光能量与样品的浓度呈一 定的比例关系，由此可以用来定性和定量的检 测。 光吸收的检测技术成熟，成本低，操作简单， 但是动态范围窄，灵敏度比较低，特异性不强。 一般可见光和紫外光分别采用钨灯及氘灯作为 光源，而紫外/可见酶标仪是可以将两种光源 进行切换，适应不同测量波长的需求。
1，小分子化合物库的构建-高 通量合成和制备
过去，生物活性小分子主要是从生物有机 体中发现的，但是，很可能它被认定的活 性是由于机体内许多化合物的协同作用造 成的，而不仅仅取决于这一小分子。为了 克服这一困难，需要构建包含大量具有确 定结构的小分子化合物库。
2，生物活性的检测-高通量筛选
在过去，从万个化合物中筛选具有生物活性的小分子 化合物是比较烦琐和困难的，高通量筛选是指运用自 动化的筛选系统在相对短时间内，通过特定的生物模 型来对成千上万化合物进行活性筛选。现在人们可以 尽可能采用自动的方式利用96、384或1536孔板进行生 物活性分子的筛选（图a）。 在设计化学遗传学适合的筛选方法过程中，首先要确 定是采用哪种化学遗传学方法，即正向还是反向化学 遗传学方法，以便选择“纯蛋白”、“细胞”或“胚 胎”检测方式(图b)。筛选过程首先是确定生物活性靶 点以及检测活性的方法，然后再设计相应的用于高通 量筛选的平台。为了确保高通量筛选结果的有效性， 所用的检测方法必须灵敏，而且重复性好。